CN115073571A - 一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用 - Google Patents

一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物遗传育种技术领域，具体涉及一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用。本发明提供的AcSWI3B蛋白及其编码基因具有提高植物的小穗粒数和穗粒数的功能，将AcSWI3B基因导入小麦得到的转基因小麦，其小穗粒数和穗粒数较对照品种显著增加。AcSWI3B蛋白及其编码基因为培育多小穗粒数、穗粒数小麦品种提供了新的基因资源，对于提高小麦产量具有重要意义。本发明提供的AcSWI3B基因特异分子标记具有特异性强、稳定性强、重复性好等优点，可应用于小麦‑冰草渗入系材料的检测，有助于AcSWI3B基因在小麦育种中的精准利用。

Description

一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物遗传育种技术领域，具体涉及一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一，近年来，随着人口数量的增加和可使用耕地面积的减少，小麦产量提升面临着巨大的挑战。加之全球气候变化，极端天气频发，小麦全生育期面临着各种生物和非生物胁迫。因此，提高小麦适应性、确保小麦高产稳产显得尤为重要。小麦的单位面积产量由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重三因素构成。在这些构成因素中，增加每穗粒数对于提高产量是重要而且可靠的方式。穗粒数是一个复杂性状，取决于每穗小穗数、每小穗分化小花数、退化小花数和小花结实率。研究表明，增加每小穗粒数是增加小麦穗粒数的一个重要途径。小穗粒数和穗粒数由遗传和环境共同决定。近年来，小穗粒数和穗粒数的调控机制逐渐成为分子生物学家和育种家关注和研究的热点，但由于小麦基因组庞大，重复序列多，遗传背景复杂，小麦小穗粒数和穗粒数相关基因及调控机制的研究报道仍较少。因此，开发能够提高小麦小穗粒数和穗粒数的基因对小麦高产分子育种具有重要意义。
小麦野生近缘种基因资源丰富，在小麦改良的过程中通过远缘杂交已成功将一些外源的优异基因导入小麦，极大促进了小麦的遗传改良。冰草(Agropyron cristatum)(PPPP，2n＝4x＝28)是小麦野生近缘种，具有多花多粒、多分蘖、抗病、抗逆性极强的特性，是小麦改良的重要供体种。通过小麦-冰草远缘杂交创制了小麦-冰草附加系、易位系、缺失系和渗入系等种质材料，并明确了各条P染色体携带的优异基因。这些种质材料已作为育种亲本材料或桥梁材料应用于小麦育种，为小麦农艺性状改良如产量、品质、耐逆性、成熟期等，提供了重要的基因源。因此，发掘冰草中高效优异基因并将其应用于小麦分子育种中，是改良小麦农艺性状的重要策略。同时，针对这些基因开发其特异分子标记并应用于小麦分子标记辅助选择育种中，对小麦-冰草渗入系材料在小麦育种中的高效利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用。
本发明从冰草转录组中筛选得到一个SWI/SNF染色质重塑复合体组分AcSWI3B基因，通过构建该基因的过表达载体，并利用农杆菌介导法转化小麦，获得了过表达AcSWI3B基因的转基因小麦植株。经试验验证发现，在正常生长条件下过表达AcSWI3B的转基因小麦较对照小穗数降低，小穗粒数增加，最终穗粒数增加。此外，本发明还开发了冰草AcSWI3B基因的特异分子标记，可应用于小麦-冰草渗入系材料中AcSWI3B基因的检测，并进行AcSWI3B基因与多小穗粒数、多穗粒数性状的关联分析，为AcSWI3B基因和优异渗入系材料在小麦育种中的精准应用提供工具。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质为以下(1)-(3)中的任意一种：
(1)具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)具有在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签序列得到的氨基酸序列；
(3)具有与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少75％的同源性的氨基酸序列且与(1)具有同等活性。
上述(1)中所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白来源于禾本科冰草属(Agropyron cristatum)，名称为AcSWI3B，由489个氨基酸残基组成。
上述(2)中所述的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白与蛋白标签连接得到的融合蛋白。该融合蛋白更便于纯化。
可选择的蛋白标签包括但不限于表1中所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(3)中所述的同源性优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，更优选为至少98％。这些同源蛋白优选来源于禾本科冰草属(Agropyron cristatum)。
以上(1)-(3)中所述的蛋白质可以通过人工合成获得，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
第二方面，本发明提供与以上第一方面所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为以下A1)至A12)中的任意一种：
A1)编码上述第一方面所述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述A1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
优选地，所述核酸分子为以下(1)-(3)中的任一种：
(1)序列如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或编码序列如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子的基因组DNA分子；
(2)与(1)所述cDNA分子或基因组DNA分子的核苷酸序列具有至少75％同源性，且编码上述第一方面所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)所述cDNA分子或基因组DNA分子的核苷酸序列杂交，且编码上述第一方面所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列由1470个核苷酸组成，编码氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的蛋白质(AcSWI3B)。根据SEQ ID NO.1所示的cDNA分子的序列，本领域技术人员可获得包含内含子的基因组DNA序列。
本领域技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码AcSWI3B的核苷酸序列进行突变。这些经过人工修饰的、具有与本发明分离得到的AcSWI3B的核苷酸序列75％或者更高同源性的核苷酸序列，只要编码AcSWI3B且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的AcSWI3B的序列。
本发明使用的术语“同源性”是指与天然氨基酸序列或核苷酸序列的序列相似性。上述核苷酸序列的“同源性”包括与本发明的编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的核苷酸序列。同源性可以人工计算或采用计算机软件进行评价。使用计算机软件进行评价时，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
上述(2)中的同源性优选为至少80％、85％、90％、95％或98％。
上述A2)所述的含有所述核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达第一方面所述的蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述核酸分子转录的启动子，还可包括终止所述核酸分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
上述A3)所述的重组载体可采用现有的表达载体构建得到。可选的植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的核酸分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。上述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以小穗粒数和穗粒数筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组表达载体为将上述核酸分子插入pCAMBIA330载体得到的重组载体，具体为将SEQ IDNO.1所示序列自5'端第1-1470位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA3300载体的Sac I酶切识别位点之间得到的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为细菌(如大肠杆菌、农杆菌)、真菌(如酵母)或藻类。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
第三方面，本发明提供第一方面所述的蛋白质或第二方面所述的生物材料的以下任一种应用：
(1)在调控植物小穗粒数和/或穗粒数中的应用；
(2)在调控植物穗形中的应用；
(3)在培育多小穗粒数和/或多穗粒数的转基因植物中的应用；
(4)在植物育种中的应用；
(5)在植物种质资源改良中的应用。
上述(1)中，调控植物小穗粒数和/或穗粒数优选为增加小穗粒数和/或穗粒数。
所述增加小麦小穗粒数、穗粒数具体体现在如下：(1)在正常生长条件下，转基因小麦的小穗粒数较未进行转基因的受体小麦增加；(2)在正常生长条件下，转基因小麦的穗粒数较未进行转基因的受体小麦增加。
上述(2)所述的应用中，调控小麦穗形优选为将纺锤形调整为方形。
上述应用中，优选通过提高植物中上述第一方面所述的蛋白质的表达量和/或活性，增加植物的小穗粒数和/或穗粒数。
上述应用中，所述植物优选为小麦。小麦品种具体可为Fielder、周麦18、济麦22等。
第四方面，本发明提供一种培育多小穗粒数、多穗粒数的转基因小麦的方法，所述方法包括提高受体小麦中以上第一方面所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因小麦的步骤。
优选地，所述提高受体小麦中所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体小麦中过表达所述蛋白质。
进一步优选地，所述提高受体小麦中所述蛋白质的表达量和/或活性通过将所述蛋白质的编码基因导入受体小麦中实现。
其中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白质的编码基因(SEQ ID NO.1所示)通过含有AcSWI3B蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA3300-AcSWI3B导入农杆菌EHA105中。所述重组载体pCAMBIA3300-AcSWI3B为pCAMBIA3300载体的Sac I酶切位点之间的DNA片段替换为SEQ ID NO.1所示的AcSWI3B基因序列，且保持pCAMBIA3300载体的其他序列不变得到的载体。
上述方法中，所述转基因小麦的小穗粒数和穗粒数较受体小麦显著增加。
上述方法中，所述转基因小麦应理解为不仅包含将所述蛋白质的编码基因转化受体小麦得到的第一代转基因小麦，也包括其子代。对于转基因小麦，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因小麦包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明经实验证明，将冰草AcSWI3B基因导入小麦中得到转基因小麦，正常生长条件下转基因小麦小穗粒数和穗粒数较受体小麦显著增加。本发明提供的蛋白质和基因为人为控制小穗粒数、穗粒数提供了基础，将在培育多小穗粒数小麦品种中发挥重要的作用。
第五方面，本发明提供一种特异分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或4所示；
或者，所述分子标记为由核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物扩增得到的DNA分子；
或者，所述分子标记由核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增得到的DNA分子。
上述特异分子标记用于检测小麦背景下的冰草AcSWI3B基因，具有重复性好、分辨力高的优势，可高效、准确地检测小麦背景下的冰草AcSWI3B基因。
其中，序列如SEQ ID NO.3所示的分子标记命名为AcSWI3B-1，序列如SEQ ID NO.4所示的分子标记命名为AcSWI3B-2，这两个分子标记均在冰草基因组6PS上，位于AcSWI3B基因内部，区分于小麦基因组，其中，分子标记AcSWI3B-1位于AcSWI3B基因第二内含子内，片段大小为1015bp，采用如SEQ ID NO.5-6所示的引物扩增得到，AcSWI3B-2位于AcSWI3B基因第四内含子内，片段大小为284bp，采用如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增得到。
第六方面，本发明提供以上所述的特异分子标记在检测小麦背景下以上第一方面所述的蛋白质的编码基因中的应用，所述应用包括：以待测植株的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物进行PCR，根据PCR产物判断所述待测植株中是否含有所述蛋白质的编码基因。
上述应用中，所述待测植株可以为小麦-冰草附加系、易位系、缺失系、渗入系等。
上述应用中，根据PCR产物判断所述待测植株中是否含有所述蛋白质的编码基因可为根据PCR产物的片段大小或序列判断。
优选地，上述应用具体包括以下步骤：
(1)提取待测植株的DNA：采用常规CTAB法提取基因组DNA，待测植株通常指含冰草染色体成分的小麦-冰草附加系、易位系、缺失系、渗入系等；
(2)PCR：采用高保真酶Primerstar(Taraka)，以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.5-6和/或SEQ ID NO.7-8所示的引物进行PCR扩增，扩增体系如表2所示；
表2 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003617215290000051
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，引物在57℃复性15s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
(3)检测：采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，将10μL PCR产物和1μL 10×的上样缓冲液混合点样，电压120V，电泳15min成像。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的AcSWI3B蛋白及其编码基因具有提高植物的小穗粒数和穗粒数的功能，将AcSWI3B基因导入小麦得到的转基因小麦，其小穗粒数和穗粒数较对照品种显著增加。AcSWI3B蛋白及其编码基因为培育多小穗粒数、穗粒数小麦品种提供了有价值的新的基因资源，对于提高小麦的产量具有重要意义；
(2)本发明提供的AcSWI3B基因特异分子标记具有特异性强、稳定性强、重复性好等优点；该分子标记的检测方法操作简便快捷，对检测设备和模板质量要求不高，实验试剂用量少，速度快，成本低，适合高通量、自动化的操作，该分子标记可应用于小麦-冰草渗入系材料的检测，有助于AcSWI3B基因在小麦育种中的精准利用。
附图说明
图1为本发明实施例1中AcSWI3B基因的PCR扩增产物的电泳检测结果。
图2为本发明实施例2中AcSWI3B基因的时空表达特异性和组织表达特异性。
图3为本发明实施例3中AcSWI3B基因的亚细胞定位，其中，Bright代表明视野，chlorophyll代表叶绿体，H2B-mCherry代表核marker基因，Merged代表共定位。
图4为本发明实施例4中AcSWI3B转基因小麦增加小穗粒数和穗粒数表型以及性状调查，其中，A为受体材料Fielder和AcSWI3B过表达转基因小麦穗形比较，结果表明Fielder穗形呈纺锤形，AcSWI3B过表达转基因小麦穗形呈方形；B为受体材料Fielder和AcSWI3B过表达转基因小麦中部小穗(从下往上约第4个小穗)比较；C为受体材料Fielder和AcSWI3B过表达转基因小麦中部小穗(从下往上约第4个小穗)分解比较；D为受体材料Fielder和AcSWI3B过表达转基因小麦小穗数、小穗粒数、穗粒数统计分析；Fielder代表对照小麦植株，Ubi：：AcSWI3B代表过表达转基因小麦，AcSWI3B-1、AcSWI3B-2和AcSWI3B-3分别代表3个转基因植株。
图5为本发明实施例5中利用AcSWI3B基因特异标记AcSWI3B-1检测小麦-冰草渗入系结果，其中Marker为Marker D2000。
图6为本发明实施例5中标记AcSWI3B-2检测小麦-冰草渗入系结果，其中M为Marker D2000，泳道1-8分别为冰草Z559、Z559、Fukuho、周麦18、济麦22、西农979、MCGURIE、藁城8901，泳道9-13分别小麦-冰草渗入系1、小麦-冰草渗入系2、小麦-冰草渗入系3、小麦-冰草渗入系4、小麦-冰草渗入系5。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
以下实施例中的普通小麦(Triticum aestivum L.)品种Fielder记载于文献“孙海桃等，小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011，44(22)：4740-4747.”中；普通小麦(Triticum aestivum L.)品种Fukuho、McGuire记载于文献“韩海明等，小麦－冰草多粒新种质的抗白粉病和高分子量麦谷蛋白亚基组成分析，植物遗传资源学报，2013，14(1)：31-35.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；普通小麦周麦18、济麦22、西农979、藁城8901均为商业化品种，公众可从市场购买；冰草从国家种质库获得，编号Z559；小麦-冰草6P附加系5113记载于文献“Han Haiming et al.，Isolation andapplication of P genome-specific DNA sequences of Agropyron Gaertn.inTriticeae，Planta，2017，245：425–437”中，5113以及各小麦-冰草渗入系均由中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源中心创制保存。上述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1AcSWI3B基因的克隆
一、AcSWI3B基因的扩增
1、植物材料的处理
取苗期的冰草Z559叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。
2、总RNA的提取和cDNA的合成
采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒，进行冰草叶片总RNA的提取。具体步骤如下：
(1)取约0.1g样品放至2.0mL 离心管中，液氮速冻后用打样机打成粉末状；
(2)向离心管中加入1mL植物裂解液，迅速振荡混匀，并于冰上静置2min；
(3)向离心管中加入200μL氯仿，迅速剧烈振荡40s，并于冰上静置3min；
(4)在提前预冷的4℃离心机中高速(12000rpm)离心10min，将上层水相(约600μL)转移至新的1.5mL离心管中；
(5)向新的离心管中加入0.5倍体积的无水乙醇，再加入100μL的结合液，颠倒混匀后转移至吸附柱中，吸附柱套在收集管中，于4℃离心机中高速(12000rpm)离心30s；
(6)弃收集管中废液，向吸附柱中加入700μL漂洗液，于4℃离心机中高速(12000rpm)离心30s；
(7)重复步骤(6)；
(8)将吸附柱从收集管中取出套在RNase-free的1.5mL离心管中，静置1min晾干漂洗液，向吸附柱的滤膜中央加入60μL的RNase-free ddH2O，使RNA充分溶解；
(9)用分光光度法和1％琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性；
(10)取1μg RNA进行cDNA的合成，剩余样品保存于-80℃冰箱备用。
采用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行cDNA的合成，合成体系如表3所示。
表3 cDNA合成体系
Figure BDA0003617215290000071
Figure BDA0003617215290000081
3、AcSWI3B基因的扩增
采用高保真酶Primerstar(TaKaRa)，以冰草叶片cDNA为模板，设计AcSWI3B基因特异引物进行PCR扩增，扩增体系如表4所示。
表4 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003617215290000082
将PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离(图1)，切下大小约为1.5kb的条带进行胶回收。胶回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Takara)。具体步骤如下：
(1)将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，装入2.0mL离心管中；
(2)加入和胶块等体积的Buffer GM，使胶块充分溶解，溶解程度直接影响回收效率；
(3)将溶解后的溶液转移至Spin Column中，静置5-10min，离心机中12000rpm离心1min，弃滤液；
(4)往Spin Column中加入600μL漂洗液Buffer WB，12000rpm离心1min，弃滤液；
(5)重复步骤(4)；
(6)通风橱中静置2min，吹干漂洗液；
(7)将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向滤膜中央加入50μL ddH2O，待充分溶解后，于离心机中10000rpm离心1min，即为回收产物；
(8)测回收产物浓度。
二、AcSWI3B基因的克隆
将上述扩增所得的胶回收产物连接至零背景克隆载体pEASY Blunt零背景载体(全式金)，并用热激法转化入大肠杆菌，在含卡那抗性的LB固体培养基上过夜培养(37℃)后挑取单克隆进行测序，结果表明该PCR产物测序结果与SEQ ID NO.1所示序列完全一致，即为AcSWI3B基因，其开放阅读框为自SEQ ID NO.1所示序列的5′端第1-1470位核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为AcSWI3B蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由489个氨基酸残基组成。
实施例2AcSWI3B基因的时空表达特异性和组织表达特异性
一、植物材料的处理
1、时空特异性表达
以小麦-冰草6P附加系5113为材料，春化后种植于可控温室(22℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度70％)，从苗期到灌浆期取各个时期的叶片提取总RNA，反转录为cDNA进行时空特异性表达分析。
2、组织特异性表达
以小麦-冰草6P附加系5113为材料，春化后种植于可控温室(22℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度70％)，取小花分化期和柱头伸长期的各个组织提取总RNA，反转录为cDNA进行组织特异性表达分析。
总RNA的提取和cDNA的合成方法参考实施例1。
二、实时萦光定量PCR
根据AcSWI3B CDS序列设计区分小麦SWI3B同源基因序列的特异引物，采用实时萦光定量法对AcSWI3B基因的时空表达特异性和组织表达特异性进行分析。
具体步骤如下：用北京全式金生物技术有限公司TransStart Top Green qPCRSuperMix(+Dye I)试剂盒进行反应，反应体系如表5所示。
表5实时萦光定量PCR反应体系
Figure BDA0003617215290000091
反应过程包括：94℃，30s；94，5s，58℃，15s，72℃，34s，共40个循环，以小麦Actin作为内参，计算方法采用2-ΔΔCT法。采用美国ABI公司的Step one plus实时萦光定量PCR仪进行检测。
时空表达特异性分析结果显示(图2的A)，AcSWI3B基因在雌雄蕊分化期表达量最高；组织表达特异性结果显示(图2的B)，AcSWI3B基因在小花分化期的幼穗中表达量最高。
实施例3AcSWI3B基因的亚细胞定位
1、重组表达载体的构建
(1)AcSWI3B基因片段粘性末端的引入
使用一对包含BamHI限制性酶切位点的引物(F:5’-TATCTCTAGAGGATCCATGGCCACACCGCC-3’，R:5’-TGCTCACCATGGATCCACTCGTGGTGATAAT-3’)扩增AcSWI3B基因CDS，引入BamHI粘性末端。
(2)表达载体线性化
选用pJIT16318hGFP载体，用BamHI限制性酶(Thermo Fisher)进行酶切，酶切体系如表6所示。
表6 pJIT16318hGFP酶切体系
Figure BDA0003617215290000092
37℃水浴，酶切40min，用2％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，并回收载体骨架，回收方法同上。
(3)连接与转化
采用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara)将步骤(1)得到的扩增产物与步骤(2)得到的载体骨架进行连接，连接体系如表7所示。
表7 In-Fusion HD连接体系
Figure BDA0003617215290000101
将连接产物用热激法转化入Trans 10菌株(全式金)，37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序。测序结果表明，该质粒为将SEQ ID NO.1所示的DNA片段插入pJIT16318hGFP载体的BamHI酶切位点间得到的载体，并将该质粒载体命名为pJIT16318hGFP-AcSWI3B。
2、亚细胞定位
将阳性质粒用PEG介导法转化入小麦原生质体，避光培养约12h，用Zeiss LSM 700(德国)共聚焦显微镜观察原生质体中GFP的萦光信号，用ZEN 2010软件获取图片。具体操作步骤如下：
(1)培养小麦幼苗，约一周左右大小时进行试验；
(2)配制15mL酶解液，酶解液配方如表8所示。
表8酶解液配制体系
Figure BDA0003617215290000102
配制好后，55℃水浴10min，冷却至室温后加入1mL 0.15M的CaCl2溶液和1mL0.1％的BSA溶液；
(3)将叶片切成约0.5mm宽的细条，使其完全浸没于酶解液中；
(4)抽真空30min；
(5)室温下，在转速为50rpm的摇床上避光酶解3h左右，使细胞壁充分裂解；
(6)加入等体积预冷的W5溶液，轻轻摇晃，使原生质体释放出来；
(7)用100目的筛子过滤原生质体至50mL离心管中；
(8)转速100g，加速度为1，离心2min；
(9)弃上清，用预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体，W5溶液的量根据原生质体的量而定。重悬后于冰上静置30min。W5溶液配方如表9所示；
表9 W5溶液配制体系
Figure BDA0003617215290000103
Figure BDA0003617215290000111
配制好后用KOH溶液调pH至5.8，高温、高压灭菌20min，室温保存；
(10)转速100g，加速度为1，离心2min；
(11)弃上清，用400μL MMG溶液轻柔重悬原生质体。MMG溶液的配制方法如表10所示；
表10 MMG溶液配制体系
Figure BDA0003617215290000112
配制好后用KOH调pH至5.6，高温、高压灭菌20min，室温保存；
(12)取浓度约1000ng/μL的质粒10μL于2.0mL EP管中，加入100μL原生质体，轻弹混匀；
(13)加入110μL PEG4000溶液并迅速轻弹混匀，室温，避光诱导30min。PEG4000溶液的配制方法如表11所示；
表11 PEG4000溶液配制体系
Figure BDA0003617215290000113
(14)加入两倍体积的W5溶液终止反应，转速100g，加速度为1，离心1min；
(15)弃上清，加入200μL的W5溶液轻柔混匀，置于23℃培养箱中避光培养16-18h；
(16)在激光共聚焦显微镜下观察绿色萦光信号。
AcSWI3B基因的亚细胞定位结果如图3所示，AcSWI3B基因位于细胞核中。
实施例4转AcSWI3B小麦的获得及其小穗粒数、穗粒数调查
一、转AcSWI3B小麦的获得
1、重组表达载体的构建
(1)AcSWI3B基因片段粘性末端的引入
使用一对包含Sac I限制性酶切位点的引物AcSWI3B-CUB-Sac I-F和AcSWI3B-CUB-Sac I-R扩增AcSWI3B基因CDS，用1％琼脂糖凝胶分离PCR产物并进行回收，得到引入Sac I粘性末端的基因片段。引物序列如下：AcSWI3B-CUB-Sac I-F：5'-CGAGCTCATGGCCACACCGCCGGCC-3'；AcSWI3B-CUB-Sac I-R：5'-CGAGCTCTTAGCTAGACTACAATGTTATC-3'。
(2)表达载体线性化
表达载体选用pCAMBIA3300，用限制性内切酶Sac I(Thermo Fisher)进行酶切，酶切体系如表12所示。
表12 pCAMBIA3300酶切体系
Figure BDA0003617215290000114
Figure BDA0003617215290000121
37℃水浴，酶切40min，用2％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，并回收载体骨架，回收方法同上。
(3)连接与转化
采用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara)，将步骤(1)得到的扩增产物和步骤(2)得到的载体骨架进行连接，连接体系如表13所示。
表13 In-Fusion HD连接体系
Figure BDA0003617215290000122
将连接产物用热激法转化入Trans 10菌株(全式金公司，北京)，37℃过夜培养，挑取单克隆进行测序。测序结果表明，该质粒为将SEQ ID NO.1所示的DNA片段插入pCAMBIA3300载体的Sac I酶切位点间得到的载体，并将该质粒载体命名为pCAMBIA3300-AcSWI3B。
2、重组菌的构建
将步骤1获得的重组质粒pCAMBIA3300-AcSWI3B通过冻融法导入农杆菌EHA105菌株(博迈德)，得到重组农杆菌，用载体通用引物和基因特异引物对重组菌进行阳性检测，检测结果显示该重组菌为阳性重组农杆菌，并将其命名为EHA105/pCAMBIA3300-AcSWI3B。
3、转AcSWI3B小麦的获得
转基因小麦的获取采用农杆菌介导法，具体方法参考Ding等的研究方法(Ding etal.2009)。
(1)将重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3300-AcSWI3B接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；
(2)将步骤(1)获得的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml利福平及卡那霉素)中，28℃、300rpm培养约14小时，使菌液OD600达到1.5-3.0；
(3)收集步骤(2)获得的菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为1.0；
(4)超净工作台内，用1ml注射器针头挑取农杆菌菌落，注射受体小麦Fielder幼胚，然后将注射后的幼胚在无菌、高湿条件下培养，组织培养至小麦幼苗长出，将幼苗移至营养土中继续培养至成熟，收获T0代转AcSWI3B小麦种子。
4、转基因小麦阳性检测
取T0代转基因小麦叶片，液氮速冻，用植物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)提取基因组DNA，根据pCAMBIA3300载体多克隆位点两端序列和AcSWI3B基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，通过电泳检测阳性目的条带，每次检测都设置受体阴性对照，避免假阳性条带出现。
二、转AcSWI3B过表达小麦的小穗粒数、穗粒数调查
1、种子处理
将编号为AcSWI3B-1、AcSWI3B-2和AcSWI3B-3的T0代种子繁殖至T3代进行表型鉴定，受体Fielder种子和过表达转基因小麦种子每株系取10粒种子，先用1％的双氧水4℃低温处理1天，再换水4℃处理3天，使种子发芽一致。
2、表型鉴定
将处理后的小麦种子种入营养土中，在正常生长条件(22℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度70％)下生长，期间观察表型变化。成熟后调查株高、有效分蘖数、小穗数、小穗粒数、穗粒数、千粒重等农艺性状。试验重复3次，以保证试验结果可靠性。
实验结果如图4所示。结果表明，在正常生长条件下，转基因小麦小穗粒数较对照显著增加，其中AcSWI3B-1株系增加0.45粒，AcSWI3B-2株系增加0.75粒，AcSWI3B-3株系增加0.92粒。转基因小麦株系AcSWI3B-1和AcSWI3B-2穗粒数也较对照显著增加，其中，AcSWI3B-1株系增加9.95粒；AcSWI3B-2株系增加11.33粒。AcSWI3B-3株系穗粒数较对照增加8.00粒，但未达到显著性水平。
实施例5AcSWI3B基因特异分子标记的开发及其应用
针对冰草AcSWI3B基因的序列以及小麦基因组的序列，本发明设计了能够区分小麦基因组和冰草AcSWI3B基因的特异分子标记AcSWI3B-1和AcSWI3B-2，其中，特异分子标记AcSWI3B-1的序列如SEQ ID NO.3所示，AcSWI3B-2的序列如SEQ ID NO.4所示。这两个分子标记均在冰草基因组6PS上，分子标记AcSWI3B-1位于AcSWI3B基因第二内含子内，片段大小为1015bp，AcSWI3B-2位于AcSWI3B基因第四内含子内，片段大小为284bp。
此外，本发明设计了能够区分小麦基因组和冰草AcSWI3B基因的特异性引物，其中，SEQ ID NO.5-6所示的引物用于扩增特异分子标记AcSWI3B-1，SEQ ID NO.7-8所示的引物用于扩增特异分子标记AcSWI3B-2。
利用上述特异分子标记和特异性引物检测小麦-冰草渗入系等待测植株，具体方法如下：
(1)提取待测植株的DNA：采用常规CTAB法提取小麦-冰草渗入系等待测植株的基因组DNA；
(2)PCR：采用高保真酶Primerstar(Taraka)，以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，分别采用SEQ ID NO.5-6所示的引物和SEQ ID NO.7-8所示的引物进行PCR扩增，扩增体系如表2所示；
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，引物在57℃复性15s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
(3)检测：采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，将10μL PCR产物和1μL 10×的上样缓冲液混合点样，电压120V，电泳15min成像。
电泳检测结果如图5、图6所示，AcSWI3B-1和AcSWI3B-2为冰草AcSWI3B基因特异标记，可用于小麦-冰草渗入系材料中AcSWI3B基因的检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种调控植物穗粒数的蛋白AcSWI3B及其编码基因与应用
<130> KHP221113174.2
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccacac cgccggcccc ggtgcccccg gccaccgcca actccgcgcc gacgcctgcg 60
cagtcaccgt tcaaggcgcc acccttctcc cagcccccgt ccactgccgg taccctcaag 120
acggagatcc ctcccgcctc cacctcggcc gccaccgccg ccggagtcgc cgcagccgag 180
gactcatcgc acgtcatcac cgtccctagc tactcagggt ggttctcgta cgacagcatc 240
agcgacacgg agcgccgcct gttgccggag ttcttcgaag gggaggtcgc ggccgtctct 300
gggtcccggg gcccggaagc ctacaagtac taccgcaaca ccctcgtcaa gaggttccgg 360
gcaaggccag cgcggcggct cacgctcacc gaggccaggc ggggccttat cggcgacgtt 420
ggctctgtgc gccgtgtgtt tgacttcctg gaggaatggg ggctcatcaa ccatggtgct 480
cccccgctgg gggcgaagca ggggaaagac aagagggagg aggcgacgac ttctcagtct 540
tcattgcctg ctggaccaac cacacccaag aagctctgtg tagggtgccg cagcgtctgc 600
ggctctgcct atttcacctg cgagaaggcg gatataagca tatgttgtag atgctttgtg 660
cgtggcaact atcggcctgg tcttactcca gcggacttca agaaagttga aattaccgaa 720
gacgccaaat cagattggac agacaaggaa actcttcacc tacttgaggc tgtcttgcat 780
tatggagaag actggaagag ggtttctgaa catgttggta gtcgctcaga gaaagactgc 840
attgctagac tcatccgatt atcttttgga gaacagttca tgggatccaa ggagcagaaa 900
atggagtttg agattgatga tgatgttact aatgaatcta gagcagagat cccaaaacga 960
ctccgtctca caccactggc agatgcaagc aatccaatta tggctcaggt cgcgttcttg 1020
tccgcaattg ttggctcagg cgttgcggca gcagcagcgc aagcagctat ttctgcacaa 1080
tcccaggttg atatgaatga cagccagact gattctccaa tcagcagcac taaggaagaa 1140
gaatcttctt acactaatgg actttcagcc aacgatttac tcaaagaggc atccacaaat 1200
gcacaagtgc aacttcaaaa ggagcaaaaa gatatagagc aatctttatc ggccatagtg 1260
gatgtccaga tgaaggaaat ccaggataag ataagccgtt ttgagcagaa agagctgctg 1320
atggagaaag agagggagca gctccatcac ttgcgggaac tgcttttcgt ggatcaactc 1380
gcggttgtgc agcatcagcg cagaccgcat gctgtagccg ctgagaacaa ggaagaggag 1440
aaaccgagac ctattatcac cacgagttaa 1470
<210> 2
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Thr Pro Pro Ala Pro Val Pro Pro Ala Thr Ala Asn Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Gln Ser Pro Phe Lys Ala Pro Pro Phe Ser Gln Pro
20 25 30
Pro Ser Thr Ala Gly Thr Leu Lys Thr Glu Ile Pro Pro Ala Ser Thr
35 40 45
Ser Ala Ala Thr Ala Ala Gly Val Ala Ala Ala Glu Asp Ser Ser His
50 55 60
Val Ile Thr Val Pro Ser Tyr Ser Gly Trp Phe Ser Tyr Asp Ser Ile
65 70 75 80
Ser Asp Thr Glu Arg Arg Leu Leu Pro Glu Phe Phe Glu Gly Glu Val
85 90 95
Ala Ala Val Ser Gly Ser Arg Gly Pro Glu Ala Tyr Lys Tyr Tyr Arg
100 105 110
Asn Thr Leu Val Lys Arg Phe Arg Ala Arg Pro Ala Arg Arg Leu Thr
115 120 125
Leu Thr Glu Ala Arg Arg Gly Leu Ile Gly Asp Val Gly Ser Val Arg
130 135 140
Arg Val Phe Asp Phe Leu Glu Glu Trp Gly Leu Ile Asn His Gly Ala
145 150 155 160
Pro Pro Leu Gly Ala Lys Gln Gly Lys Asp Lys Arg Glu Glu Ala Thr
165 170 175
Thr Ser Gln Ser Ser Leu Pro Ala Gly Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu
180 185 190
Cys Val Gly Cys Arg Ser Val Cys Gly Ser Ala Tyr Phe Thr Cys Glu
195 200 205
Lys Ala Asp Ile Ser Ile Cys Cys Arg Cys Phe Val Arg Gly Asn Tyr
210 215 220
Arg Pro Gly Leu Thr Pro Ala Asp Phe Lys Lys Val Glu Ile Thr Glu
225 230 235 240
Asp Ala Lys Ser Asp Trp Thr Asp Lys Glu Thr Leu His Leu Leu Glu
245 250 255
Ala Val Leu His Tyr Gly Glu Asp Trp Lys Arg Val Ser Glu His Val
260 265 270
Gly Ser Arg Ser Glu Lys Asp Cys Ile Ala Arg Leu Ile Arg Leu Ser
275 280 285
Phe Gly Glu Gln Phe Met Gly Ser Lys Glu Gln Lys Met Glu Phe Glu
290 295 300
Ile Asp Asp Asp Val Thr Asn Glu Ser Arg Ala Glu Ile Pro Lys Arg
305 310 315 320
Leu Arg Leu Thr Pro Leu Ala Asp Ala Ser Asn Pro Ile Met Ala Gln
325 330 335
Val Ala Phe Leu Ser Ala Ile Val Gly Ser Gly Val Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Gln Ala Ala Ile Ser Ala Gln Ser Gln Val Asp Met Asn Asp Ser
355 360 365
Gln Thr Asp Ser Pro Ile Ser Ser Thr Lys Glu Glu Glu Ser Ser Tyr
370 375 380
Thr Asn Gly Leu Ser Ala Asn Asp Leu Leu Lys Glu Ala Ser Thr Asn
385 390 395 400
Ala Gln Val Gln Leu Gln Lys Glu Gln Lys Asp Ile Glu Gln Ser Leu
405 410 415
Ser Ala Ile Val Asp Val Gln Met Lys Glu Ile Gln Asp Lys Ile Ser
420 425 430
Arg Phe Glu Gln Lys Glu Leu Leu Met Glu Lys Glu Arg Glu Gln Leu
435 440 445
His His Leu Arg Glu Leu Leu Phe Val Asp Gln Leu Ala Val Val Gln
450 455 460
His Gln Arg Arg Pro His Ala Val Ala Ala Glu Asn Lys Glu Glu Glu
465 470 475 480
Lys Pro Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ser
485
<210> 3
<211> 1015
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catttcaggt tatgtaatat gtgcatcatt tgtagtatct ggttagaact atcttagctc 60
atccatatga gtatttccaa ttggctatag cgacctgttt gggttttgtg ccattataaa 120
aagcactaca ttaagccgca aattatggct attcatatta tttatgcaat gtcattgggg 180
gaacgggttt tttttttaac aaggggaaaa cccctggttt cattaccaga aatcaaagca 240
gttcagtaca acgaaagtaa acaggaaagt aactggtaca caggccagaa gataagtaag 300
gaaagaaaac aaaaggcaat gtctaccagc aaaccagcga tgtggaaaac agaatatcct 360
atacagcaac cttacaaact accatacaca agccagtgaa aagcacagcc acaagcaaaa 420
ctgtccgcac cgcctcacaa acactgtgct ggatctagtg ttcggttaac tgaatccgcc 480
acattagtaa gttcaatgtg ctcacgcaag tccctaaccg cttcccaaat ctccaaaatc 540
ttgccagtta aagttcttct aaacctgaca ccatcccaac ctatcctgat atcttcaacg 600
tccaggcaga tcttgtaaag ggttcttaat ctgatagaga aagccactgg ggtagcgttt 660
gttcgctagt tatgagttta ccgatgtgtt gagaaatttg tgtgctcgga ttggagatat 720
tcctggttga tcgttggttt tggcttagct ggtttgatat gtgccataga aagggcgctg 780
ggacagatga gcaaacagat aacctaatgg tgtatctttt gttttgggaa ctggtaattg 840
catatgtatg tatacagttg cttataaatt taagtcaagt gtacttgctc ttcatatgaa 900
tattgtattg tcaagctttt gttttcattt gtactgtact actgtgtctt tgcccattgc 960
cactcttgga ttgactgtgt tagatggatt agcaggacta ttctacagct cattt 1015
<210> 4
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgacatctt ctgtcttatt aatgtttgca ttgttgatga acatactgct ttgtgtgtcg 60
ctgtgcaaac aatgataatt tgacgggtgt ggtaacaaga gtgctcaagt aacgcgctgg 120
gctgtggggg tgccagtccc ctaactctgt agggtcaaat acatggttgt tatcaataaa 180
tttcacataa ttgtttttac atgaatgcgt acatgtattt gatagttttg ctacatttca 240
cataattcac tactggcgcc gggagcaata agataggtca taat 284
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catttcaggt tatgtaatat gtgca 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatgagctg tagaatagtc ctgc 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgacatctt ctgtcttatt aatgt 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaccgatta tgacctatct tat 23
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatctctaga ggatccatgg ccacaccgcc 30
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgctcaccat ggatccactc gtggtgataa t 31
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgagctcatg gccacaccgc cggcc 25
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgagctctta gctagactac aatgttatc 29

Claims (10)

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为以下(1)-(3)中的任意一种：
(1)具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)具有在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签序列得到的氨基酸序列；
(3)具有与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少75％的同源性的氨基酸序列且与(1)具有同等活性。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为以下A1)至A12)中的任意一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为以下(1)-(3)中的任一种：
(1)序列如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或编码序列如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子的基因组DNA分子；
(2)与(1)所述cDNA分子或基因组DNA分子的核苷酸序列具有至少75％同源性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)所述cDNA分子或基因组DNA分子的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料的以下任一种应用：
(1)在调控植物小穗粒数和/或穗粒数中的应用；
(2)在调控植物穗形中的应用；
(3)在培育多小穗粒数和/或多穗粒数的转基因植物中的应用；
(4)在植物育种中的应用；
(5)在植物种质资源改良中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过提高植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，增加植物的小穗粒数和/或穗粒数。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦。
7.一种培育多小穗粒数、多穗粒数的转基因小麦的方法，其特征在于，所述方法包括提高受体小麦中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因小麦的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提高受体小麦中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性通过将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体小麦中实现。
9.特异分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示；
或者，所述分子标记为由核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物扩增得到的DNA分子；
或者，所述分子标记由核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增得到的DNA分子。
10.权利要求9所述的特异分子标记在检测小麦背景下权利要求1所述的蛋白质的编码基因中的应用，其特征在于，所述应用包括：以待测植株的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物进行PCR，根据PCR产物判断所述待测植株中是否含有权利要求1所述的蛋白质的编码基因。
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CN110804623A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaMADS6基因在调控植物穗和籽粒发育以及开花时间中的应用

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