CN115068507A - 一种猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用 - Google Patents

一种猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用 Download PDF

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CN115068507A CN202210812678.4A CN202210812678A CN115068507A CN 115068507 A CN115068507 A CN 115068507A CN 202210812678 A CN202210812678 A CN 202210812678A CN 115068507 A CN115068507 A CN 115068507A
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Abstract

本发明提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用。所述猪胎盘冻干粉的制备方法包括以下步骤：(1)将猪胎盘和水混合，进行低温高速匀浆，得到匀浆液；(2)将步骤(1)得到的匀浆液进行超声波细胞破壁，得到破碎液；(3)将步骤(2)得到的破碎液先进行超低温凝固，再进行冷冻干燥，得到所述猪胎盘冻干粉。本发明还提供一种软膏，所述软膏包括羊毛脂、紫苏籽油和猪胎盘冻干粉。本发明成功分析猪胎盘各种组份的含量，并制备了猪胎盘冻干粉皮肤修复软膏，将软膏应用于小鼠创伤模型取得了良好的治疗效果，为猪胎盘在皮肤药膏的商业化利用提供实验数据支持。

Description

一种猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用。
背景技术
胎盘的成分比较复杂，含有多种激素、活性多肽、细胞因子、氨基酸、矿物质以及维生素等。随着科技的进步，这些活性物质逐渐被提取、研究并应用于各种领域，造福人类。
第一，胎盘中富含多种激素，其中主要有绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素释放激素、促性腺激素释放激素、胎盘催乳素、催产素、前列腺素、卵泡抑制素、孕酮等，这些激素在妊娠阶段对激素水平调控起到重要作用。第二，胎盘中富含活性多肽(BioactivePeptides，BAP)，BAP是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物，具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用。第三，胎盘中富含细胞因子，如白细胞介素、干扰素以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、生长因子(GF)等。可促进胎盘的形成发育以及防止某些疾病的发生。第四，胎盘中富含氨基酸，具备人体体内必备的各种氨基酸，其中的Lys、Leu的含量远高于相应乳制品，可提供丰富的蛋白资源。第五，胎盘中还含有免疫球蛋白、微量元素、维生素等营养物质。
CN106994110A公开了一种猪胎盘冻干粉的抗氧化用途。针对现有技术中没有将猪胎盘冻干粉应用于肌肤抗衰老、抗氧化上的问题，该发明提供一种猪胎盘冻干粉用于制备抵抗肌肤衰老的护肤品。该猪胎盘冻干粉的制备方法为：a、取-50℃～-30℃下冷冻的猪胎盘，于4～10℃下解冻；b、将猪胎盘经高速组织捣碎机粉碎后，倒入冷冻干燥盘，进行第一次冷冻干燥；c、待步骤b完成后，将冷冻干燥盘中的猪胎盘完整翻面，进行第二次冷冻干燥；d、将步骤c中干燥后的猪胎盘装入铝箔袋，抽真空，于4℃保存待用。该方法一定程度上会导致最终制备得到的冻干粉中蛋白含量较低。
CN107095178A公开了一种猪胎盘冻干粉的制备方法及其用途。该发明提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，包括以下步骤：a、取-50℃～-30℃下冷冻的猪胎盘，于4～10℃下解冻；b、将猪胎盘经高速组织捣碎机粉碎后，倒入冷冻干燥盘，进行第一次冷冻干燥；c、待步骤b完成后，将冷冻干燥盘中的猪胎盘完整翻面，进行第二次冷冻干燥；d、将步骤c中干燥后的猪胎盘装入铝箔袋，抽真空，于4℃保存待用。类似地，该方法也存在一定程度上会导致最终制备得到的冻干粉中蛋白含量较低的问题。
因此，开发一种猪胎盘冻干粉的制备方法，用于生产皮肤修复软膏，应用于皮肤修复，研究模型的创面情况、血常规及其脏器指数的变化，探究胎盘粉对小鼠皮肤修复的作用是十分必要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用。所述猪胎盘冻干粉可以促进细胞生长、增强免疫能力。特别地，本发明所述含猪胎盘冻干粉的软膏中功效成分与基质完美结合，对创伤的治愈效果优异，当皮肤受到损伤时，可以促进皮肤修复、抑制炎症、减少留疤等。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，所述猪胎盘冻干粉的制备方法包括以下步骤：
(1)将猪胎盘和水混合，进行低温高速匀浆，得到匀浆液；
(2)将步骤(1)得到的匀浆液进行超声波细胞破壁，得到破碎液；
(3)将步骤(2)得到的破碎液先进行超低温凝固，再进行冷冻干燥，得到所述猪胎盘冻干粉。
在本发明中，上述方法可最大限度保证胎盘原有活性，所以本实验采用真空冷冻干燥法将新鲜的猪胎盘制成冻干粉，制备得到的猪胎盘冻干粉中蛋白含量更高，且由于最大限度保证胎盘原有活性，所富含的生长因子、胎盘肽，可以促进细胞生长、增强免疫能力，因而对受伤的皮肤修复效果更佳。其中，步骤(1)提供的猪胎盘需要清理干净。
优选地，步骤(1)中，所述猪胎盘由以下步骤得到：将冷冻保存的猪胎盘在0-4℃(例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃等)下解冻1-3h(例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h等)，去除筋膜后，再采用预冷的去离子水反复清洗3-4次(例如可以是3次、4次)直到去除血水，最后剪碎，得到体积为1-1.5cm3(例如可以是1cm3、1.1cm3、1.2cm3、1.3cm3、1.4cm3、1.5cm3等)的猪胎盘组织碎粒。
优选地，步骤(1)中，所述猪胎盘和水的质量比为1:(1-2)，例如可以是1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2等。
优选地，步骤(1)中，所述低温高速匀浆的参数为：转速6000-12000rpm(例如可以是6000rpm、8000rpm、10000rpm、12000rpm等)，0.5-2min/次(例如可以是0.5min/次、0.6min/次、0.8min/次、1min/次、1.5min/次、1.5min/次、2min/次等)，连续8-12次(例如可以是8次、9次、10次、11次、12次等)，间隔5-10s，例如可以是5s、6s、7s、8s、9s、10s等，控温0-4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃等。
优选地，步骤(2)中，所述超声波细胞破壁的参数为：功率130-150W，例如可以是130W、135W、140W、145W、150W等，每工作5-15s(例如可以是5s、6s、8s、10s、12s、14s、15s等)，间歇5-15s(例如可以是5s、6s、8s、10s、12s、14s、15s等)，运行10-30min，控温-5～5℃(例如可以是-5℃、-4℃、-2℃、0℃、2℃、4℃、5℃等)。
优选地，步骤(3)中，所述超低温凝固的温度为-80～-25℃(例如可以是-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-30℃、-25℃等等)，超低温凝固的时间为1-3天(例如可以是1天、2天、3天)。
优选地，步骤(3)中，所述冷冻干燥在真空冷冻干燥机内进行。
优选地，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-80～-50℃，例如可以是-80℃、-70℃、-60℃、-50℃等，冷冻干燥的压力为1-3MPa，例如可以是1MPa、1.5MPa、2MPa、2.5MPa、3MPa等，冷冻干燥的时间为1-3天，例如可以是1天、2天、3天等。
第二方面，本发明提供一种猪胎盘冻干粉，所述猪胎盘冻干粉由如所述的猪胎盘冻干粉的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种猪胎盘冻干粉中可溶性蛋白的提取方法，所述提取方法包括PBS提取法和/或裂解液提取法。
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述提取方法具体包括以下步骤：将所述猪胎盘冻干粉和RIPALysis Buffer II裂解液混合，静置、离心，收集上清液，得到猪胎盘蛋白的提取液。
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述胎盘冻干粉和RIPA Lysis BufferII裂解液质量为1:(1-10)，例如可以是1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10等，优选为1:3。
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述静置的温度为-4～4℃，例如可以是-4℃、-3℃、-1℃、0℃、1℃、3℃、4℃等，静置的时间为10-30min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min等。
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述离心的转速为10000-15000rpm，例如可以是10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm等，离心的温度为3-5℃，例如可以是3℃、4℃、5℃等，离心的时间为5-10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述猪胎盘蛋白的提取液中蛋白的含量为4.67～5.27μg/mL，例如可以是4.67μg/mL、4.70μg/mL、4.80μg/mL、4.90μg/mL、5.00μg/mL、5.10μg/mL、5.27μg/mL等。
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述提取方法具体包括以下步骤：将所述猪胎盘冻干粉和PBS缓冲液混合，进行超声波细胞破壁后，静置、离心，收集上清液，得到猪胎盘蛋白的提取液。
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述猪胎盘冻干粉和PBS缓冲液的质量比为1:(1-10)，例如可以是1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10等，优选为1:5。
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述静置的温度为20～30℃，例如可以是20℃、22℃、25℃、27℃、30℃等，静置的时间为60-90min，例如可以是60min、70min、80min、90min等。
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述离心的转速为10000-15000rpm，例如可以是10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm等，离心的温度为3-5℃，例如可以是3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃等，离心的时间为为10-20min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min等。
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述猪胎盘蛋白的提取液中蛋白的含量为4.28～5.90μg/mL，例如可以是4.28μg/mL、4.50μg/mL、4.70μg/mL、4.80μg/mL、5μg/mL、5.20μg/mL、5.40μg/mL、5.80μg/mL、5.90μg/mL等。
第四方面，本发明提供一种软膏，所述软膏包括羊毛脂、紫苏籽油和所述的猪胎盘冻干粉。
在本发明中，所述羊毛脂、紫苏籽油和所述的猪胎盘冻干粉相互配合具有协同增效的作用，能够进一步提高对创伤的治愈效果，当皮肤受到损伤时，可以进一步促进皮肤修复、抑制炎症、减少留疤等。
优选地，所述羊毛脂、紫苏籽油和猪胎盘冻干粉的质量比为(8-12):(6-10):(0.5-1.5)；
其中，“8-12”例如可以是8、9、10、11、12等；
其中，“6-10”例如可以是6、7、8、9、10等；
其中，“0.5-1.5”例如可以是0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.5等。
优选地，所述软膏还包括凡士林。
优选地，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：羊毛脂8-12％(例如可以是8％、9％、10％、11％、12％等)、紫苏籽油6-10％(例如可以是6％、7％、8％、9％、10％等)、猪胎盘冻干粉0.5-1.5％(例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％等)，余量为凡士林。
第五方面，本发明提供一种所述的猪胎盘冻干粉、所述的软膏在制备皮肤修复产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用特定的真空冷冻干燥法制备猪胎盘冻干粉，相比其他干燥法，避免了高温对生物活性物质的破坏，最大限度地保证了原有成份的活性；
(2)对猪胎盘中的有效成份进行了提取及测定，对于冻干粉中的蛋白质的提取，PBS法优于裂解液提取法，且当猪胎盘冻干粉：PBS料液比为1:5时所提取的蛋白量最多(5.90μg/mL)；
(3)对猪胎盘中的有效成份进行了测定，测定本发明制备猪胎盘冻干粉的脂肪含量为16.8％；相比于其他制备方法或其他动物来源的胎盘冻干粉的脂肪相对较高；
(4)本发明软膏包括羊毛脂、紫苏籽油和所述的猪胎盘冻干粉，各组分相互配合，具有协同增效的作用，对创伤的治愈效果优异，当皮肤受到损伤时，可以促进皮肤修复、抑制炎症、减少留疤等。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的猪胎盘冻干粉的外观图。
图2为本发明实施例1提供的猪胎盘冻干粉的裂解液提取法的标准曲线图。
图3为本发明实施例1提供的猪胎盘冻干粉的SDS-PAGE电泳分析结果图。
图4为本发明实施例1提供的猪胎盘冻干粉提取出来的脂肪外观图。
图5为各组小鼠体重变化图。
图6为各组小鼠体重的显著性差异图。
图7为各组小鼠创面情况差异图。
图8为各组小鼠粒细胞的显著性差异图。
图9为各组小鼠淋巴细胞的显著性差异图。
图10为各组小鼠白细胞的显著性差异图。
图11为各组小鼠血小板的显著性差异图。
图12为各组小鼠脾脏指数的显著性差异图。
图13为各组小鼠睾丸指数的显著性差异图。
图14为各组小鼠睾丸指数的显著性差异。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本研究得到了怀化学院动物伦理委员会的核准，以下各例实验动物来源如下所示：猪胎盘：怀化市某养猪场提供；KM小鼠：湖南医药学院动物房。
以下各例试验仪器主要仪器名称和仪器来源如下所示：
Figure BDA0003739847040000081
以下各例试验材料源如下所示：
Figure BDA0003739847040000082
Figure BDA0003739847040000091
以下各例试剂及溶液的配制：
(1)总蛋白的提取及含量测定
裂解液提取法的标准蛋白溶液(BSA)：先用量程为0-10的移液枪精密量取2μL蛋白浓度测定试剂盒中的标准蛋白(25mg/mL)，再用量程为100μL的移液枪吸取98μL裂解液即可配制成0.5mg/mL蛋白标准。
PBS提取法的标准蛋白溶液(BSA)：先用量程为0-10的移液枪精密量取2μL蛋白浓度测定试剂盒中的标准蛋白(25mg/mL)，再用量程为100μL的移液枪吸取98μL 0.01MPBS缓冲液即可配制成0.5mg/mL蛋白标准。
BCA工作液的配制：首先计算所需的工作液，按BCA试剂A：BCA试剂B以50:1的比例配制、混匀。(24h内使用)。
0.01MPBS缓冲液(pH 7.2)：称量0.804g NaCl、0.021g KCl、0.146gNa2HPO4、0.025gKH2PO4于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，用50mL容量瓶定容，用试剂瓶分装，贴上标签。
(2)SDS-PAGE
10％AP：2.5g过硫酸铵定容于25mL容量瓶中。
电极缓冲液：称取50mL的10×电极缓冲液，加入450mL的蒸馏水中。
脱色液：取250mL乙醇，80mL冰醋酸，用重蒸馏水在1000mL容量瓶中定容，用玻璃瓶分装，贴好标签纸。
染色液：称量0.29g考马斯亮蓝R-250，加入250mL脱色液中，搅拌均匀，用玻璃瓶分装，贴好标签纸。
分离胶与浓缩胶：制备12％的分离胶和5％的浓缩胶，按照下述制备凝胶；
Figure BDA0003739847040000101
实施例1
本实施例提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，所述猪胎盘冻干粉的制备方法包括以下步骤：
S1冷冻保存的猪胎盘2℃下解冻2h，切碎，去除筋膜，再将其用去离子水反复清洗3次直到去除血水；
S2取一部分(10cm3)，用剪刀剪成小块(平均体积为1.2cm3)；
S3加入1.5倍量的预冷去离子水，再放入高速组织搅碎匀浆机中捣碎(10000rpm，1min/次，10次，间隔10s，控温4℃)；
S4将匀浆液放入超声波细胞破碎仪中破碎30min(130W，0℃，开10s，关10s，运行30min)，破碎后倒入离心管中，用保鲜膜封好管口(两层)，用小针扎上细密的小孔，每4个离心管用一个小皮筋绑起来；
S5将绑好的离心管置于-80℃冰箱中冷冻2d；
S6冷冻2d后置于真空冷冻干燥机内-80℃、3MPa下冷冻干燥2d。
S7将制备好的冻干粉放入-20℃冰箱中保存，待用。
实施例2
本实施例提供一种裂解液提取法提取可溶性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：称取0.060g冻干粉于2mL离心管中，加入600μL RIPALysis Buffer II裂解液，将离心管置于装有碎冰的烧杯中静置30min，配平后放入离心机再进行离心(5min，4℃，12000rpm)，吸取上清液即制得猪胎盘蛋白提取液；
本实施例还提供BCA法测定猪胎盘可溶性蛋白含量：
(1)标准曲线的制作
精密量取0、1、2、4、8、10μL标准蛋白溶液(1mg/mL)分别加入96孔板中的C排1-8孔中，再用对应的稀释液补足至20μL，各孔加入200μL的BCA工作液，室温下静置2h。
打开酶标仪以及电脑，预热10min，建立方案，将96孔板放入酶标仪中，在562nm波长处测定吸光度(OD562nm)，拍照记录各孔所测数值，再用Excel建立散点图，以蛋白质溶液的浓度为横坐标，OD562nm为纵坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线的线性回归方程为y＝0.6892x+0.171，R2＝0.9991。
(2)样品蛋白含量的测定
在96孔板样品孔中加入50倍稀释蛋白提取液10μL，再用对应的稀释液补足至20μL，通过相同方法反应并测量OD562nm，通过得到的标准曲线即可准确计算样品中总蛋白含量，经标准曲线计算得猪胎盘冻干粉中蛋白平均含量为4.97μg/mL。
实施例3
本实施例提供一种PBS提取法提取可溶性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：将冻干粉和PBS分别以料液比1:4、1:5、1:6、1:7、1:9进行提取，室温下静置1h，离心管配平后放入低温高速离心机中进行离心(15min、4℃、12000rpm)，分别收集上清液；其中，胎盘可溶性蛋白含量测定方法参照实施例2(每个比例分别测试两次，如下表1所示)。
表1
Figure BDA0003739847040000121
经全波长酶标仪检测标准液与样品在562nm下的吸光度，得出各孔的吸光度如图，拍照记录各孔所测数值，如图2所示，代入线性回归方程为y＝0.6892x+0.171，R2＝0.9991，按冻干粉：PBS以料液比1:5提取的总蛋白，测得其蛋白含量为43％，1:6提取的蛋白含量为40％，1:7提取的蛋白含量为39％，1:9提取的蛋白含量为31％，由此可知，当料液比为1:5时所提取的蛋白含量最高，而PBS含量过高或过低都会导致提取可溶性蛋白含量下降。
实施例4
本实施例提供一种SDS-PAGE电泳分析方法
测试原理：带电颗粒在电场中按其荷电性质做定向移动的现象称为电泳。根据惰性分离介质的不同，电泳技术有纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳、免疫电泳、等电聚焦电泳等多种。
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)在TEMED和AP的作用下形成三维网状结构凝胶，具有凝胶透明、化学性能稳定、几乎无吸附和电渗作用、孔径可调节、分辨率高等特点。当在凝胶体系中加入SDS后，可形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，从而消除不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，使大分子经过电泳后的迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。SDS-PAGE可以检测未知蛋白质的相对分子质量以及组成情况，并可以根据区带的存在与否、颜色深浅以及所处的相对分子质量范围，分析判断样品中蛋白质的组分及各组分的相对含量等。
所述方法具体包括以下步骤：
(1)灌制分离胶：依次吸取如上表所需溶液，加入小烧杯中混匀，组装好电泳仪后，用笔标记电泳梳的位置，用移液枪吸取分离胶溶液沿壁缓慢加入玻璃板间隙，轻轻加入少量蒸馏水压平凝胶表层，待凝胶凝固后，吸出水层。
(2)灌制浓缩胶：依次吸取如上表所需溶液，加入小烧杯中混匀，用移液枪吸取浓缩胶溶液沿壁缓慢加入玻璃板间隙，垂直插入15孔电泳梳，待浓缩胶凝固后，拔出梳子。
(3)上样：取5μL样品溶液加入9、10样品孔中，在11号孔中加入5μL低分子量Marker。
(4)电泳：当样品在浓缩胶内电泳时，电压为70V，当样品在分离胶内泳动时，电压为120V，当指示剂到距离凝胶底部1cm处时，关闭电源，停止电泳，将凝胶玻璃板从电泳槽中取出，轻轻取出胶块。
(5)染色和脱色：将取下的胶块放入透明胶盒中，加入染色液染色30min后放入脱色液中脱色直至背景透明。
(6)保存：拍照记录，然后用干净的保鲜膜将胶块包裹，风干保存。
如图3所示，SDS-PAGE电泳分析结果显示蛋白样品条带中有7个峰，说明该猪胎盘中约含有7条蛋白条带。
实施例5
本实施例提供一种粗脂肪含量的测定的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将洗净的索氏提取仪的收集瓶、提取器放入电热风干燥箱中风干备用，风干后记录空收集瓶的重量。
(2)取一张巴掌大小的滤纸，围着小试管，用棉线包扎，取下小试管，将棉球塞入滤纸袋中，称取0.600g胎盘粉入袋，再塞入棉球压实，对比虹吸管的高度，减去滤纸袋多余的部分。将装有胎盘粉的滤纸袋放入100℃的烘箱中烘干1h，记录烘干后整个滤纸袋的重量。
(3)将滤纸袋塞入索氏抽提器，滤纸高度低于虹吸管管口，收集瓶中装入90mL乙醚，将仪器从下至上进行组装，冷凝器预先用乙醚润洗，再塞上棉花。
(4)打开仪器开关，设置温度(75℃)、时间(300min)，打开旋转开关，使小孔通畅，抽提过程中注意收集瓶中乙醚的量。
(5)300min后，关闭仪器，关闭旋转开关，使小孔关闭，取下收集瓶和抽提器，将冷凝器中的乙醚回收。
(6)称量抽提后收集瓶的重量，将滤纸袋取出、烘干、称重(如图5所示)。根据公式即可算出猪胎盘中粗脂肪含量。
粗脂肪含量计算公式如下：粗脂肪(％)＝[(W2-W1)×100/w]×100％。
称取的冻干粉重量w：0.600g；提取前滤纸包重量W2：2.964g；提取后滤纸包重量W1：2.863g；计算得到该胎盘粗脂肪占16.8％；抽提结束后在收集瓶中可观察到少量的亮黄色液体，根据计算公式可知猪胎盘中含粗脂肪16.8％。
实施例6
本实施例提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，所述猪胎盘冻干粉的制备方法包括以下步骤：
S1冷冻保存的猪胎盘0-4℃下解冻1.5h，切碎，去除筋膜，再将其用去离子水反复清洗3次直到去除血水；
S2取一部分(10cm3)猪胎盘，用剪刀剪成小块(平均体积为1.0cm3)；
S3加入1.5倍量的去离子水，再放入高速组织搅碎匀浆机中捣碎(12000rpm，90s/次，12次，间隔10s，控温4℃)；
S4将匀浆液放入超声波细胞破碎仪中破碎40min(130W，0℃，开12s，关12s，破碎后倒入离心管中，用保鲜膜封好管口(两层)，用小针扎上细密的小孔，每4个离心管用一个小皮筋绑起来；
S5将绑好的离心管置于-18℃冰箱中冷冻3d；
S6冷冻3d后置于真空冷冻干燥机内-80℃、3MPa下冷冻干燥2d。
S7将制备好的冻干粉放入-20℃冰箱中保存，待用。
实施例7
本实施例提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，所述猪胎盘冻干粉的制备方法包括以下步骤：
S1冷冻保存的猪胎盘2℃下解冻2.5h，切碎，去除筋膜，再将其用去离子水反复清洗3次直到去除血水；
S2取一部分(10cm3)，用剪刀剪成小块(平均体积为1.5cm3)；
S3加入1.5倍量的去离子水，再放入高速组织搅碎匀浆机中捣碎(10000rpm，50s/次，8次，间隔10s，控温2℃)；
S4将匀浆液放入超声波细胞破碎仪中破碎25min(130W，0℃，开8s，关8s)，破碎后倒入离心管中，用保鲜膜封好管口(两层)，用小针扎上细密的小孔，每4个离心管用一个小皮筋绑起来；
S5将绑好的离心管置于-80℃冰箱中冷冻1.5d；
S6冷冻1.5d后置于真空冷冻干燥机内-80℃、3MPa下冷冻干燥2d。
S7将制备好的冻干粉放入-20℃冰箱中保存，待用。
对比例1
本对比例提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，不去除筋膜，且不在超声波细胞破碎仪中破碎细胞破壁处理，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，不去除筋膜，且不进行超声波细胞破碎仪细胞破壁处理，直接将匀浆液置于冰箱中冷冻，其他步骤与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种猪胎盘冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，前期处理不去除筋膜，且不在超声波细胞破碎仪细胞破壁处理，不将绑好的离心管先置于冰箱中冷冻，而直接放入真空冷冻干燥机内，其他步骤与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种牛胎盘冻干粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将羊胎盘替换为猪胎盘，且制备工艺上前期处理不去除筋膜，不进行超声波细胞破碎仪细胞破壁处理。
采用上述实施例2-3、5的方法分别对实施例6-7、对比例1-4得到的成品进行分析，具体结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0003739847040000171
由表2测试数据可知，本发明采用特定的真空冷冻干燥法制备猪胎盘冻干粉，相比其他干燥法，避免了高温对生物活性物质的破坏，最大限度地保证了原有成份的活性；对猪胎盘中的有效成份进行了提取及测定，对于冻干粉中的蛋白质的提取，法裂解液提取法优于PBS，胎盘粉中蛋白含量为42.9％。对猪胎盘中的有效成份进行了测定，测定本发明制备猪胎盘冻干粉的脂肪含量为16.8％；相比于其他制备方法或其他动物来源的胎盘冻干粉的脂肪相对较高。
应用例1
本应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：10％的羊毛脂、8％的紫苏籽油和1％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林。
所述软膏的制备方法为：
(a)称取凡士林和羊毛脂，置于100mL小烧杯中，置于55℃的水浴锅中水浴，加热融化的过程中应不断用玻璃棒搅拌混匀，得到软膏剂基质；
(b)再将紫苏籽油和实施例1提供的猪胎盘冻干粉加入软膏剂基质中，搅拌混匀，得到所述软膏。
应用例2
本应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：11％的羊毛脂、6％的紫苏籽油和2％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
应用例3
本应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成9.5％的羊毛脂、9％的紫苏籽油和2.5％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
应用例4
本应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成8％的羊毛脂、6％的紫苏籽油和0.5％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
应用例5
本应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成10％的羊毛脂、10％的紫苏籽油和0.5％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
对比应用例1
本对比应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：13％的紫苏籽油和6％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
对比应用例2
本对比应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：14％的羊毛脂和5％的实施例1提供的猪胎盘冻干粉，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
对比应用例3
本对比应用例提供一种软膏，以软膏总质量为100％计，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：10％的羊毛脂和9％的紫苏籽油，余量为凡士林；制备方法与应用例1相同。
测试例1
软膏质量评分
测试样品：应用例1-5提供的软膏和对比应用例1-3提供的软膏；
本实验以软膏剂质量评分标准(根据外观性状、涂展性、离心稳定性、耐寒性以及耐热性的综合评价)为指标进行评分，以筛选出该软膏的最佳处方。
其具体考察方法为：
(1)外观及形状：肉眼观察所制备猪胎盘冻干粉软膏的外观是否均一，记录结果并评分。
(2)涂展性：涂于载玻片，观察其涂展性，记录结果并评分。
(3)离心实验：取适量的猪胎盘软膏置于离心管中，配平后放入离心机中离心(参数：3000r/min，15min，25℃)，观察是否分层，记录结果并评分。
(4)耐热性：将制备好的猪胎盘软膏置于室温下(20～25℃)下静置6h后观察是否分层，记录结果并评分。
(5)耐冷性：将制备好的猪胎盘软膏置于冰箱(-20℃)中静置6h后观察是否分层，记录结果并评分。
软膏质量评分标准如下表3所示：
表3
Figure BDA0003739847040000201
具体结果如下表4所示：
表4
Figure BDA0003739847040000202
Figure BDA0003739847040000211
由表4测试数据可知，所述软膏优选的配比为羊毛脂8-12％、紫苏籽油6-10％、猪胎盘冻干粉0.5-1.5％。由应用例1和对比应用例1-3的对比可知，软膏中缺少任一组分，即使提高其他组分含量，制备得到的软膏会出现不同程度的缺陷，例如颜色稍深、涂展性最差，粘度较高，不易展开、轻微分层等。
测试例2
建立小鼠创伤模型及给药治疗
1、动物分组：小鼠15只，皆为雄性，适应环境3d后，随机分成5组(空白组、猪胎盘软膏低剂量组、阳性组、猪胎盘软膏高剂量组、软膏对照组)，每组3只，按照分组放进相应鼠笼中，用笔在小鼠尾部做好相应标记。
小鼠分组及给药如下表5所示：
表5
Figure BDA0003739847040000212
2、造模及给药
实验前，将小鼠饲养在干净的鼠房中，每天喂饲料、换水一次，保证小鼠良好的生长环境。造模前24h，用乙醚麻醉小鼠，进行脱毛处理：先用剪刀将小鼠尾端的背部毛尽量剪至贴近皮肤，注意不可损伤皮肤，再将适量脱毛膏涂于脱毛区域，3min后轻轻刮去脱毛膏及小鼠毛发，用镊子夹住适量蘸水棉球洗去多余脱毛膏。拍照记录造模前小鼠脱毛处皮肤。
用镊子夹住酒精棉擦拭手术刀，用手术刀按“一”字形划伤小鼠脱毛处皮肤，微渗血状态即可，不可伤及皮下组织。用无菌注射器吸取0.2mL软膏涂于脱毛区域，每天上药一次，上药前进行小鼠称重、皮肤刺激反应评分、拍照记录。
3、一般情况及创面分析
记录造模前以及治疗期间的小鼠体重，每天称量一次。观察小鼠创面结痂、愈合情况、小鼠的进食是否正常、精神状态、毛发色泽等，进行拍照并记录。根据下表在小鼠伤后12、24、48h对小鼠创面进行观察，并评价等级。
创面愈合等级如下表6所示：
表6
Figure BDA0003739847040000221
具体测试结果如下表7所示：
表7
Figure BDA0003739847040000222
Figure BDA0003739847040000231
由表7测试数据可知，本发明软膏包括羊毛脂、紫苏籽油和所述的猪胎盘冻干粉，各组分相互配合，具有协同增效的作用，对创伤的治愈效果优异，当皮肤受到损伤时，可以促进皮肤修复、抑制炎症、减少留疤等。
由图5-6的测试结果可知，治疗期间，阳性组小鼠体重呈下降趋势；空白组小鼠体重略呈上升趋势；其余组较平稳。阳性组小鼠治疗第3天后开始食欲不佳，反应迟缓，除阳性组外各小鼠的饮食情况正常，精神良好，反应迅速，行为敏捷，毛发光亮，呼吸正常。除高剂量组与对照组之间无显著性差异，其他各组之间均有显著性差异。
由图7的测试结果可知，造模后，连续给药7d，发现低剂量组软膏治疗效果最佳，创面愈合率较高，高剂量组、对照组次之，而阳性组伤口闭合速率较慢。其中低剂量组和高剂量组恢复至1级，阳性组和对照组恢复至2级。空白组恢复最慢，伤口面积还较大。
测试例3
血常规分析脏器指数测定
测试样品：应用例1提供的软膏；
I.血常规分析
分别在首次给药前24h、首次给药4d后、末次给药后24h对各组小鼠做血常规分析。具体步骤如下：
(1)分别吸取500μL生理盐水于2mL离心管中，准备止血棉球、毛细管、洗耳球、手术剪于一旁，将全自动血液分析仪开机、清洗；
(2)戴上手套，按组按序号1-15进行取血，用酒精棉球擦拭小鼠尾端，将洗耳球插入毛细管一端；
(3)用剪刀剪去约1mm尾巴，弃第一滴血，按压洗耳球，靠近出血处，慢慢松开洗耳球，控制血液达到第一条黑线处即可。迅速放入离心管，并轻轻吹打2-3次，置于探头下，自动吸取样品进行分析；
(4)拍照记录。
具体测试结果如图8-11所示，结果表明，各组之间的粒细胞、淋巴细胞、白细胞、血小板均无显著性差异(P>0.05)，但依据治疗前、治疗中、治疗后所测得血常规分析，猪胎盘冻干粉低剂量组及高剂量组的白细胞总数及淋巴细胞总数与空白组相比，呈现上升趋势，而淋巴细胞增殖的能力高低与机体免疫力的强弱呈线性关系，说明猪胎盘冻干粉在一定程度上可以增强小鼠的免疫能力，但是显著性不明显。可能是因为本实验是采用局部给药，对全身系统影响较小。
II.脏器指数测定
最后一次给药后24h，采用脊椎脱臼法处死小鼠，用酒精将解剖工具消毒，取出小鼠胸腺和脾脏及其他器官，分别称重，计算小鼠脾脏、睾丸、肝脏指数。脾脏指数＝脾脏质量(mg)/体质量(g)；睾丸指数＝睾丸质量(mg)/体质量(g)；肝脏指数＝肝脏质量(mg)/体质量(g)。
具体测试结果如下表8所和图9-11所示：
表8
Figure BDA0003739847040000241
Figure BDA0003739847040000251
实验结果表明，各组之间对小鼠的脾脏、睾丸、肝脏均没有显著性影响(P>0.05)，可能是由于皮肤给药方式对机体的影响较缓慢，其具体原因有待进一步探索。猪胎盘冻干粉对脾脏指数影响不明显，说明对其免疫器官无明显影响；而阳性组小鼠的睾丸指数最大，提示伤口护理软膏对小鼠生殖器官有一定的刺激，但影响不显著。其中各组的肝脏指数无显著性差异，说明小鼠肝脏无损伤，猪胎盘冻干粉软膏及伤迪伤口护理软膏皮肤给药安全无毒。
综上所述，各组小鼠之间的体重出现显著性差异，脾脏指数、睾丸指数、肝脏指数以及白细胞总数、淋巴细胞、粒细胞、血小板之间没有显著性差异。但是猪胎盘低剂量组及高剂量组的淋巴细胞总数呈现上升趋势，说明在一定程度上，该组小鼠的免疫能力得到提升。根据创面情况分析，猪胎盘软膏低剂量组的疗效是最佳的，高剂量组次之。因此，本发明成功研制出一款促进皮肤创面修复的猪胎盘冻干粉软膏，其具体机制有待进一步研究。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的猪胎盘冻干粉的制备方法及由其制备得到软膏和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种猪胎盘冻干粉的制备方法，其特征在于，所述猪胎盘冻干粉的制备方法包括以下步骤：
(1)将猪胎盘和水混合，进行低温高速匀浆，得到匀浆液；
(2)将步骤(1)得到的匀浆液进行超声波细胞破壁，得到破碎液；
(3)将步骤(2)得到的破碎液先进行超低温凝固，再进行冷冻干燥，得到所述猪胎盘冻干粉。
2.根据权利要求1所述的猪胎盘冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述猪胎盘由以下步骤得到：将冷冻保存的猪胎盘在0-4℃下解冻1-3h，去除筋膜后，再采用去离子水反复清洗3-4次直到去除血水，最后剪碎，得到体积为1-1.5cm3的猪胎盘；
优选地，步骤(1)中，所述猪胎盘和水的质量比为1:(1-2)；
优选地，步骤(1)中，所述低温高速匀浆的参数为：转速6000-12000rpm，0.5-2min/次，连续8-12次，间隔5-10s，控温0-4℃；
优选地，步骤(2)中，所述超声波细胞破壁的参数为：功率130-150W，每工作5-15s，间歇5-15s，单次运行时间10-30min，控温-4～4℃；
优选地，步骤(3)中，所述超低温凝固的温度为-80～-25℃，超低温凝固的时间为1-3天；
优选地，步骤(3)中，所述冷冻干燥在真空冷冻干燥机内进行；
优选地，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-80～-50℃，冷冻干燥的压力为1-3MPa，冷冻干燥的时间为1-3天。
3.一种猪胎盘冻干粉，其特征在于，所述猪胎盘冻干粉由如权利要求1或2所述的猪胎盘冻干粉的制备方法制备得到。
4.一种如权利要求3猪胎盘冻干粉中可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括PBS提取法和/或裂解液提取法。
5.根据权利要求4所述的猪胎盘冻干粉中可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，所述提取方法为裂解液提取法，所述提取方法具体包括以下步骤：将所述猪胎盘冻干粉和RIPALysis Buffer II裂解液混合，冰浴静置、离心，收集上清液，得到猪胎盘蛋白的提取液；
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述胎盘冻干粉和RIPA Lysis Buffer II裂解液质量为1:(1-10)，优选为1:3；
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述静置的温度为-4～4℃，静置的时间为10-30min；
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述离心的转速为10000-15000rpm，离心的温度为3-5℃，离心的时间为5-10min；
优选地，所述提取方法为裂解液提取法，所述猪胎盘蛋白的提取液中蛋白的含量为4.67～5.27μg/mL。
6.根据权利要求4所述的猪胎盘冻干粉中可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，所述提取方法为PBS提取法，所述提取方法具体包括以下步骤：将所述猪胎盘冻干粉和PBS缓冲液混合，进行超声波细胞破壁后，静置、离心，收集上清液，得到猪胎盘蛋白的提取液；
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述猪胎盘冻干粉和PBS缓冲液的质量比为1:(1-10)，优选为1:5；
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述静置的温度为20～30℃，静置的时间为60-90min；
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述离心的转速为10000-15000rpm，离心的温度为3-5℃，离心的时间为10-20min；
优选地，所述提取方法为PBS提取法，所述猪胎盘蛋白的提取液中蛋白的含量为4.28～5.90μg/mL。
7.一种软膏，其特征在于，所述软膏包括羊毛脂、紫苏籽油和如权利要求3所述的猪胎盘冻干粉。
8.根据权利要求7所述的软膏，其特征在于，所述羊毛脂、紫苏籽油和猪胎盘冻干粉的质量比为(8-12):(6-10):(0.5-1.5)。
9.根据权利要求7或8所述的软膏，其特征在于，所述软膏还包括凡士林；
优选地，所述软膏按质量百分含量计由以下组分组成：羊毛脂8-12％、紫苏籽油6-10％、猪胎盘冻干粉0.5-1.5％，余量为凡士林。
10.一种根据权利要求3所述的猪胎盘冻干粉、权利要求7-9中任一项所述的软膏在制备皮肤修复产品中的应用。
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