CN115069179A - 一种抗菌海藻酸钙微球及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物材料技术领域，具体公开了一种抗菌海藻酸钙微球及其制备与应用。所述抗菌海藻酸钙微球的制备方法包括：将S‑亚硝基‑N‑乙酰基‑D‑青霉胺(SNAP)掺杂到海藻酸钙微球中，制得所述抗菌海藻酸钙微球。本发明通过海藻酸钠溶液与氯化钙溶液按一定比例制得海藻酸钙微球，并将不同质量的S‑亚硝基‑N‑乙酰基‑D‑青霉胺(SNAP)掺杂到海藻酸钙微球中，制得SNAP掺杂的海藻酸钙微球，从而赋予海藻酸钙微球抗菌效果。
Description
技术领域
本申请涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种抗菌海藻酸钙微球及其制备与应用。
背景技术
海藻酸钠是从海洋褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)按β-1,4-糖苷键聚合而成的天然高分子多糖材料。由于海藻酸钠本身的无毒性和优异的生物相容性，早在20世纪就被美国FDA批准为生物安全性材料。然而，当前市场上含银海藻酸纤维在使用过程中存在着严重的银离子泄露问题。因此，开发非银离子抗菌性能海藻酸纤维对海藻酸钠的利用意义重大。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗菌海藻酸钙微球及其制备与应用，用于解决上述技术问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种抗菌海藻酸钙微球的制备方法，包括：
将S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine,SNAP)掺杂到海藻酸钙微球中，制得所述抗菌海藻酸钙微球。
进一步，所述抗菌海藻酸钙微球中S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)的质量百分含量为0～45％(不包括0)，优选为0.1％～45％，更优选为15％～45％。
进一步，所述抗菌海藻酸钙微球的制备方法包括如下步骤：
(1)将S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)加入到海藻酸钠(SA)溶液中，搅拌得SA-SNAP溶液；
(2)将步骤(1)所得SNAP溶液滴加到氯化钙溶液中，搅拌反应，然后件所得产物冷冻干燥，得到所述抗菌海藻酸钙微球。
进一步，所述步骤(1)中，将海藻酸钠固体加入水中，搅拌使其完全溶解，制得所述海藻酸钠溶液。
进一步，所述步骤(1)中，所述海藻酸钠溶液的浓度为0.01～0.05g/mL，优选为0.02～0.04g/mL，更优选为0.02g/mL。
进一步，所述步骤(1)中，所述S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)加入到海藻酸钠溶液中，于室温下搅拌5～10分钟得所述SA-SNAP溶液。
进一步，所述步骤(2)中，所述氯化钙溶液由氯化钙加入水中配制而成。
进一步，所述步骤(2)中，所述氯化钙溶液的浓度为0.05～0.5g/mL，优选为0.1～0.2g/mL，更优选为0.15g/mL。
进一步，所述步骤(2)中，用注射器吸取SA-SNAP溶液，然后滴加至氯化钙溶液中，搅拌进行反应。
进一步，所述步骤(2)中，SA-SNAP溶液的滴加速度为1mm/min。
进一步，所述步骤(2)中，采用不同尺寸的注射器针头，制得不同尺寸的抗菌海藻酸钠微球。
进一步，所述步骤(1)和(2)中，搅拌方式均采用磁力搅拌，反应均在室温下进行。
本发明第二方面提供一种抗菌海藻酸钙微球，由S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)掺杂到海藻酸钙微球中制得。
进一步，所述抗菌海藻酸钙微球中S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)的质量百分含量为0～45％(不包括0)，优选为0.1％～45％，更优选为15％～45％。
进一步，所述抗菌海藻酸钙微球根据第一方面所述的方法制备而得。
本发明第三方面提供第二方面所述的抗菌海藻酸钙微球在作为生物安全性材料中的应用。
如上所述，本发明的抗菌海藻酸钙微球及其制备与应用，具有以下有益效果：
本发明通过海藻酸钠溶液与氯化钙溶液按一定比例制得海藻酸钙微球，并将不同质量的S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)掺杂到海藻酸钙微球中，制得SNAP掺杂的海藻酸钙微球，从而赋予海藻酸钙微球抗菌效果。
本发明提供的抗菌海藻酸钙微球制备工艺简单，且抗菌效果好，适用于工业化生产。
附图说明
图1显示为不同质量百分含量(0％、15％、30％、45％)SNAP的抗菌海藻酸钙微球的红外表征图；
图2显示为不同质量百分含量(图中的曲线从上至下依次代表0％、15％、30％、45％)SNAP的抗菌海藻酸钙微球的热重表征图；
图3显示为不同质量百分含量(0％、15％、30％、45％)SNAP的抗菌海藻酸钙微球的X射线衍射图；
图4显示为不同质量百分含量(0％、15％、30％、45％)SNAP的抗菌海藻酸钙微球对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌效果；
图5显示为不同质量百分含量(0％、15％、30％、45％)SNAP的抗菌海藻酸钙微球对大肠杆菌(e.coli)的抗菌效果；
图6显示为不同尺寸、不同浓度SNAP的抗菌海藻酸钙微球的NO释放量。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种抗菌海藻酸钙微球，通过海藻酸钠溶液与氯化钙溶液按一定比例制得海藻酸钙微球，并将不同质量的S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)掺杂到海藻酸钙微球中，赋予海藻酸钙微球抗菌效果。
本发明的设计思路为：
S-亚硝基硫醇是一种NO供体，S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)的NO损失产物是N-乙酰基-L-青霉胺(NAC)，它在低浓度下无毒水平。除此之外，青霉胺本身(从N-乙酰-L-半胱氨酸失去乙酸酯基团后)也被美国食品药物管理局(FDA)批准用于逆转重金属离子中毒。因此，SNAP可以作为一种优良的NO供体。
NO在常温下为气体，具有脂溶性是使它在人体内成为信使分子的可能因素之一。它不需要任何中介机制就可快速扩散通过生物膜，将一个细胞产生的信息传递到它周围的细胞中，主要影响因素是它的生物半寿期。具有多种生物功能的特点在于它是自由基，极易参与与传递电子反应，加入机体的氧化还原过程中。分子的配位性又使它与血红素铁和非血红素铁具有很高的亲合力，以取代O2和CO2的位置。NO可以产生于人体内多种细胞。如当体内内毒素或T细胞激活巨噬细胞和多形核白细胞时，能产生大量的诱导型NOS和超氧化物阴离子自由基，从而合成大量的NO和H2O2，这在杀伤入侵的细菌、真菌等微生物和肿瘤细胞、有机异物及在炎症损伤方面起着十分重要的作用。经激活的巨噬细胞释放的NO可以通过抑制靶细胞线粒体中三羧酸循环、电子传递细胞DNA合成等途径，发挥杀伤靶细胞的效应。
本发明的抗菌海藻酸钙微球的制备方法包括如下步骤：
(1)将S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)加入到海藻酸钠溶液中，搅拌得SA-SNAP溶液；
(2)将步骤(1)所得SNAP溶液滴加到氯化钙溶液中，搅拌反应，然后件所得产物冷冻干燥，得到抗菌海藻酸钙微球。
可选地，步骤(1)中，将海藻酸钠固体加入水中，搅拌使其完全溶解，制得海藻酸钠溶液。
可选地，步骤(1)中，海藻酸钠溶液的浓度为0.01～0.05g/mL，优选为0.02～0.04g/mL，更优选为0.02g/mL。
可选地，步骤(1)中，S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)加入到海藻酸钠溶液中，于室温下搅拌5～10分钟得SA-SNAP溶液。
可选地，步骤(2)中，氯化钙溶液由氯化钙加入水中配制而成。
可选地，步骤(2)中，氯化钙溶液的浓度为0.05～0.5g/mL，优选为0.1～0.2g/mL，更优选为0.15g/mL。
可选地，步骤(2)中，用注射器吸取SA-SNAP溶液，然后滴加至氯化钙溶液中，搅拌进行反应。
可选地，步骤(2)中，SA-SNAP溶液的滴加速度为1mm/min。
可选地，步骤(2)中，采用不同尺寸的注射器针头，可以制得不同尺寸的抗菌海藻酸钠微球。
可选地，步骤(1)和(2)中，搅拌方式均采用磁力搅拌，反应均在室温下进行。
下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
本实施例中抗菌海藻酸钙微球的制备方法步骤如下：
称取海藻酸钠(0.2011g)固体加入到H2O(10.0mL)中，磁力搅拌0.5h至完全溶解。
称取SNAP(质量比为15％)加入到海藻酸钠溶液中，并进行磁力搅拌五分钟，得到SA-SNAP溶液。
称取CaCl2(1.50g)固体加入到H2O(10.0mL)中制成CaCl2溶液，用注射器吸取约10mL SA-SNAP溶液以1mm/min的速度缓慢滴入CaCl2溶液中，并不断进行磁力搅拌，将所得产物进行冷冻干燥，得到抗菌海藻酸钙微球。
实施例2
本实施例中抗菌海藻酸钙微球的制备方法步骤如下：
称取海藻酸钠(0.2011g)固体加入到H2O(10.0mL)中，磁力搅拌0.5h至完全溶解。
称取SNAP(质量比为30％)加入到海藻酸钠溶液中，并进行磁力搅拌五分钟，得到SA-SNAP溶液。
称取CaCl2(1.50g)固体加入到H2O(10.0mL)中制成CaCl2溶液，用注射器吸取约10mL SA-SNAP溶液以1mm/min的速度缓慢滴入CaCl2溶液中，并不断进行磁力搅拌，将所得产物进行冷冻干燥，得到抗菌海藻酸钙微球。
实施例3
本实施例中抗菌海藻酸钙微球的制备方法步骤如下：
称取海藻酸钠(0.2011g)固体加入到H2O(10.0mL)中，磁力搅拌0.5h至完全溶解。
称取SNAP(质量比为45％)加入到海藻酸钠溶液中，并进行磁力搅拌五分钟，得到SA-SNAP溶液。
称取CaCl2(1.50g)固体加入到H2O(10.0mL)中制成CaCl2溶液，用注射器吸取约10mL SA-SNAP溶液以1mm/min的速度缓慢滴入CaCl2溶液中，并不断进行磁力搅拌，将所得产物进行冷冻干燥，得到抗菌海藻酸钙微球。
对比例1
本对比例中海藻酸钙微球的制备方法步骤如下：
称取海藻酸钠(0.2011g)固体加入到H2O(10.0mL)中，磁力搅拌0.5h至完全溶解，得到SA溶液。
称取CaCl2(1.50g)固体加入到H2O(10.0mL)中制成CaCl2溶液，用注射器吸取约10mL SA溶液以1mm/min的速度缓慢滴入CaCl2溶液中，并不断进行磁力搅拌，将所得产物进行冷冻干燥，得到海藻酸钙微球。
将实施例1-3制得的抗菌海藻酸钙微球及对比例1中制得的海藻酸钙微球进行红外、热重、X射线衍射表征，结果分别如图1、图2、图3所示。
从图1可知，对于所有海藻酸钙微球，在大约3427cm-1处观察到宽的-OH带；C＝O的伸缩振动峰约为1631cm-1；O-H在δ平面的伸缩振动峰约为1436cm-1。此外，在指纹区561cm-1处可以观察到一个非常明显的宽峰，这是由于海藻酸钠和钙离子交联产生的峰。SNAP的特征峰分别在1327cm-1和1248cm-1。纯海藻酸钙没有这两个特征峰。在Alg-45-1的红外光谱中，可以清楚地观察到在1307cm-1和1228cm-1处有两个明显的特征峰。SNAP加载到海藻酸钙微球中使特征峰蓝移。但Alg-15和Alg-30的红外光谱与Alg-45-1相比，SNAP的两个特征峰并不明显，可能是因为Alg-15和Alg-30中加载的SNAP量很低，低于红外检测线，导致无法检测到SNAP的特征峰。
为了研究海藻酸钙微球和负载SNAP的海藻酸钙微球的热稳定性，对海藻酸钙微球和负载SNAP的海藻酸钙微球进行了热力学分析。如图2所示，对于Alg样品(Alg指代海藻酸钙微球，是对空白样品的命名)，从DTG图像可以看出，在187.8℃时质量损失率最大。具体而言，由于海藻酸钙微球中结合水的损失，在25℃和174℃之间的质量损失为7.829％。在174℃和253℃之间，质量迅速下降了17.522％。DSC曲线中出现一个尖锐的放热峰。这个过程是海藻酸钙裂解成相对稳定的中间产物，对应海藻酸钙骨架的断裂，相邻的羟基以水分子的形式被去除。质量在253℃和700℃之间缓慢损失13.177％。在此过程中，中间产物进一步分解，脱羧生成CO2，产物碳化。对于Alg-15样品，DSC曲线中有三个尖锐的放热峰。质量损失率在188℃时最大。并且在100℃和289℃处有两个较小的放热峰。具体来说，质量在157℃和251℃之间迅速下降了20.041％。并且在25℃～127℃之间有一个小峰，质量损失为26.52％。这是因为除了海藻酸钙失去结合水外，SNAP还分解成中间产物以释放NO。在251℃和333℃之间还有一个小峰，质量损失为5.726％。这是因为中间产物继续分解和碳化。333℃～700℃损失4.999％后质量保持不变。对于Alg-30样品，DSC曲线中有三个尖锐的放热峰。质量损失率在164℃时最大。并且在76℃和288℃处有两个较小的放热峰。具体来说，质量在113℃和234℃之间迅速下降了17.751％。海藻酸钙裂解成相对稳定的中间产品。在25℃～113℃之间有一个小峰，质量损失为10.241％。这是因为除了海藻酸钙失去结合水外，SNAP还分解成中间产物以释放NO。在234℃和335℃之间还有一个小峰，质量损失为8.03％。这是因为中间产物继续分解和碳化。在335℃和700℃之间质量损失4.914％后，质量保持不变。对于Alg-45-1样品，DSC曲线中有四个尖锐的放热峰。质量损失率在86℃时最大。并且在151℃和286℃处有两个较小的放热峰。具体来说，在25℃到131℃之间，质量迅速下降了34.325％。这个样本的SNAP负载比较大。除了海藻酸钙失去结合水外，SNAP还会分解成中间产物，所以在这个温度范围内会损失很多质量。在131℃～236℃之间有一个小峰，质量损失为13.291％。海藻酸钙裂解成相对稳定的中间产品。在236℃和322℃之间还有一个小峰，质量损失为7.027％。这是因为中间产物继续分解和碳化。在322℃和700℃之间质量损失4.964％后，质量保持不变。从TG图中也可以看出，样品Alg-45-1的负载最大，样品Alg-15的负载最小。
从图3可知，单纯的海藻酸钙微球没有形成晶体结构。加入不同含量的SNAP后，发现SNAP晶体的特征峰没有出现，说明SNAP在微球中不以晶体形式存在。
用金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(e.coli)测试实施例1-3制得的抗菌海藻酸钙微球及对比例1中制得的海藻酸钙微球的抗菌效果，实验方法为：
按配方在1L烧杯中配置500mL固体培养基，在电磁炉中加热至沸腾，倒入500mL锥形瓶中，用多孔膜密封，用橡皮筋固定。用报纸包好，用橡皮筋固定。然后将50mL液体培养基置于100mL锥形瓶中，同样密封。然后将移液器吸头放入高压灭菌器中灭菌约1.5h。
将消毒后的培养皿放在靠近火焰的桌子上，右手拿着装有培养基的锥形瓶，使瓶口快速穿过火焰。用左手的拇指和食指打开一个比瓶口稍大的缝隙，用右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中，并立即用你的手盖住培养皿的盖子。左手。等待盘子冷却凝固，大约5-10分钟，然后将盘子倒置，使盘子的盖子在底部，盘子的底部在顶部。
将接种环放在火焰上燃烧，直到接种环呈红色。用火焰冷却接种环，打开装有菌液的试管的棉塞。将试管口穿过火焰，将冷却的接种环伸入菌液中，浸一圈菌液。再次将试管口穿过火焰，塞上棉塞。左手打开盘子盖之间的缝隙，右手迅速将沾有细菌的接种环伸入盘中，画三至五条平行线，盖上盖子。烧掉接种环，待其冷却后，从第一区划线末端开始划线至第二区划线。重复上述操作，在第三、四、五区域划线。注意不要将最后一个区域的虚线连接到第一个区域。将板倒置，放入生化培养箱中，直至单个菌落生长。用采摘环将单个菌落挑选到液体培养基中，然后将它们放入振荡器中进行激活。按上述方法分别激活金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
用移液管将培养的菌液加入12孔板的孔中，每孔加入2mL。分别加入0％、15％、30％、45％抗菌海藻酸钙微球50mg，每组做两次实验，将孔板放入生化培养箱中24小时。
稀释菌液，42孔板有四列。将4.95mL的PBS添加到第一列，将4.5mL的PBS添加到2.3.4列。在第一列中，4.95毫升的PBS加上0.05毫升的原始细菌溶液。(稀释100倍)，将0.5mL的第一种细菌溶液添加到第二列中的4.5mL PBS中。(稀释103倍)，将0.5mL的第二列菌液加入到4.5mL PBS的第三列中。(稀释104倍)，第四列4.5mL PBS加第三列菌液0.5mL。(稀释105倍)。每个孔都需要在菌液转移前后重新悬浮，以防止细菌混合不均匀或残留在移液器吸头中，造成错误。
在固体培养基上标注序列号和稀释倍数，每个序列涂3个固体培养基，分别为103次、104次和105次。取稀释后的菌液50uL，滴入相应固体培养基的中心，用一次性涂棒涂抹均匀。倒置，放入生化培养箱15小时左右。观察实验结果。
结果如图4和图5所示。从图4和图5可知，实施例1-3制得的抗菌海藻酸钙微球的抗菌效果优于对比例1中制得的海藻酸钙微球的抗菌效果，且随着SNAP含量的提高，抗菌海藻酸钙微球的抗菌效果也逐渐提升。
将实施例1-3制得的抗菌海藻酸钙微球进行NO释放实验，测定NO释放量，实验方法为：
称取5个抗菌海藻酸钙微球，置于棕色反应瓶中的海绵上。向反应瓶中加入2mlPBS缓冲液，保持海绵湿润，使海藻酸钙微球吸水膨胀而不溶解。将反应瓶置于37℃水浴中孵育。NO释放量由NO Analyzer(Thermo Scientific Model 42i，美国)测量。反应烧瓶中释放的NO通过质量流量为0.01kg/h的N2净化到预校准的NOA系统。每当进行NO释放实验时，每24小时向棕色反应烧瓶中加入1ml PBS缓冲溶液。每15分钟测量一次NO释放水平。
结果如图6所示。
图6A中，第一组为22号针头制备出来的微球，第二组为23号针头制备出来的微球，第三组为21号针头制备出来的微球，三组为不同尺寸相同负载浓度(负载浓度为45％)的微球。
从图6中可以清楚地看到，在测得的NO释放量开始随时间减少之前，可以观察到明显更高的释放率。不同大小、不同浓度的微球具有不同的释放时间和释放量，它们的最高瞬时释放量也有一定的差异。
从图6A中可以清楚地看到，在前24h三组不同尺寸相同负载浓度的微球均有较高的释放率，不同尺寸的微球具有不同的释放时间，其中第三组的释放时间最长，第三组的SNAP负载量也最高，因此，尺寸越大的微球所具有的抗菌效果越好，也就是说，相同负载的微球释放的NO随着尺寸的增加而增加。
如图6B所示，对于制备的三种不同浓度的微球，NO的瞬时释放速率和总释放量随着负载SNAP含量的增加而增加。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，包括：将S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺掺杂到海藻酸钙微球中，制得所述抗菌海藻酸钙微球。
2.根据权利要求1所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于：所述抗菌海藻酸钙微球中S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)的质量百分含量为0～45％。
3.根据权利要求2所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于：所述抗菌海藻酸钙微球中S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)的质量百分含量为0.1％～45％。
4.根据权利要求1所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)加入到海藻酸钠(SA)溶液中，搅拌得SA-SNAP溶液；
(2)将步骤(1)所得SNAP溶液滴加到氯化钙溶液中，搅拌反应，然后件所得产物冷冻干燥，得到所述抗菌海藻酸钙微球。
5.根据权利要求4所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述海藻酸钠溶液的浓度为0.01～0.05g/mL；
和/或，所述步骤(2)中，所述氯化钙溶液的浓度为0.05～0.5g/mL。
6.根据权利要求4所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺(SNAP)加入到海藻酸钠溶液中，于室温下搅拌5～10分钟得所述SA-SNAP溶液。
7.根据权利要求4所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，用注射器吸取SA-SNAP溶液，然后滴加至氯化钙溶液中，搅拌进行反应。
8.一种抗菌海藻酸钙微球，其特征在于：由S-亚硝基-N-乙酰基-D-青霉胺掺杂到海藻酸钙微球中制得。
9.根据权利要求8所述的抗菌海藻酸钙微球，其特征在于，根据权利要求1～7任一项所述的方法制备而得。
10.根据权利要求8～9任一项所述的抗菌海藻酸钙微球的制备方法在作为生物安全性材料中的应用。
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Application publication date: 20220920 |