CN115068690B - 一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层及其制备方法 - Google Patents

一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层及其制备方法，该涂层由表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层和二氧化硅矿化层组成；表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层设置在基体和二氧化硅矿化层之间；二氧化硅矿化层通过静电层层自组装涂层在表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层表面。本发明还包括上述涂层的制备方法。本发明利用表没食子儿茶素没食子酸酯的粘附性能及其结构中儿茶酚与聚乙烯亚胺中胺基的化学反应，在支架表面获得带正电的表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层，并利用静电层层自组装技术获得二氧化硅涂层，该涂层具有抗炎、抗氧化和促成骨功能，还具有不依赖材料表面性能的广谱粘附性。

Description

一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层及其制备方法。
背景技术
生物材料植入人体后，材料表面与周围组织环境之间会发生一系列相互作用。生物材料表面在人工植入材料对生物环境的响应中起着重要作用。生物材料的功效主要取决于它的表面性质，包括表面形貌、微观结构和组分等。这些特性改变了蛋白的吸附，进而介导了细胞粘附。基于此，表面改性已被广泛用于植入材料的设计，为进一步改善组织与植入材料界面的相互作用。无机纳米结构的组装已经成为新一代表面改性策略之一，这种改性方式可以同时改变植入材料表面形貌和化学性质。作为物理诱导信号，材料表面拓扑形貌有利于细胞的早期粘附，继而影响细胞的增殖和分化过程。作为化学诱导信号，材料表面无机离子的释放能有效刺激细胞胞内信号转导，激活胞内信号级联，进而促进细胞增殖和分化等生物学行为。因此表面具有无机纳米结构的生物材料，包括陶瓷、金属和聚合物将具有更好的生物活性。然而，目前的材料表面改性技术仅针对特定材料的表面，阻碍了这种改性技术在临床实验中的发展。采用有机-无机杂化纳米材料涂层结合了有机和无机材料优势，在不同性质的基底材料上具有普适性，有望成为一种用于不同材料表面制备具有多种功能和生物相容性的材料涂层技术。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层及其制备方法，利用表没食子儿茶素没食子酸酯的粘附性能及其结构中儿茶酚与聚乙烯亚胺中胺基的化学反应，在支架表面获得带正电的表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层，并利用静电层层自组装技术获得二氧化硅涂层，该涂层具有抗炎、抗氧化和促成骨功能，还具有不依赖材料表面性能的光谱粘附性。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，由表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层和二氧化硅矿化层组成；
表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层设置在基体和二氧化硅矿化层之间；
二氧化硅矿化层通过静电层层自组装涂层在表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层表面。
进一步，表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层和二氧化硅矿化层相互堆叠重复次数为1-20次。
进一步，表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层和二氧化硅矿化层相互堆叠重复次数为3-10次。
进一步，抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层厚度为0.1-20μm。
进一步，抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层厚度为1-3μm。
进一步，基体为金属、陶瓷或聚合物。
上述抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将表没食子儿茶素没食子酸酯和聚乙烯亚胺加入到Tris·盐酸缓冲液混匀，得混合溶液；
(2)将基体置于步骤(1)所得混合溶液中浸泡2-6h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料；
(3)将四甲氧基硅烷加入到盐酸溶液中，磁力搅拌10-60min，得四甲氧基硅烷水解溶液；
(4)将步骤(2)所得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料置于步骤所得(3)四甲氧基硅烷水解溶液浸泡2-6h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面载有1个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层(E/P/Si)1；
(5)重复步骤(2)和(4)，得多个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层。
进一步，室温温度为20-37℃。
进一步，步骤(1)中，表没食子儿茶素没食子酸酯在Tris·盐酸缓冲液中浓度固定，为0.5-5mg/mL。
进一步，步骤(1)中，表没食子儿茶素没食子酸酯在Tris·盐酸缓冲液中浓度固定，为1mg/mL。
进一步，步骤(1)中，表没食子儿茶素没食子酸酯和聚乙烯亚胺质量浓度比为1:0.1-6。
进一步，步骤(1)中，表没食子儿茶素没食子酸酯和聚乙烯亚胺质量浓度比为1:0.5-4。
进一步，步骤(1)中，Tris·盐酸缓冲液摩尔浓度为10-100mM，pH值为7.5-9。
进一步，步骤(1)中，Tris·盐酸缓冲液摩尔浓度为50mM，pH值为8.5。
进一步，步骤(3)中，四甲氧基硅烷和盐酸溶液体积比为0.1-1:10，盐酸溶液摩尔浓度为0.5-5mM。
进一步，步骤(3)中，四甲氧基硅烷和盐酸溶液体积比为0.3-0.6:10，盐酸溶液摩尔浓度为1mM。
综上所述，本发明具备以下优点：
1、本发明首先将表没食子儿茶素没食子酸酯和聚乙烯亚胺通过简单共混的方式结合在材料表面，表没食子儿茶素没食子酸酯是绿茶茶多酚的主要组成成分，由于其结构中丰富的儿茶酚基团，展现出类似贻贝不依赖于材料表面性质的强粘附性；聚乙烯亚胺富含大量的胺基，是一种聚阳离子电解质，能仿生硅藻中的长链聚胺诱导硅酸沉积。基于此，本发明利用表没食子儿茶素没食子酸酯的粘附性能及其结构中儿茶酚与聚乙烯亚胺中胺基的化学反应，在支架表面获得带正电的表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层；进一步利用静电层层自组装技术，诱导带负电的硅醇基团沉积到支架表面，从而获得二氧化硅涂层。此外，表没食子儿茶素没食子酸酯具有抗炎和抗氧化性能，结合支架表面有机分子与无机纳米结构的生物学功能，获得本发明的目标涂层，该涂层具有抗炎、抗氧化和促成骨功能，还具有不依赖材料表面性能的广谱粘附性。
2、相比于现有的通过层层自组装技术对材料表面改性的方法，本发明的自组装技术中采用的表没食子儿茶酸没食子酸酯具有类似贻贝的儿茶酚结构，在弱碱性条件下接触空气时，可以在任何固体表面氧化聚合并形成涂层，基于表没食子儿茶酸没食子酸酯广谱粘附性可在任意基底的表面制备纳米二氧化硅涂层。
3、相较于传统的无机纳米结构涂层，本发明的纳米二氧化硅涂层结合了有机分子及无机纳米结构特征赋予材料多种生物学功能，其中表没食子儿茶酸没食子酸酯是绿茶茶多酚的主要成分，具有抗炎和抗氧化作用，可调控组织损伤部位免疫微环境更有利于组织修复；同时纳米二氧化硅涂层通过纳米结构产生的物理信号和涂层中硅离子释放产生的化学信号协同促进细胞粘附和增殖，并提高细胞成骨分化活性，可有效促进骨缺损的再生修复。
附图说明
图1为实施例1-4和对比例1所得产物的表面形貌扫描电子显微镜(SEM)图以及表面硅元素比例柱状分析图；
图2为实施例3的PCL-(E/P2/Si)10表面放大SEM图和支架截面图；
图3为实施例5-6和对比例2-3所得产物的表面形貌SEM图；
图4为实施例1-4和对比例1所得产物与BMSCs细胞共培养时，加或不加H2O2刺激12h后的CCK8细胞增殖活性；
图5为实施例3和对比例1所得产物与RAW264.7细胞共培养1天和3天后细胞形貌SEM图以及RAW264.7细胞受LPS刺激后与其浸提液共培养24h后RAW264.7细胞iNOS(M1表型标记物)和CD206(M2表型标记物)的基因表达结果；
图6为BMSCs细胞与对比例1、实施例1和实施例3所得产物共培养7d后，各组细胞成骨相关基因表达结果。
具体实施方式
实施例1
一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其制备方法包括以下步骤：
(1)在室温下将1mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯和0.5mg/mL的聚乙烯亚胺加入到pH值为8.5的浓度为50mM的Tris·盐酸缓冲液混匀，得混合溶液(E/P0.5)；
(2)将3D打印聚己内酯支架(PCL)置于步骤(1)所得混合溶液中浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料PCL-(E/P0.5)；
(3)将0.3mL四甲氧基硅烷加入到10mL浓度为1mM的盐酸溶液中，磁力搅拌15min，得四甲氧基硅烷水解溶液；
(4)将步骤(2)所得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料置于步骤所得(3)四甲氧基硅烷水解溶液浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面载有1个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P0.5/Si)1；
(5)重复步骤(2)和(4)，重复10次，得循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P0.5/Si)10。
实施例2
一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其制备方法包括以下步骤：
(1)在室温下将1mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯和1mg/mL的聚乙烯亚胺加入到pH值为8.5的浓度为50mM的Tris·盐酸缓冲液混匀，得混合溶液(E/P1)；
(2)将3D打印聚己内酯支架(PCL)置于步骤(1)所得混合溶液中浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料PCL-(E/P1)；
(3)将0.3mL四甲氧基硅烷加入到10mL浓度为1mM的盐酸溶液中，磁力搅拌15min，得四甲氧基硅烷水解溶液；
(4)将步骤(2)所得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料置于步骤所得(3)四甲氧基硅烷水解溶液浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面载有1个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P1/Si)1；
(5)重复步骤(2)和(4)，重复10次，得循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P1/Si)10。
实施例3
一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其制备方法包括以下步骤：
(1)在室温下将1mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯和2mg/mL的聚乙烯亚胺加入到pH值为8.5的浓度为50mM的Tris·盐酸缓冲液混匀，得混合溶液(E/P2)；
(2)将3D打印聚己内酯支架(PCL)置于步骤(1)所得混合溶液中浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料PCL-(E/P2)；
(3)将0.3mL四甲氧基硅烷加入到10mL浓度为1mM的盐酸溶液中，磁力搅拌15min，得四甲氧基硅烷水解溶液；
(4)将步骤(2)所得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料置于步骤所得(3)四甲氧基硅烷水解溶液浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面载有1个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P2/Si)1；
(5)重复步骤(2)和(4)，重复10次，得循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P2/Si)10。
实施例4
一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其制备方法包括以下步骤：
(1)在室温下将1mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯和4mg/mL的聚乙烯亚胺加入到pH值为8.5的浓度为50mM的Tris·盐酸缓冲液混匀，得混合溶液(E/P4)；
(2)将3D打印聚己内酯支架(PCL)置于步骤(1)所得混合溶液中浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料PCL-(E/P4)；
(3)将0.3mL四甲氧基硅烷加入到10mL浓度为1mM的盐酸溶液中，磁力搅拌15min，得四甲氧基硅烷水解溶液；
(4)将步骤(2)所得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料置于步骤所得(3)四甲氧基硅烷水解溶液浸泡4h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面载有1个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P4/Si)1；
(5)重复步骤(2)和(4)，重复10次，得循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层PCL-(E/P4/Si)10。
实施例5
一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层Ti-(E/P2/Si)10，其制备方法与实施例3相同，不同之处在于其基体为钛基体。
实施例6
一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层Al2O3-(E/P2/Si)10，其制备方法与实施例3相同，不同之处在于其基体为氧化铝陶瓷。
对比例1
制备无涂层聚己内酯支架(PCL)。
对比例2
制备无涂层的钛基体(Ti)。
对比例3
制备无涂层的氧化铝陶瓷(Al2O3)。
实验例1
分别获取实施例1-4和对比例1所得产物的表面形貌扫描电子显微镜(SEM)图，如图1所示。其中，图1A为对比例1的PCL，图1B为实施例1的PCL-(E/P0.5/Si)10，图1C为实施例2的PCL-(E/P1/Si)10，图1D为实施例3的PCL-(E/P2/Si)10，图1E为实施例4的PCL-(E/P4/Si)10，图1F为表面硅元素比例柱状分析图。
由图1A-E可知，与对比例1无涂层的PCL支架相比，经过本发明方法处理后的PCL支架表面均变得粗糙，涂层在支架表面有序黏附，均匀分布，表明在PCL支架表面成功制备了二氧化硅涂层。由图1F可知，随着聚乙烯亚胺浓度的增加，支架表面硅元素比例逐渐升高，由小到大依次为PCL-(E/P0.5/Si)10<PCL-(E/P1/Si)10<PCL-(E/P2/Si)10<PCL-(E/P4/Si)10。
分别获取实施例3所得PCL-(E/P2/Si)10表面放大SEM图和支架截面图，如图2所示。
由图2可知，本发明所得抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层为粗糙的纳米颗粒，均匀分布在支架表面，且涂层厚度在1-2μm之间。
分别获取实施例5-6和对比例2-3所得产物的表面形貌SEM图，如图3所示。
由图3可知，涂层前Ti和Al2O3材料表面光滑，二氧化硅涂层后两种材料表面变得更粗糙，由均匀的粗糙颗粒覆盖，证实了本发明制备的二氧化硅涂层能形成于金属和陶瓷材料表面。
实验例2
(1)抗氧化性能
将75％乙醇灭菌后的各组支架放置在48孔板中，每组支架6个重复。将细胞以每孔7×103个细胞的密度接种在支架表面，培养24h。每组支架中3个重复加入0.2mM H2O2处理，剩余3个重复不进行处理，培养12h后，采用CCK8测定各孔细胞增殖活性，将无材料组作为对照组，结果如图所4所示。
由图4可知，在对照组和PCL支架组中，H2O2处理后的细胞活性较未处理的细胞活性均明显降低，分别降低为未受H2O2处理的79.9％和85.0％。SiO2涂层支架组的细胞受到H2O2处理后其活性较未经处理的细胞略微降低，其中PCL-(E/P0.5/Si)、PCL-(E/P1/Si)10、PCL-(E/P2/Si)10和PCL-(E/P4/Si)10组细胞活性仅降低为未受H2O2处理的细胞活性的97.4％、98.3％、98.6％和98.5％。该结果表明本发明二氧化硅涂层中的EGCG能有效保护细胞抵抗H2O2介导的活性氧损伤。
(2)抗炎性能
RAW264.7细胞形态观察
将75％乙醇灭菌后的PCL和PCL-(E/P2/Si)10支架置于24孔板中，将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在支架表面。细胞与支架共培养1天和3天后，吸弃培养基，加入PBS冲洗3次，吸弃PBS，加入2.5％戊二醛固定4h，吸弃戊二醛，依次于30％、50％、70％、80％、90％和100％的梯度乙醇中脱水(15min/次)，冷冻干燥，喷金，SEM观察，结果如图5A所示。
RAW264.7细胞表型分析
将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到放有细胞爬片的24孔培养板过夜培养。向培养基中添加500ng/mL LPS刺激细胞4小时后，用PBS冲洗细胞三次，分别加入PCL和PCL-(E/P2/Si)10支架浸提液培养24小时。通过RT-PCR分析基因iNOS(M1型巨噬细胞标记物)和CD206(M2型巨噬细胞标记物)的表达。将经过LPS处理与未经处理细胞分别作为阳性对照组和阴性对照组，采用阴性对照组对所有样本的基因表达进行标准化，结果如图5B所示。
由图5A可知，RAW264.7细胞在PCL支架表面呈圆形，通过少量伪足黏附于材料表面。PCL-(E/P2/Si)10支架组表面的细胞呈扁平状，通过更长的伪足铺展在材料表面，扩散形态更好。根据文献报道，巨噬细胞向M1型极化时呈球形，向M2型极化时呈更好的铺展状态。因此，通过细胞在支架表面形貌的观察可以初步判断PCL-(E/P2/Si)10支架具有将巨噬细胞向M2型极化的能力。
由图5B可知，RAW264.7细胞经LPS刺激后，iNOS基因在仅LPS刺激组和PCL组中高表达，而CD206的表达情况呈相反趋势，其在PCL-(E/P2/Si)10支架浸提液中培养后高表达。上述结果证实了PCL-(E/P2/Si)10支架能有效刺激RAW264.7细胞向M2型极化。
(3)成骨性能
将75％乙醇灭菌后的PCL、PCL-(E/P0.5/Si)10和PCL-(E/P2/Si)10支架置于24孔板中，BMSCs以每孔2×104个细胞的密度接种在支架表面。细胞与材料共培养7天后，进行实时定量PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(COL1)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Osterix和Runt相关转录因子(RunX2)的表达情况，结果如图6所示。
由图6可知，BMSCs与支架共培养7天后，相较于未涂层的PCL支架组，细胞在PCL-(E/P0.5/Si)10和PCL-(E/P2/Si)10支架组中6个成骨分化相关基因均高表达，且在PCL-(E/P2/Si)10组均具有显著差异，同时更高的Si含量组对成骨基因表达具有更显著的促进作用。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (8)

1.一种抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其特征在于，由表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层和二氧化硅矿化层组成；
所述表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层设置在基体和二氧化硅矿化层之间；
所述二氧化硅矿化层通过静电层层自组装涂层在所述表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层表面；
所述表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺诱导层和二氧化硅矿化层相互堆叠重复次数为10次。
2.如权利要求1所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其特征在于，所述抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层厚度为0.1-20μm。
3.如权利要求1所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层，其特征在于，所述基体为金属、陶瓷或聚合物。
4.权利要求1-3任一项所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在室温下将表没食子儿茶素没食子酸酯和聚乙烯亚胺加入到Tris·盐酸缓冲液混匀，得混合溶液；
(2)将基体置于步骤(1)所得混合溶液中浸泡2-6h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料；
(3)将四甲氧基硅烷加入到盐酸溶液中，磁力搅拌10-60min，得四甲氧基硅烷水解溶液；
(4)将步骤(2)所得表面具有表没食子儿茶素没食子酸酯/聚乙烯亚胺涂层的材料置于步骤所得(3)四甲氧基硅烷水解溶液浸泡2-6h，取出后去离子水冲洗，干燥，得表面载有1个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层；
(5)重复步骤(2)和(4)，得多个循环的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层。
5.如权利要求4所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表没食子儿茶素没食子酸酯在Tris·盐酸缓冲液中浓度固定，为0.5-5mg/mL。
6.如权利要求4所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表没食子儿茶素没食子酸酯和聚乙烯亚胺质量浓度比为1:0.1-6。
7.如权利要求4所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Tris·盐酸缓冲液摩尔浓度为10-100mM，pH值为7.5-9。
8.如权利要求4所述的抗炎抗氧化促成骨的纳米二氧化硅涂层的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述四甲氧基硅烷和盐酸溶液体积比为0.1-1:10，盐酸溶液摩尔浓度为0.5-5mM。
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