CN115073766B - 固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用

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Abstract

本发明涉及生物分析技术领域，公开了固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用，特别涉及固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用、生物组织衍生化方法、生物组织代谢物的表征方法。本发明提供的固态衍生化水凝胶，包括水凝胶、衍生化试剂和水；所述衍生化试剂分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面；所述水凝胶的质量占水凝胶、衍生化试剂和水总质量的百分数为5～45％；所述衍生化试剂在水凝胶、衍生化试剂和水形成的混合溶液中的质量浓度为0.1～200mg/mL；本发明提供的固态衍生化水凝胶对生物组织进行衍生化，衍生化效率高，能够显著提高生物组织中内源性代谢物的检测灵敏度，有效实现生物组织中低丰度、难电离的代谢物的质谱成像分析及原位表征。

Description

固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，特别涉及固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用、生物组织衍生化方法、生物组织代谢物的表征方法。
背景技术
组织衍生化是在生物组织切片上利用具有高质谱响应官能团的衍生化试剂对包含反应官能团的代谢物进行化学衍生化，通过质谱成像技术测定和可视化衍生化之后高响应的衍生化物离子，从而实现生物组织中低丰度、难电离代谢物的原位表征。
质谱成像技术通常采用探针对生物组织或其他样本中所含的多种分子按空间位置逐点进行扫描检测，获得其离子强度与位置关系的多维数据阵，然后通过数据处理软件对不同质荷比(m/z)的离子按照其强度和空间位置进行重构和可视化，最终实现多种分子的同时成像分析。
目前现有的组织衍生化方法，大多是用于基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI)的喷涂法，该方法依赖于精密的喷涂装置，容易造成衍生化试剂的过载。此外，将衍生化试剂添加到喷雾溶剂中的在线衍生化方法衍生化效率低，只能够针对极少数个别代谢物进行衍生化，难以实现生物组织中具有不同官能团的多种类代谢物的衍生化分析。
然而，在生物组织中存在大量低丰度、弱离子化的代谢物，如神经递质、甾体激素、脂肪酸、脂肪醛等，其质谱检测灵敏度低，在进行质谱成像分析时易受背景离子的干扰。但这些代谢物具有重要的生物功能，参与多种疾病的发生、发展，是极具临床应用潜力的生物标志物，了解其在生物组织样本中的空间分布和相对含量，对解析其生理病理作用机制有着重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供固态衍生化水凝胶及其制备方法和应用，本发明提供的固态衍生化水凝胶对生物组织进行衍生化，衍生化效率高，能够显著提高生物组织中内源性代谢物的检测灵敏度，有效实现生物组织中低丰度、难电离的代谢物的质谱成像分析及原位表征。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了一种固态衍生化水凝胶，包括水凝胶、衍生化试剂和水；所述衍生化试剂分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面；
所述水凝胶的质量占水凝胶、衍生化试剂和水总质量的百分数为5～45％；
所述衍生化试剂在水凝胶、衍生化试剂和水形成的混合溶液中的质量浓度为0.1～200mg/mL。
如无特殊说明，在本发明中，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明提供的固态衍生化水凝胶，包括水凝胶、衍生化试剂和水；所述衍生化试剂均匀分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面；在本发明中，所述水凝胶优选包琼脂、琼脂糖或明胶中的一种或多种，更优选包括琼脂、琼脂糖或明胶，最优选包括琼脂或明胶；在本发明中，所述衍生化试剂优选包括吉拉德试剂P、丹磺酰氯、丹磺酰肼和苯甲酰氯中的一种或多种，更优选包括吉拉德试剂P、丹磺酰氯、丹磺酰肼或苯甲酰氯，在本发明中，当所述衍生化试剂优选包括上述具体物质的两种以上时，本发明对所述具体物质的质量配比没有特殊要求，采用任意配比即可。在本发明中，所述吉拉德试剂P优选为d0-吉拉德试剂P或d5-吉拉德试剂P，所述d0-吉拉德试剂P和d5-吉拉德试剂P互为同位素关系。
在本发明中，所述水凝胶的质量占水凝胶、衍生化试剂和水总质量的百分数为5～45％，优选为10～35％，更优选为12.5～30％；所述衍生化试剂在包含水凝胶、衍生化试剂和水的混合溶液中的质量浓度为0.1～200mg/mL，优选为10～150mg/mL，最优选为25～100mg/mL。
在本发明中，所述固态衍生化水凝胶还包括pH调节剂，所述pH调节剂的用量优选为调节所述固态衍生化水凝胶的pH值至衍生化试剂与生物组织切片中的代谢物进行衍生化反应所需的pH值，在本发明中，所述pH调节剂优选包括弱酸溶液或弱碱溶液，在本发明中，所述弱酸溶液优选包括甲酸溶液或醋酸溶液，所述弱碱溶液优选包括氨水，在本发明中，所述弱酸溶液的质量浓度优选为0.5～3％，更优选为1～2％；所述弱碱溶液的质量浓度优选为0.5～3％，更优选为1～2％。
本发明技术方案的第二方面是提供了本发明技术方案第一方面所述固态衍生化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将水凝胶、衍生化试剂和水混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液静置，得到固态衍生化水凝胶；
所述混合溶液中水凝胶的质量百分数为5～45％；
所述混合溶液中衍生化试剂的质量浓度为0.1～200mg/mL。
本发明提供了上述技术方案所述固态衍生化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将水凝胶、衍生化试剂和水混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液静置，得到固态衍生化水凝胶；
所述混合溶液中水凝胶的质量百分数为5～45％；
所述混合溶液中衍生化试剂的质量浓度为0.1～200mg/mL。
本发明将水凝胶、衍生化试剂和水混合，得到混合溶液。
本发明对所述水凝胶、衍生化试剂和水的混合顺序没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，所述混合优选为将所述水凝胶和水配成水凝胶溶液后，再与衍生化试剂混合；在本发明中，所述混合的温度优选为70℃；在本发明中，所述混合后优选添加pH调节剂，在本发明中，所述pH值调节剂的种类与范围与上文相同，在此不再赘述。
得到混合溶液后，本发明将所述混合溶液静置，得到固态衍生化水凝胶。
在本发明中，所述静置的温度优选为-20～4℃，更优选为-15～2℃；所述静置的时间优选4～10h，更优选为5～8h，最优选为6h；在本发明中，所述静置优选在赋形模具中进行，本发明对所述赋形模具的形状和结构没有特殊要求。本发明通过控制静置的温度为-20～4℃，使所述混合溶液更有效的凝固成具有一定弹性和机械强度的固态衍生化水凝胶。
本发明将水凝胶、衍生化试剂和水混合后静置，得到的固态衍生化水凝胶，所述衍生化试剂分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面，分散于固态衍生化水凝胶表面的衍生化试剂通过固态衍生化水凝胶的物理吸附作用在固态衍生化水凝胶表面形成含有衍生化试剂的水分子层，为衍生化反应提供良好的液态微环境。
本发明技术方案的第三方面是提供了技术方案第一方面所述固态衍生化水凝胶或上技术方案第二方面所述制备方法得到的固态衍生化水凝胶在制备衍生化生物组织中的应用。
本发明对所述固态衍生化水凝胶在生物组织衍生化中的应用没有特殊要求，将所述固态衍生化水凝胶和生物组织接触进行衍生化反应即可。
本发明技术方案的第四方面是提供了一种生物组织衍生化方法，包括以下步骤：
提供生物组织切片；
将固态衍生化水凝胶贴附于所述生物组织切片表面，进行衍生化反应，制备得到衍生化生物组织切片；
所述固态衍生化水凝胶为上述技术方案所述固态衍生化水凝胶或上述技术方案所述制备方法得到的固态衍生化水凝胶。
本发明提供生物组织切片。
在本发明中，所述生物组织切片优选包括心组织切片、肝组织切片、脾组织切片、肺组织切片、肾组织切片、脑组织切片、肌肉组织切片、生殖腺组织切片或肿瘤组织切片。
在本发明的实施例中，所述生物组织切片的制备方法优选包括以下步骤：
将生物组织依次进行解冻、包埋、切片和干燥，得到所述生物组织切片。
在本发明中，所述生物组织的温度优选为-80℃，所述解冻的温度优选为-20℃；在本发明中，所述包埋用包埋剂优选为莱卡冷冻切片包埋剂(Leica Cryo-Gel)，本发明对所述包埋的具体实施过程没有特殊要求。在本发明中，所述切片优选在切片机中进行，本发明对所述切片的具体实施过程没有特殊要求，在本发明中，所述生物组织切片的厚度优选为12μm。在本发明中，所述干燥的温度优选为25℃，所述干燥的优选为6h。本发明对所述生物组织的来源没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，所述生物组织为大鼠组织。
得到固态衍生化水凝胶和生物组织切片后，本发明将所述固态衍生化水凝胶贴附于所述生物组织切片任一侧表面，进行衍生化反应，得到衍生化生物组织切片。
在本发明中，所述衍生化反应的温度优选为37℃；时间优选为15min～5h，更优选为30min～3h，最优选为1h～2h。
贴附之前，本发明优选将所述固态衍生化水凝胶优选制备成固态衍生化水凝胶片，在本发明中，所述制备方法优选为切制。在本发明中，所述固态衍生化水凝胶片的尺寸优选为20mm×10mm×10mm，在本发明中，所述固态衍生化水凝胶片优选根据生物组织切片的尺寸进行微调，所述固态衍生化水凝胶片的尺寸优选与生物组织切片的尺寸相同。
本发明制备的固态衍生化水凝胶通过物理吸附方式在固态衍生化水凝胶表面形成含有衍生化试剂的水分子层，提供了良好的液态微环境；通过固态衍生化水凝胶表面的水分子层与生物组织切片表面进行充分接触，使水分子层中的衍生化试剂与生物组织中的代谢物进行充分的衍生化反应；同时利用固态衍生化水凝胶去除衍生化后的生物组织表面的无机盐、季铵盐、易溶于水的高质谱响应的代谢物。
本发明技术方案的第五方面提供了一种生物组织代谢物的非诊断和治疗为目的的表征方法，包括以下步骤：
按照技术方案第四方面所述衍生化方法得到衍生化生物组织切片；
采用质谱成像技术对所述衍生化生物组织切片中的代谢物进行表征。
本发明按照上述技术方案所述衍生化方法得到衍生化生物组织切片。
在本发明中，所述衍生化生物组织切片在表征前优选进行前处理，在本发明中，所述前处理优选为干燥，所述干燥的温度优选为25℃，干燥的时间预选为6h，所述干燥优选真空干燥，本发明对所述真空干燥的真空度没有特殊要求。
本发明采用质谱成像技术对所述衍生化生物组织切片中的代谢物进行表征。
在本发明中，采用质谱成像技术对所述衍生化生物组织切片中的代谢物进行表征的方法包括以下步骤：
采用质谱成像技术，获得衍生化生物组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵；
参比代谢物发生衍生化后生成的衍生化代谢物离子的精确质量数，设定质量误差为5ppm，对衍生化的代谢物离子进行提取和识别，并通过二级质谱分析对代谢物的分子结构进行进一步推断，通过质谱成像技术中的数据处理软件，对衍生化生物组织切片中的衍生代谢物按照离子强度和位置关系进行重构和可视化。
本发明采用质谱成像技术，获得衍生化生物组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵。
本发明对所述质谱成像技术没有特殊要求，采用本领域技术熟知的质谱成像技术即可；在本发明的具体实施例中，所述质谱成像技术为本发明人自主研发的空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像技术(Air flow assisted desorption electrosprayionization mass spectrometry imaging,AFADESI-MSI)。
在本发明中，所述质谱成像技术的具体实施过程为：配制喷雾溶液，设定电压为7KV，喷雾流速为5μL/min，喷雾气压力为0.8MPa，X轴扫描速度为2mm/s，Y轴步进距离为2mm/s，所述喷雾溶液优选为乙腈和水的混合溶液，所述乙腈和水的体积比优选为8:2；设定采集模式为正离子模式，对衍生化生物组织切片中的代谢物按空间位置逐点进行扫描检测，获得衍生化生物组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵。
获得衍生化生物组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵后，本发明参比代谢物发生衍生化后生成的衍生化代谢物离子的精确质量数，设定质量误差为5ppm，对衍生化的代谢物离子进行提取和识别，并通过二级质谱分析对代谢物的分子结构进行进一步推断，通过质谱成像技术中的数据处理软件，对衍生化生物组织切片中的衍生代谢物按照离子强度和位置关系进行重构和可视化。
在本发明中，所述代谢物发生衍生化后生成的衍生化代谢物离子的精确质量数的获得方法包括已知数据库中储存的数据或通过实验室测量衍生化加标生物组织浆条获得的数据。在本发明中，所述已知数据库包括Metlin数据库、HMDB数据库或Lipid Maps数据库。
在本发明中，通过实验室测量衍生化加标生物组织匀浆条获得数据的方法与所述衍生化生物组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵的获得方法相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述衍生化加标生物组织匀浆条的制备方法包括以下步骤：
将生物组织匀浆和含有代谢物标准品的标准储备液混合，得到加标生物组织匀浆；
将所述加标生物组织匀浆固化，得到加标生物组织匀浆条；
将所述加标生物组织匀浆条按照上述技术方案所述衍生化方法进行衍生化，得到衍生化加标生物组织匀浆条。
本发明将生物组织匀浆和含有代谢物标准品的标准储备液混合，得到加标生物组织匀浆。
在本发明中，所述生物组织匀浆优选为生物组织和生理盐水的混合溶液，在本发明中，所述生物组织的质量和生理盐水的体积比优选为3:4；在本发明中，所述含有代谢物标准品的标准储备液中的代谢物标准品优选包括羰基代谢物、羟基代谢物、羧基代谢物和巯基代谢物中的一种或多种，更优选为羰基代谢物，最优选为孕烯酮醇、睾酮、雄酮和脂肪醛；在本发明中，所述加标生物组织匀浆中代谢物标准品的质量浓度优选为100μg/mL。
得到加标生物组织匀浆后，本发明将所述加标生物组织匀浆固化，得到加标生物组织匀浆条。
本发明对所述固化的具体实施方案没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，所述固化为：用打孔器于PVC不干胶上制作连续的25mm矩形孔；将打孔后的PVC不干胶粘附于正电荷防脱载玻片上；利用微量移液器吸取5μL加标生物组织匀浆于载玻片的矩形孔中；将载玻片置于真空干燥器中干燥6h。
得到加标生物组织匀浆条后，本发明将所述加标生物组织匀浆条按照上述技术方案所述衍生化方法进行衍生化，得到衍生化加标生物组织匀浆条。
在本发明中，所述代谢物的范围与标准代谢物种类的范围相同，在此不再赘述。
本发明提供了一种固态衍生化水凝胶，包括水凝胶、衍生化试剂和水；所述衍生化试剂分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面；所述水凝胶的质量占水凝胶、衍生化试剂和水总质量的百分数为5～45％；所述衍生化试剂在水凝胶、衍生化试剂和水形成的混合溶液中的质量浓度为0.1～200mg/mL。本发明提供的固态衍生化水凝胶将衍生化试剂均匀分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面；分散于固态衍生化水凝胶表面的衍生化试剂通过固态衍生化水凝胶的物理吸附作用在固态衍生化水凝胶表面形成含有衍生化试剂的水分子层，为衍生化反应提供良好的液态微环境；通过固态衍生化水凝胶表面的水分子层与生物组织表面进行充分接触，使水分子层中的衍生化试剂与代谢物进行充分的衍生化反应，且当水分子层中的衍生化试剂浓度因反应降低时，分散于水凝胶三维网络结构内部的衍生化试剂在浓度差的作用下，不断向水分子层中扩散，提高了生物组织中代谢物的衍生化效率；同时利用固态衍生化水凝胶表面的水分子层对衍生化后的生物组织表面的水溶性无机盐、季铵盐、易溶于水的高质谱响应的代谢物进行溶解，并在浓度差的作用下，向固态衍生化水凝胶的三维网络结构中扩散，实现对水溶性无机盐、季铵盐、易溶于水的高质谱响应的代谢物的去除，减小背景干扰。本发明提供的固态衍生化水凝胶对生物组织进行衍生化时，衍生化效率高，能够显著提高生物组织中内源性代谢物的检测灵敏度，可以有效实现生物组织中低丰度、难电离的代谢物的质谱成像分析及原位表征。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的固态衍生化水凝胶进行生物组织衍生化方法的示意图；
图2为本发明应用例1提供的固态衍生化水凝胶对加标大鼠肝组织匀浆条进行衍生化前后雄酮和黄体酮的质谱成像结果对比图；
图3为本发明应用例1提供的固态衍生化水凝胶对加标大鼠肝组织匀浆条进行衍生化前后雄酮和黄体酮的质谱响应结果对比图；
图4为本发明应用例2提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片进行衍生化前后未知代谢物的质谱成像结果对比图；
图5为本发明应用例2提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片进行衍生化前后未知代谢物的质谱响应结果对比图；
图6本发明应用例2提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片衍生化前后左旋肉碱C18:0、C18:1、C18:2和C16:0的质谱成像结果对比图；
图7本发明应用例2提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片衍生化前后溶血磷脂酰胆碱C18:0、C18:1、C18:2和C16:0的质谱成像结果对比图；
图8本发明应用例2提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片衍生化前后磷脂酰胆碱C34:1和C34:2的质谱成像结果对比图；
图9本发明应用例2提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片衍生化前后左旋肉碱C18:0、C18:1、C18:2、C16:0、溶血磷脂酰胆碱C18:0、C18:1、C18:2、C16:0和磷脂酰胆碱C34:1、C34:2的质谱响应结果对比图；
图10本发明应用例3提供的固态衍生化水凝胶对大鼠脑组织切片衍生化的实物图；
图11本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后短碳链脂肪醛类代谢物FAL3:0、FAL4:0、FAL5:0、FAL6:0、FAL7:0、FAL8:0、FAL9:0和FAL10:0的质谱成像空间分布图；
图12本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后长碳链脂肪醛类代谢物FAL11:0、FAL12:0、FAL13:0、FAL14:0、FAL15:0、FAL16:0、FAL17:0和FAL18:0的质谱成像空间分布图；
图13本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后短碳链含氧脂肪酸类代谢物FA5:1；O、FA7:1；O、FA8:1；O、FA9:1；O和FA10:1；O的质谱成像空间分布图；
图14本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后长碳链含氧脂肪酸类代谢物FA11:1；O、FA12:1；O、FA13:1；O和FA14:1；O的空间分布图；
图15本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后脂质代谢物FAL16:4；O和FA17:5；O2的质谱成像空间分布图；
图16本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后脂质代谢物FAL6:2和FA9:4的质谱成像空间分布图；
图17本发明应用例2～4提供的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片、脑组织切片和肝组织切片衍生化后脂质代谢物FAL17:4；O和FA19:1；O2的质谱成像空间分布图；
图18本发明应用例5提供的采用同位素d0-吉拉德试剂和d5-吉拉德试剂制备得到的固态衍生化水凝胶对大鼠肾组织切片和脑组织切片衍生化后代谢物FAL10:2；O、FAL6:0；O、FAL14:3和FAL11:0的质谱成像空间分布对比图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
于70℃配制含有1％甲酸和50mg/mL d0-吉拉德试剂P的浓度为15％的明胶水凝胶的混合水溶液，转移至室温放凉1小时后置于4℃冰箱静置6小时，得到具有一定机械强度的含有衍生化试剂的固体衍生化水凝胶。
应用例1
取含有孕烯酮醇、睾酮、雄酮和脂肪醛(FAL 6:0、FAL 7:0、FAL 8:0)的标准储备液0.1mL，生理盐水0.4mL与0.3g大鼠肝组织组织匀浆液，配制成含上述标准代谢物浓度为100μg/mL的加标大鼠肝组织匀浆；
取上述配制的加标大鼠肝组织匀浆，在打孔器于PVC不干胶上制作连续的2mm×5mm矩形孔，再将PVC不干胶粘附于正电荷防脱载玻片上；利用微量移液器准确吸取5μL加标大鼠肝组织匀浆于载玻片的类矩形孔中，并置于真空干燥器中抽真空6h，制备加标大鼠肝组织匀浆条；
将实施例1制备得到的固体衍生化水凝胶按照20mm×10mm×10mm的尺寸，切成一系列完整的固体衍生化水凝胶片，并按照加标大鼠肝组织匀浆条对其尺寸进行微调，将制备好的固体衍生化水凝胶片贴附于加标大鼠肝组织匀浆条一侧表面，于37℃下放置2小时，完成加标大鼠肝组织匀浆条中代谢物与衍生化试剂的衍生化反应，得到衍生化加标大鼠肝组织匀浆条；并置于真空中干燥连续干燥6h；
配制乙腈：水体积比为8：2的喷雾溶液，将衍生化加标大鼠肝组织匀浆条进行AFADESI-MSI的测试，电压设定为7KV，喷雾针流速为5μL/min，喷雾气压力为0.8MPa，X轴扫描速度为2mm/s，Y轴步进距离为2mm/s，采集模式为正离子模式进行采集，获得衍生化加标大鼠肝组织匀浆条中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵；
采用相同的方法测定未衍生化的加标大鼠肝组织匀浆条中标准品的代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵；
得到衍生化加标大鼠肝组织匀浆条和未衍生化加标大鼠肝组织匀浆条中的雄酮和黄体酮的质谱成像结果对比图和质谱响应结果对比图，如图2、图3和表1所示，被衍生化的雄酮和黄体酮的质谱响应分别提高了124.72倍和30.39倍。
应用例2
将冰冻大鼠肾组织于-80℃中转移至-20℃，并用Lecia Cryo-Gel包埋胶进行包埋固定于切片机中，进行连续12μm的切片，得到大鼠肾组织切片，并于25℃干燥6小时备用；
将实施例1制备得到的固体衍生化水凝胶按照20mm×10mm×10mm的尺寸，切成一系列完整的固体衍生化水凝胶片，并按照大鼠肾组织切片对其尺寸进行微调，将制备好的固体衍生化水凝胶片贴附于大鼠肾组织切片一侧表面，于37℃下放置2小时，完成大鼠组织中代谢物与衍生化试剂的衍生化反应，得到衍生化大鼠肾组织切片；并置于真空中干燥连续干燥6h；
配制乙腈：水体积比为8：2的喷雾溶液，将完成衍生化的大鼠肾组织切片进行AFADESI-MSI的测试，电压设定为7KV，喷雾针流速为5μL/min，喷雾气压力为0.8MPa，X轴扫描速度为2mm/s，Y轴步进距离为2mm/s，采集模式为正离子模式进行采集，获得衍生化大鼠肾组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵；
设置质量误差为5ppm，根据AFADESI-MSI的数据处理软件对衍生化大鼠肾组织切片中代谢物的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵进行提取，得到衍生化大鼠肾组织切片中的代谢物的质谱成像图。
对比经过衍生化后与未衍生化的大鼠肾组织切片的未知代谢物的质谱成像结果对比图和质谱响应结果对比图，如图4和图5和表1所示，被衍生化的未知代谢物的质谱响应提高了33.58倍；同时，如图6、图7、图8和图9所示，大鼠肾组织切片经过固态衍生化水凝胶衍生化处理，未发生衍生化的左旋肉碱C18:0、C18:1、C18:2和C16:0、溶血磷脂酰胆碱C18:0、C18:1、C18:2和C16:0和磷脂酰胆碱C34:1和C34:2代谢物的质谱响应均有4.5倍以上的提升，表明本发明提供的通过固态衍生化水凝胶进行衍生化的方法有效去除了高浓度的盐类成分，降低了基质效应，提高了弱极性代谢物的的质谱响应。
表1衍生化前后大鼠肝组织匀浆条中雄酮和黄体酮以及衍生化前后大鼠肾组织切片中未知代谢物的质谱响应结果
表2衍生化前后的大鼠肾组织切片的左旋肉碱C18:0、C18:1、C18:2和C16:0、溶血磷脂酰胆碱C18:0、C18:1和C16:0和磷脂酰胆碱C34:1和C34:2代谢物的的质谱响应结果
应用例3
将冰冻大鼠脑组织于-80℃中转移至-20℃，并用Lecia Cryo-Gel包埋胶进行包埋固定于切片机中，进行连续12μm的切片，得到大鼠脑组织切片，并于25℃干燥6小时备用；
将固体衍生化水凝胶按照20mm×10mm×10mm的尺寸，切成一系列完整的固体衍生化水凝胶片，并按照大鼠脑组织切片对其尺寸进行微调，将制备好的固体衍生化水凝胶片贴附于大鼠脑组织切片表面(如图10所示)，于37℃下放置2小时，完成大鼠组织中代谢物与衍生化试剂的衍生化反应，得到衍生化大鼠脑组织切片；并置于真空中干燥连续干燥6h；
配制乙腈：水体积比为8：2的喷雾溶液，将完成衍生化的大鼠脑组织切片进行AFADESI-MSI的测试，电压设定为7KV，喷雾针流速为5μL/min，喷雾气压力为0.8MPa，X轴扫描速度为2mm/s，Y轴步进距离为2mm/s，采集模式为正离子模式进行采集，获得衍生化大鼠脑组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵；
设置质量误差为5ppm，根据AFADESI-MSI的数据处理软件对衍生化大鼠脑组织切片中代谢物的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵进行提取，得到衍生化大鼠脑组织切片中的代谢物的质谱成像图。
应用例4
将冰冻大鼠肝组织于-80℃中转移至-20℃，并用Lecia Cryo-Gel包埋胶进行包埋固定于切片机中，进行连续12μm的切片，得到大鼠肝组织切片，并于25℃干燥6小时备用；
将实施例1制备得到的固体衍生化水凝胶按照20mm×10mm×10mm的尺寸，切成一系列完整的固体衍生化水凝胶片，并按照大鼠肝组织切片对其尺寸进行微调，将制备好的固体衍生化水凝胶片贴附于大鼠肝组织切片一侧表面，于37℃下放置2小时，完成大鼠肝组织中代谢物与衍生化试剂的衍生化反应，得到衍生化大鼠肝组织切片；并置于真空中干燥连续干燥6h；
配制乙腈：水体积比为8：2的喷雾溶液，将完成衍生化的衍生化大鼠肝组织切片进行AFADESI-MSI的测试，电压设定为7KV，喷雾针流速为5μL/min，喷雾气压力为0.8MPa，X轴扫描速度为2mm/s，Y轴步进距离为2mm/s，采集模式为正离子模式进行采集，获得衍生化大鼠肝组织切片中衍生化代谢物离子的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵；
设置质量误差为5ppm，根据AFADESI-MSI的数据处理软件对衍生化大鼠肝组织切片中代谢物的质荷比与离子强度、位置关系的多维数据阵进行提取，得到衍生化大鼠肝组织切片中的代谢物的质谱成像图。
将应用例2～4得到的大鼠肾、脑和肝的质谱数据进行Metlin、HMDB、Lipid Maps数据库比对，并通过脂质碳链数增加及不饱和度增加规则，共得到266种脂肪醛及含氧脂肪酸类代谢物，如表3所示。
根据表3中衍生化后代谢物的精确质量数，对大鼠脑、肾和肝组织中部分代谢物数据进行提取，对短碳链、长碳链脂肪醛及含氧脂肪酸进行空间分布成像表征，如图11、图12、图13、图14、图15、图16和图17所示。结果表明，通过本发明提供的生物组织衍生化方法可以实现对不同生物组织样本中的不同类型代谢物的衍生化，有效提高质谱成像分析的灵敏度。
表3应用例2～4通过衍生化和质谱分析技术对生物组织中266种脂肪醛及含氧脂肪酸类代谢物的精确识别
实施例2
与实施例1的制备方法相同，区别为本实施例分别使用d0-吉拉德试剂P和d5-吉拉德试剂P制备两种衍生化试剂的固体衍生化水凝胶。
应用例5
采用实施例2制备的两种固态衍生化水凝胶分别对相邻的大鼠肾组织切片和脑组织切片进行衍生化和质谱成像分析，如图18所示，采用d0-吉拉德试剂P固态衍生化水凝胶和d5-吉拉德试剂P固态衍生化水凝胶分别对相邻的大鼠肾组织切片和脑矢状面组织切片进行衍生化后，代谢物FAL10:2；O、FAL6:0；O、FAL14:3和FAL11:0均能够被两种衍生化试剂衍生化，产生了差5个中子质量的离子，两种衍生化试剂衍生的同一种代谢物在相邻的两个组织切片中展现出了相同的精细组织微区分布特征，能够进一步证明目标代谢物与衍生化试剂确实发生了衍生化反应，通过d0-吉拉德试剂P和d5-吉拉德试剂P两种衍生化试剂对目标代谢物的共定位进一步排除了衍生化代谢物识别的假阳性结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种生物组织衍生化方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供生物组织切片；
将固态衍生化水凝胶贴附于所述生物组织切片表面，进行衍生化反应；所述固态衍生化水凝胶包括明胶、衍生化试剂和水；所述衍生化试剂分散于固态衍生化水凝胶的三维网状结构内部和表面；所述衍生化试剂包括吉拉德试剂P、丹磺酰氯、丹磺酰肼和苯甲酰氯中的一种或多种；所述明胶的质量占明胶、衍生化试剂和水总质量的百分数为5～45％；所述衍生化试剂在明胶、衍生化试剂和水形成的混合溶液中的质量浓度为0.1～200mg/mL。
2.权利要求1所述的生物组织衍生化方法，其特征在于，所述固态衍生化水凝胶的制备方法包括以下步骤：
将明胶、衍生化试剂和水混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液静置，得到固态衍生化水凝胶；
所述混合溶液中明胶的质量百分数为5～45％；
所述混合溶液中衍生化试剂的质量浓度为0.1～200mg/mL。
3.根据权利要求2所述的生物组织衍生化方法，其特征在于，所述静置的温度为-20～4℃，时间为4～10h。
4.根据权利要求1所述的生物组织衍生化方法，其特征在于，所述衍生化反应的温度为25～40℃，时间为15min～5h。
5.根据权利要求1所述的生物组织衍生化方法，其特征在于，所述生物组织切片包括心组织切片、肝组织切片、脾组织切片、肺组织切片、肾组织切片、脑组织切片、肌肉组织切片、生殖腺组织切片或肿瘤组织切片。
6.一种生物组织代谢物非诊断和治疗为目的的表征方法，其特征在于，包括以下步骤：
按照权利要求1～5任意一项所述衍生化方法得到衍生化生物组织切片；
采用质谱成像技术对所述衍生化生物组织切片中的代谢物进行表征。
7.根据权利要求6所述的表征方法，其特征在于，所述代谢物包括羰基代谢物、羟基代谢物、羧基代谢物和巯基代谢物中的一种或多种。
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