CN115074254A

CN115074254A - 一株生防深绿木霉及其在农业领域的应用

Info

Publication number: CN115074254A
Application number: CN202210718675.4A
Authority: CN
Inventors: 赵磊; 程庭峰; 葛同玲
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-06-23
Also published as: CN115074254B

Abstract

本发明公开了生防深绿木霉2021TIBF620，其分类命名：Trichoderma atroviride，被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022308，保藏时间为：2022年03月24日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。本发明还公开了生防深绿木霉2021TIBF620于农业领域中的应用。本发明的生防深绿木霉2021TIBF620是一种具有广谱抗性的生防木霉，在农业病害防治中具有良好的应用前景。

Description

一株生防深绿木霉及其在农业领域的应用

技术领域

本发明属于农业微生物农药技术领域，主要涉及一株生防深绿木霉及其在农业领域的应用。

背景技术

植物病害是植物受到病原生物或环境因素的连续刺激导致寄主细胞和组织的正常机能紊乱，在形态、生理、生长和整体性上发生不正常变化，是导致农业生产损失的重要因素之一。化学防治一直是病害防治的重要途经，但大量化学品的使用，给环境和食品安全带来一系列问题，而微生物作为绿色防控的有效手段，其在我国农业中的重要作用日益凸显。

大量研究表明，微生物及其制剂对植物具有防病促生作用，其中木霉（Trichoderma）是一类分布广泛的土壤习居菌，自1932年Weindling首次发现木霉菌对一些土传真菌具有拮抗作用以来，其在农业领域获得了广泛应用，在中国已经有500余种木霉生防制剂或菌肥产品登记，在农业生产中发挥着重要作用。木霉对多种植物病害具有良好的生防潜力，其生防机制主要包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性及协同拮抗作用。因此，在当前提倡绿色生态健康发展背景下，木霉作为化学杀菌剂的有效替代品具备大规模应用的潜力。当前对木霉病害防控研究主要集中于哈茨木霉，且主要集中于病原真菌，针对病原细菌抗性的木霉研究较少，尚无针对病原细菌的深绿木霉报道。

介于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明从药用植物麻花艽根内筛选获得生防深绿木霉2021TIBF620。

本发明还有一个目的是提供生防深绿木霉的培养方法。

本发明再有一个目的是提供生防深绿木霉2021TIBF620于农业领域中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

生防深绿木霉2021TIBF620，其分类命名：Trichoderma atroviride，菌株深绿木霉Trichoderma atroviride 2021TIBF620被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022308，保藏时间为：2022年03月24日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

生防深绿木霉的培养方法，包括如下步骤：

将所述的生防深绿木霉2021TIBF620菌株接种于PDB培养基中进行培养，获取发酵液，作为生防菌剂。

优选的是，所述的生防深绿木霉的培养方法中，将所述生防深绿木霉2021TIBF620置于摇床中，在温度20~30℃和转速180 rpm条件下培养7~10天。

优选的是，所述的生防深绿木霉的培养方法中，培养前，首先将所述深绿木霉2021TIBF620接种于PDA培养基进行活化。

优选的是，所述的生防深绿木霉的培养方法中，所述发酵液中的产孢量达到10⁵cfu/mL时，可制成生防菌剂。

所述的生防深绿木霉2021TIBF620于农业领域中的应用。

优选的是，所述的应用中，所述应用为在生防菌剂制备中的应用。

优选的是，所述的应用中，所述应用包括抑制如下病原菌的生长：尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、野油菜黄单胞菌、青枯雷尔氏菌和茄病狄科氏菌。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明公开了一株生防深绿木霉及其在农业领域的应用。该深绿木霉的菌株编号为2021TIBF620，其在中国典型培养物保藏中心的登记入册编号为CCTCC No：M 2022308。深绿木霉2021TIBF620对作物上的病原真菌尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌和病原细菌野油菜黄单胞菌、青枯雷尔氏菌、茄病狄科氏菌均具有抑制作用，是一种具有广谱抗性的生防木霉，在农业病害防治中具有良好的应用前景。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明中的深绿木霉2021TIBF620形态特征图，其中左侧为菌落形态，右图为显微结构。

图2为本发明其中一个实施例中分别基于RPB2和TEF构建的系统发育树。

图3为本发明其中一个实施例中深绿木霉2021TIBF620对病原真菌的拮抗效果图。

图4为本发明其中一个实施例中深绿木霉2021TIBF620对病原细菌的拮抗效果图。

图5为本发明其中一个实施例中深绿木霉2021TIBF620挥发性物质对病原真菌的拮抗效果图。

图6为本发明其中一个实施例中深绿木霉2021TIBF620对灰葡萄孢菌侵染番茄叶片的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

表1病原菌及其来源

注：本申请后续实施例中采用的病原菌仅以病原菌分类号说明，未写菌株号。

1材料与方法

1.1供试菌株分离

样品来自青海省门源回族自治县采集的麻花艽根内。

采集健康的整株麻花艽后，用流水将根部泥土洗净。先用无菌水清洗3次，将其浸入75%乙醇 1 min，无菌水清洗3次，浸入2.5%次氯酸钠3 min，再次用无菌水清洗3-5次，最后用无菌滤纸将组织表面水分吸干。用灭菌后的剪刀将根分割成 0.5 cm×1 cm小块，然后用镊子将组织块移入加有抗生素（硫酸卡那霉素200 mg/L、利福平20 mg/L）的PDA平板中，每个平板上放置4块样品，同时将最后一遍清洗的无菌水滴加到PDA培养基上，作为空白对照。将培养皿置于28 ℃恒温培养箱培养，定期观察内生真菌菌落生长情况。待麻花艽根部边缘长出菌丝后，挑取其边缘部分菌丝后移至新的PDA培养基平板上纯化培养。内生真菌纯化后，拍照并观察记录菌株的大小、颜色等形态特征，挑取其菌丝，置于载玻片上，显微镜下观察孢子形态、产孢结构以及有无间隔，对照《真菌鉴定手册》进行鉴定。

该菌株形态特征如图所示（图1），菌丝呈白色棉絮状，中间无同心轮纹，分生孢子孢子堆呈绿色棉絮状。孢子呈卵圆形或椭圆形，壁光滑，具有强烈的椰子香味。随后，对该菌株进行分子生物学的鉴定，分别扩增其ITS、TEF和RPB2序列，ITS（碱基序列如SEQ ID NO:1所示）与ITS56数据集中给出的参考序列间的相似度>76%，表明该菌株属于木霉属。使用TEF（碱基序列如SEQ ID NO:2所示）和RPB2（碱基序列如SEQ ID NO:3所示）序列，同时从NCBI下载得到近缘种数据，利用MEGA7.0，采用NJ（neighbor-joining）分别构建系统发育树。系统发育结果见图2，确定该菌株属于深绿木霉Trichoderma atroviride。ArtificialSequence

表2 PCR扩增引物和测序引物

注：Y=C/T；W=A/T；M=A/C；R=A/G

深绿木霉2021TIBF620已于2022年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），分类命名：Trichoderma atroviride，保藏号为CCTCC No：M 2022308，保藏时间为：2022年03月24日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

表3 PCR反应体系和反应条件

1.2抑菌活性测定

1.2.1抑菌谱的测定

分别采用对峙培养法和抑菌圈法检测深绿木霉2021TIBF620拮抗病原真菌和病原细菌的生防效果。

对峙培养法（病原真菌）：从活化3天的菌落边缘打取菌饼（5 mm），将木霉菌菌饼和病原真菌菌饼分别接种在新的PDA平板两侧，两菌饼相距4 cm，以只接病原菌不接木霉菌为对照。每处理重复3次。所有处理在28℃恒温培养，七天后观察记录木霉菌和病原菌的菌落半径，计算拮抗系数。

拮抗系数=(对照病原菌菌落半径-对峙培养的病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径*100%

抑菌圈法（病原细菌）：将木霉菌饼接种到固体培养基（野油菜黄单胞菌、茄病狄科氏菌：LB培养基；青枯雷尔氏菌：SPA培养基）中央，28℃培养36 h后，向固体培养基喷洒病原菌悬液100 μl。再次将培养皿转移至28℃恒温培养箱，倒置24 h后，采用十字交叉法测量抑菌圈大小。每处理重复3次。

结果表明深绿木霉2021TIBF620能够抑制并覆盖尖孢镰孢菌（FusariμM oxyspoum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等植物病原真菌菌丝的生长。同时也能抑制病原细菌野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、茄病狄科氏菌（Dickeyasolani），表明该菌株对供试病原菌生长均具有抑制作用（如图3和图4所示）。

表4深绿木霉2021TIBF620的抑制效果

1.2.2挥发性物质对病原菌抑制

采用对扣法测定深绿木霉产生的挥发性物质对病原菌的抑菌率，从活化3天的菌落边缘打取菌饼（5mm），将木霉菌菌饼转接于90mm的PDA平板中间培养3天后，再和培养1天的病原真菌（尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌）PDA平板对扣起来，接有拮抗菌深绿木霉的一面朝上，病原真菌朝下，用封口膜密封。同时设置对照组，以只接病原真菌，不接拮抗菌作为对照。将上述平板放置于培养箱中，在28℃下培养。每个处理设3个重复。培养7d后采用十字交叉法测量测试病原菌菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率＝(对照病原菌菌落直径－处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径*100%

结果表明深绿木霉的挥发性物质对病原真菌具有良好的抑制效果，与对照相比，深绿木霉2021TIBF620显著降低了立枯丝核菌的生长，防效达到80.00%（图5）。

表5深绿木霉2021TIBF620挥发性物质的抑菌效果

1.2.3挥发性物质对灰霉病的防效

选用叶龄相同、叶片大小基本一致的健康番茄叶片（Micro Tom），用无菌水清洗干净备用。先在每个叶片中间接种1个直径为5 mm的灰霉病菌（灰葡萄孢菌）菌饼，将深绿木霉2021TIBF620菌饼接种到PDA培养基上，倒扣对峙（接有拮抗菌深绿木霉的一面朝下），以不接木霉菌饼为阴性对照。16h光照（25℃）/8h黑暗（18℃）保湿培养5天。每个处理含5个叶片。每个处理设3个重复。统计每个叶片发病面积，并按照下列公式计算。

病斑扩展面积（mm²）=病斑总面积-菌饼面积

对峙结果表明深绿木霉的挥发性物质对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）具有良好的抑制效果，与对照相比，深绿木霉2021TIBF620显著降低了灰葡萄孢菌的生长，防效达到94.73%（图6）。

表6深绿木霉2021TIBF620对灰葡萄孢菌侵染番茄叶片的抑制效果

处理	发病面积（mm<sup>2</sup>）	防效（%）
			对照	177.18±37.48	-
2021TIBF620	27.70±2.95	94.73±2.60

将深绿木霉2021TIBF620接种于PDA培养基进行活化，所述PDA培养基包括：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水补足至1000 mL，自然pH。打取活化后的菌饼5 mm接种于PDB培养基，进行培养，产孢量达到10⁵cfu/mL，得到深绿木霉的菌悬浮液，即可将其制成不同的生防菌剂，例如：液体制剂（液剂、乳剂或悬浮剂），固体制剂（粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或种子包衣剂）。所述PDB培养基包括：土豆200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水补足至1000 mL，自然pH，然后置于摇床180 rpm。上述培养条件为7~10天，温度为20~30℃。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株生防深绿木霉及其在农业领域的应用

<130> 2021

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 577

<212> DNA

<213> 深绿木霉

<400> 1

ctcgagctaa ctcccaaccc aatgtgaacc ataccaaact gttgcctcgg cggggtcacg 60

ccccgggtgc gtcgcagccc cggaaccagg cgcccgccgg agggaccaac caaactcttt 120

tctgtagtcc cctcgcggac gttatttctt acagctctga gcaaaaattc aaaatgaatc 180

aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 240

taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc 300

gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc aaccctcgaa cccctccggg 360

gggtcggcgt tggggacctc gggagcccct aagacgggat cccggccccg aaatacagtg 420

gcggtctcgc cgcagcctct cctgcgcagt agtttgcaca actcgcaccg ggagcgcggc 480

gcgtccacgt ccgtaaaaca cccaacttct gaaatgttga cctcggatca ggtaggaata 540

cccgctgaac ttaagcatat ctaaaagggg gaagaaa 577

<210> 2

<211> 921

<212> DNA

<213> 深绿木霉

<400> 2

ggaagaaggg ggggcagtca catcacgtcg tcgtcatcgt aagttgcaat cctcattccc 60

ctcgtcagcg gcattctctc tgccgttgac actgctgtgt atgacatttt gctgaccgtc 120

atcatctagg ggttcgtatt tctccatcag acagctttcg atcgactcca atactgactt 180

gctacaacag ccacgtcgac tccggcaagt ctaccaccgt gagtaactcc caattcctcg 240

agccctgctg ccatcgattg tatcggtcgg cgcggggtat catcatcatg aacgcatcca 300

gctgacattt cctcaataga ctggtcactt gatctaccag tgcggtggta ttgacaagcg 360

taccatcgag aagttcgaga aggtgagctc atttctgctt tttcactccg cttcctgagc 420

accagcgtgc ccgacaattc tgtcctcagt cttgtcattt ttccttcgca gcatcacacc 480

ccgctttcct gtctacccct cctttggcac agcaaaaatt ttctggctgc cttgcttgtc 540

ttttagtggg gtgccaactt tttgtttggc tgcaaccccg ctatcgccac tgtccctctg 600

tcccaacgaa ttgtactcgc tcaattgcat cgtcttctgc ctccatctct gtgtggttca 660

ttgtgctaat catgcttcaa tcaataggaa gccgccgagc tcggcaaggg ttctttcaag 720

tatgcgtggg ttcttgacaa gctcaaggcc gagcgtgagc gtggtatcac catcgacatt 780

gccctctgga agttcgagac tcccaagtac tatgtcaccg tcattggtat gttttcgctg 840

ttcctcattg acacttggag accatcattc taacgtgccg ctctacagac gctcccggtc 900

accgtgattt catcagaact g 921

<210> 3

<211> 1080

<212> DNA

<213> 深绿木霉

<400> 3

acaaaatctg gcgggtcact gctggtcaag ctgttccgtg gtatcatgcg cagaatgaat 60

acagagctgg ccaactacct cagacgatgt gttgagggta accgccactt caaccttgct 120

gttggcatta agcccggcac actttccaac ggactaaagt actcgctcgc cactggaaac 180

tggggtgacc agaagaaggc aatgagctcg accgcaggtg tctcacaggt gcttaaccgt 240

tacacttttg cttctacact ttcccatttg cgtcgtacca atacacccat cggaagagat 300

ggtaagctgg cgaagcctcg acagctccac aacacacact ggggtttggt gtgcccggct 360

gagacccctg aaggtcaagc gtgtggtctg gtcaagaatt tgtctctcat gtgctacgtc 420

agtgttggat ctccttctga gcctttgatc gagtttatga tcaacagagg tatggaagtc 480

gttgaggagt atgagccact gaggtatccc catgccacaa agatctttgt gaatggtgtc 540

tgggttggaa tccaccaaga ccccaagcat ctggtaaacc aagttttgga tactcgtcgc 600

aaatcctatc tgcagtacga ggtctctctg atcagagaaa ttcgagacca agaattcaaa 660

atcttctctg atgccggccg tgtcatgcgt cccgtcttca ctgtacagca ggaagatgac 720

ccggaaacgg gtatcaacaa gggccacctg gttttgacca aggacctcgt caatagactg 780

gccaaggagc aggctgagcc tccagaagac ccaagcatga agctcggatg ggaggggctg 840

attagggctg gtgcagtgga atatctcgac gccgaggaag aagaaacgtc catgatttgc 900

atgacaccgg aagatcttga gctctatcgt cttcaaaagg ccggcattgc cacggatgaa 960

gacattggag atgatccaaa taagcgtctc aagaccaaga caaatccgac aactcacatg 1020

gttacgcatt gcgagattca cccgaacatg atcttaagga tctgggctag aacatccttc 1080

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ITS5-ITS上游引物

<400> 4

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ITS4-ITS下游引物

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fRPB2-5f -RPB2上游引物

<400> 6

gaygaymgwg atcayttygg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fRPB2-7cr-RPB2下游引物

<400> 7

cccatrgctt gtyyrcccat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EF1-TEF上游引物

<400> 8

atgggtaagg argacaagac 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EF2-TEF下游引物

<400> 9

ggargtacca gtsatcatgt t 21

Claims

1.生防深绿木霉2021TIBF620，其分类命名：Trichoderma atroviride，菌株深绿木霉Trichoderma atroviride 2021TIBF620被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022308，保藏时间为：2022年03月24日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

2.生防深绿木霉的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将如权利要求1所述的生防深绿木霉2021TIBF620菌株接种于PDB培养基中进行培养，获取发酵液，作为生防菌剂。

3.如权利要求2所述的生防深绿木霉的培养方法，其特征在于，将所述生防深绿木霉2021TIBF620置于摇床中，在温度20~30℃和转速180 rpm条件下培养7~10天。

4.如权利要求2所述的生防深绿木霉的培养方法，其特征在于，培养前，首先将所述深绿木霉2021TIBF620接种于PDA培养基进行活化。

5.如权利要求2所述的生防深绿木霉的培养方法，其特征在于，所述发酵液中的产孢量达到10⁵cfu/mL时，可制成生防菌剂。

6.如权利要求1所述的生防深绿木霉2021TIBF620于农业领域中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为在生防菌剂制备中的应用。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括抑制如下病原菌的生长：尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、野油菜黄单胞菌、青枯雷尔氏菌和茄病狄科氏菌。