CN115040505B - 一种光甘草定复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种光甘草定复合物及其制备方法和应用，属于食品药品技术领域。本发明的光甘草定复合物，包括光甘草定包合物和壳聚糖。采用磺丁基‑β‑环糊精包合光甘草定，可以提高光甘草定在水中的溶解度。壳聚糖可以通过静电作用与磺丁基‑β‑环糊精结合得到光甘草定复合物。壳聚糖对光甘草定包合物具有缓、控释的作用，并且可提高光甘草定复合物的粘膜粘附性，有助于开启细胞旁路途径，形成的复合物可通过胞吞作用被小肠上皮细胞摄取。本发明的光甘草定复合物可极大程度地提高光甘草定透过肠上皮表面黏液层的能力以及通过小肠上皮细胞的跨膜转运能力，从而促进光甘草定的小肠吸收，提高其口服生物利用度。

Description

一种光甘草定复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种光甘草定复合物及其制备方法和应用，属于食品药品技术领域。
背景技术
光甘草定具有多种生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗动脉粥样硬化、保护神经等。但是光甘草定的口服生物利用度低，影响了其在在体内生物活性的充分发挥。影响光甘草定口服生物利用度的主要因素包括：光甘草定的溶解度小，使其在胃肠液的浓度低；小肠黏液层的透过性、小肠上皮细胞的透过性差等。为了提高光甘草定在水中的溶解度，可以将光甘草定制备成光甘草定包合物。例如，中国专利申请CN 113616548 A公开了一种水溶性光甘草定包合物及其制备方法，该水溶性光甘草定包合物采用2-磺丁基-β-环糊精包合光甘草定而成，该水溶性光甘草定包合物的溶解度以光甘草定计不低于80mg/mL，较好地提高了光甘草定在水中的溶解度。
目前现有的关于光甘草定生物利用度的相关研究及专利技术都旨在提高其透皮吸收率/皮肤滞留量的制剂，属于化妆品技术领域。例如，中国专利申请CN110169928A公开了一种光甘草定多重包裹固体制剂及其制备方法，该光甘草定固体制剂由以下重量百分比的组分组成：光甘草定0.5-20％、环糊精衍生物0.5-40％、甘草多糖1-20％、甘草酸0.1-20％。该光甘草定多重包裹固体制剂的制备方法包括以下步骤：将含光甘草定的提取物溶于乙醇溶液中，再加入一定比例的环糊精衍生物，加热搅拌，直至完全溶解；浓缩至固体刚好析出时，再加入一定比例的甘草多糖和甘草酸水溶液，加少量乙醇至溶液澄清；调剂pH，加热搅拌，浓缩，真空干燥，即得。该专利申请公开的光甘草定多重包裹固体制剂具有良好的水溶性好、安全风险小、稳定性高、缓释透皮性好等优点。但是目前未见关于提高光甘草定口服生物利用度的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光甘草定复合物，可以解决目前光甘草定存在口服生物利用度低的问题。
本发明的第二个目的在于提供一种光甘草定复合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种光甘草定复合物在制备食品或药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明的光甘草定复合物所采用的技术方案为：
一种光甘草定复合物，包括光甘草定包合物和壳聚糖；所述光甘草定包合物由磺丁基-β-环糊精包合光甘草定而成。
本发明的光甘草定复合物，包括光甘草定包合物和壳聚糖。采用磺丁基-β-环糊精包合光甘草定，可以提高光甘草定在水中的溶解度。壳聚糖可以通过静电作用与磺丁基-β-环糊精结合得到光甘草定复合物。壳聚糖对光甘草定包合物具有缓、控释的作用，并且可提高光甘草定复合物的粘膜粘附性，有助于开启细胞旁路途径，有利于光甘草定复合物通过内吞作用被小肠上皮细胞摄取和吸收。因此，本发明的光甘草定复合物可极大程度地提高光甘草定透过肠上皮表面黏液层的能力以及通过小肠上皮细胞的跨膜转运能力，从而提高光甘草定的小肠吸收，进而提高其口服生物利用度。
可以理解的是，包合物结构中含有两种结构单位，即包合物是由两种化合物组成的:一种是能将其他化合物囚禁在它的结构骨架空穴里的化合物，称为包合剂或主体分子；另一种是被囚禁在包合剂结构的空穴或孔道中的化合物，称为被包合剂或客体分子。本发明中能形成空穴或孔道的化合物为磺丁基-β-环糊精。
可以理解的是，光甘草定复合物是由光甘草定包合物和壳聚糖通过非化学键作用结合形成。本发明中，所述非化学键作用主要为静电作用。
优选地，所述磺丁基-β-环糊精为2-磺丁基-β-环糊精。
优选地，采用磺丁基-β-环糊精包合光甘草定时，磺丁基-β-环糊精和光甘草定的摩尔比为1:1。
优选地，所述光甘草定包合物中的磺丁基-β-环糊精和光甘草定的摩尔比为1:1。
优选地，所述壳聚糖的粘均分子量为5万～31万Da。
优选地，所述光甘草定包合物和壳聚糖的质量比为(1～2):(1～2)。
优选地，所述光甘草定复合物为颗粒状或薄膜片状。
优选地，所述光甘草定复合物为颗粒状时，粒径不大于5μm。
本发明的光甘草定复合物的制备方法所采用的技术方案为：
一种光甘草定复合物的制备方法，包括以下步骤：将光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液混合使光甘草定包合物和壳聚糖进行复合，得到含有固体颗粒的分散液，然后将分散液进行干燥，得到光甘草定复合物；所述固体颗粒的平均粒径为350～800nm。
本发明的光甘草定复合物的制备方法操作简单，制备得到的光甘草定复合物可极大程度地提高光甘草定透过肠上皮表面黏液层的能力以及通过小肠上皮细胞的跨膜转运能力，从而提高光甘草定的小肠吸收，进而提高其口服生物利用度。固体颗粒的平均粒径为350～800nm，不仅可以保证固体颗粒在分散液中有良好的分散稳定性，也可保证制备的复合物通过黏蛋白构成的黏液层的“筛孔”，并通过胞吞方式被小肠上皮细胞摄取。
可以理解的是，所述固体颗粒由光甘草定包合物和壳聚糖复合(光甘草定包合物和壳聚糖通过非化学键作用结合)形成。将制备得到的光甘草定复合物分散于水中时，可得到平均粒径为350～800nm的固体颗粒的分散液。
优选地，光甘草定复合物的制备方法中，所述磺丁基-β-环糊精为2-磺丁基-β-环糊精。
优选地，光甘草定复合物的制备方法中，所述光甘草定包合物中的磺丁基-β-环糊精和光甘草定的摩尔比为1:1。
优选地，光甘草定复合物的制备方法中，所述壳聚糖的粘均分子量为5万～31万Da。
优选地，光甘草定复合物的制备方法中，所述光甘草定包合物溶液中光甘草定包合物的质量和壳聚糖溶液中壳聚糖的质量之比为(1～2):(1～2)。
优选地，光甘草定复合物的制备方法中，所述光甘草定复合物为颗粒状或薄膜片状。
优选地，光甘草定复合物的制备方法中，所述光甘草定复合物为颗粒状时，粒径不大于5μm。
优选地，所述光甘草定包合物溶液的pH为3～5.5。优选地，所述壳聚糖溶液的pH为3～5.5。优选地，所述光甘草定包合物溶液的质量体积浓度为2.5～10g/L。优选地，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为1.7～10g/L。
优选地，所述光甘草定包合物溶液主要由光甘草定包合物和水组成。优选地，所述光甘草定包合物溶液还包括pH调节剂。优选地，所述光甘草定包合物溶液中的pH调节剂为NaOH或盐酸。
优选地，所述光甘草定包合物溶液由光甘草定包合物溶于水后再用pH调节剂调节pH得到。
优选地，所述壳聚糖溶液主要由壳聚糖、水和醋酸组成。优选地，所述壳聚糖溶液中水和醋酸的质量比为(99～99.5):(0.5～1)。例如，所述壳聚糖溶液中水和醋酸的质量比为99:1。优选地，所述壳聚糖溶液还包括pH调节剂。优选地，所述壳聚糖溶液中的pH调节剂为NaOH或盐酸。优选地，所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶于水和醋酸组成的溶剂后再用pH调节剂调节pH得到。
优选地，所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶于由水和醋酸组成的混合溶剂中后再用pH调节剂调节pH得到。优选地，所述混合溶剂中水和醋酸的质量比为(99～99.5):(0.5～1)。
优选地，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的体积比为1:1。
优选地，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的pH值相等。
优选地，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:1、1:2或2:1。
优选地，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:2，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为6.6g/L，所述壳聚糖溶液的pH为4.5～5.5。
优选地，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:2，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为10g/L，所述壳聚糖溶液的pH为5.5。
优选地，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为2:1，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为1.7g/L，所述壳聚糖溶液的pH为3～4。
进一步优选地，所述所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:2，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为6.6g/L，所述壳聚糖溶液的pH为5。
优选地，所述干燥为喷雾干燥或者冷冻干燥。
优选地，所述光甘草定包合物由包括以下步骤的方法制得：将磺丁基-β-环糊精溶液和光甘草定溶液进行混合，得到混合液，再将混合液进行干燥，即得。
优选地，所述光甘草定包合物的粒度不大于80目。
优选地，所述磺丁基-β-环糊精溶液中的磺丁基-β-环糊精的摩尔量和光甘草定溶液中的光甘草定的摩尔量之比为1:1。
优选地，所述磺丁基-β-环糊精溶液由磺丁基-β-环糊精和磺丁基-β-环糊精的良性溶剂组成。优选地，所述磺丁基-β-环糊精的良性溶剂为水。优选地，所述磺丁基-β-环糊精溶液中磺丁基-β-环糊精的浓度为0.04mol/L。
优选地，所述光甘草定溶液由光甘草定和光甘草定的良性溶剂组成。优选地，所述光甘草定的良性溶剂为乙醇。优选地，所述光甘草定溶液中光甘草定的浓度为30mg/mL。
优选地，所述混合在震荡和搅拌条件下进行。优选地，所述混合的时间为20～28h。例如，所述混合的时间为24h。
优选地，光甘草定包合物的制备方法中，所述干燥是先去除混合液中的光甘草定的良性溶剂，再去除混合液中的磺丁基-β-环糊精的良性溶剂。优选地，去除混合液中的光甘草定的良性溶剂采用旋转蒸发法进行。优选地，所述旋转蒸发法采用的温度为45℃。优选地，去除混合液中的磺丁基-β-环糊精的良性溶剂采用冷冻干燥或喷雾干燥进行。优选地，采用冷冻干燥去除混合液中的磺丁基-β-环糊精的良性溶剂的方法包括以下步骤：首先将去除光甘草定的良性溶剂的混合液在-20℃下预冻12h，然后再置于冷冻干燥机中冻干。为了获得粒度不大于80目的光甘草定包合物，可以将冻干物进行粉碎，例如研磨。
本发明的光甘草定复合物在制备食品或药物中的应用所采用的技术方案为：
一种上述光甘草定复合物的制备方法制备的光甘草定复合物在制备食品或药物中的应用。
将本发明的光甘草定复合物用于制备食品或药物，可以提高光甘草定的口服生物利用度。例如，所述食品为保健品。
附图说明
图1为实验例1中实施例21-23中制备的分散液中的复合物的粒径分布示意图；
图2为实验例2中实施例22制备的光甘草定复合物的外观图；
图3为实验例2中实施例40制备的光甘草定复合物的外观图；
图4为实验例2中对比例18制备的光甘草定复合物的外观图；
图5为实验例2中对比例19制备的光甘草定复合物的外观图；
图6为实验例3中光甘草定的扫描电镜图；
图7为实验例3中2-磺丁基-β-环糊精的扫描电镜图；
图8为实验例3中壳聚糖的扫描电镜图；
图9为实验例3中对比例18制备的复合物的扫描电镜图；
图10为实验例3中实施例22制备的光甘草定复合物的扫描电镜图；
图11为实验例4中光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、对比例18和实施例22制备的复合物的DSC曲线示意图；
图12为实验例5中光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、对比例18和实施例22制备的复合物的红外光谱图；
图13为实验例6中光甘草定分散液在黏液层中培养时间为6h时测试对应的滤液中的光甘草定得到的HPLC谱图，其中，横坐标为时间，单位为min，纵坐标为峰高，单位为mAU；
图14为实验例7中不同浓度的光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物样品测试液处理的细胞的存活率的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。
一、本发明的光甘草定复合物的具体实施例如下：
实施例1-20的光甘草定复合物，包括光甘草定包合物和壳聚糖，光甘草定包合物由2-磺丁基-β-环糊精包合光甘草定而成，光甘草定包合物中的磺丁基-β-环糊精和光甘草定的摩尔比为1:1，壳聚糖的粘均分子量为5万～19万Da，壳聚糖和光甘草定包合物的质量比为a:b。实施例1-20的光甘草定复合物中壳聚糖和光甘草定包合物的质量比和外观如表1所示。
表1实施例1-20的光甘草定复合物的外观以及复合物中壳聚糖和光甘草定包合物的质量比
二、本发明的光甘草定复合物的制备方法的具体实施例如下：
实施例21-40的光甘草定复合物的制备方法依次分别为实施例1-20的光甘草定复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)首先将2-磺丁基-β-环糊精(2-SBE-β-CD)用去离子水进行溶解，得到浓度为0.04mol/L的2-SBE-β-CD溶液；然后将光甘草定(GLD)用适量乙醇溶解，得到浓度为30mg/mL的GLD溶液；最后将GLD溶液加入到2-SBE-β-CD溶液中(GLD溶液中的GLD的摩尔量和2-SBE-β-CD溶液中的2-SBE-β-CD摩尔量之比为1:1)，在温度为25℃和转速为200r/min的条件下振荡24h，得到光甘草定包合物溶液，再通过旋转蒸发器(45℃)除去光甘草定包合物溶液中的乙醇，然后将除去乙醇的光甘草定包合物溶液在-20℃的冰箱中预冻12h，再置于冷冻干燥机中冻干，得到冻干物，再将冻干物研磨后过80目筛，得到粒度不大于80目的粉末状干燥物，即为光甘草定包合物，用GLD/SBE-β-CD表示。
(2)将步骤(1)制备的光甘草定包合物用去离子水溶解，得到质量体积浓度为0.1g/L的光甘草定包合物溶液；再将粘均分子量为5万～19万Da的壳聚糖用质量分数为1％的醋酸溶液溶解，得到质量体积浓度为0.01g/L的壳聚糖溶液；然后分别用NaOH溶液或盐酸稀释光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液，得到pH值相同的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液，稀释后的壳聚糖溶液和光甘草定包合物溶液的质量体积浓度分别为x g/L和y g/L，再将体积比为1:1的稀释后的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液进行混合，得到光甘草定包合物和壳聚糖复合而成的固体颗粒的分散液。
(3)将步骤(2)得到的分散液进行干燥，得到光甘草定复合物。
实施例1-20中步骤(2)中采用的pH和质量体积浓度的具体取值以及步骤(3)中采用的干燥方法如表2所示。
表2实施例1-20中步骤(2)中采用的pH和质量体积浓度的具体取值以及步骤(3)中采用的干燥方法
对比例1-17的光甘草定复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)首先将2-磺丁基-β-环糊精(2-SBE-β-CD)用去离子水进行溶解，得到浓度为0.04mol/L的2-SBE-β-CD溶液；然后将光甘草定(GLD)用适量乙醇溶解，得到浓度为30mg/mL的GLD溶液；最后将GLD溶液加入到2-SBE-β-CD溶液中，在温度为25℃和转速为200r/min的条件下振荡24h，得到光甘草定包合物溶液，再通过旋转蒸发器(45℃)除去光甘草定包合物溶液中的乙醇，然后将除去乙醇的光甘草定包合物溶液在-20℃的冰箱中预冻12h，再置于冷冻干燥机中冻干，得到冻干物，再将冻干物研磨后过80目筛，得到粒度小于80目的粉末状干燥物，即为光甘草定包合物。
(2)将步骤(1)制备的光甘草定包合物用去离子水溶解，得到质量体积浓度为0.1g/L的光甘草定包合物溶液；再将粘均分子量为5万～19万Da的壳聚糖用质量分数为1％的醋酸溶液溶解，得到质量体积浓度为0.01g/L的壳聚糖溶液；然后分别用NaOH溶液或盐酸稀释光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液，得到pH值相同的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液，稀释后的壳聚糖溶液和光甘草定包合物溶液的质量体积浓度分别为m g/L和n g/L，再将体积比为1:1的稀释后的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液进行混合，得到分散液。
(3)将步骤(2)得到的分散液进行干燥，得到光甘草定复合物。
对比例1-17中步骤(2)中采用的pH和质量体积浓度的具体取值以及步骤(3)中采用的干燥方法如表3所示。
表3对比例1-17中步骤(2)中采用的pH和质量体积浓度的具体取值以及步骤(3)中采用的干燥方法
对比例18
本对比例的复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)首先将2-磺丁基-β-环糊精(2-SBE-β-CD)用去离子水进行溶解，得到浓度为0.1g/L的2-SBE-β-CD溶液；再将粘均分子量为5万～19万Da的壳聚糖用质量分数为1％的醋酸溶液溶解，得到质量体积浓度为0.01g/L的壳聚糖溶液；然后分别用盐酸稀释2-SBE-β-CD溶液和壳聚糖溶液，得到pH值均为5.0的2-SBE-β-CD溶液和壳聚糖溶液，稀释后的2-SBE-β-CD溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度分别为6.6和3.3g/L，再将体积比为1:1的稀释后的2-SBE-β-CD溶液和壳聚糖溶液进行混合，得到混合液。
(2)将步骤(1)得到的混合液进行喷雾干燥，得到复合物。
对比例19
本对比例的复合物的制备方法与对比例18的复合物的制备方法的区别仅在于，步骤(3)中采用冷冻干燥。
三、本发明的光甘草定复合物在制备食品或药物中的应用的具体实施例如下：
将实施例21-40中任一光甘草定复合物的制备方法制备的光甘草定复合物制备成食品或药物即可，此处不再赘述。
实验例1
为了确定光甘草定复合物的制备方法中步骤(2)中复合物的分散液的形成条件，将实施例21-39和对比例1-17的步骤(2)的混合液在室温条件下静置48h，然后观察分散液和混合液中固体颗粒的稳定性。结果表明，实施例21-39中复合物的分散液在室温条件下静置48h后，未出现固体颗粒团聚和沉淀析出，而对比例1-7的步骤(2)的混合液为澄清透明溶液，对比例8-17的步骤(2)的混合液在静置48h后存在沉淀析出的现象。说明实施例21-39中的复合物可在分散液中稳定分散。
为了考察不同分子量的壳聚糖对复合物分散液形成条件的影响，按照实施例21-40中的方法将壳聚糖的粘均分子量由5万～19万Da替换为19万～31万Da时，制备的复合物的分散液在室温条件下静置48h后，未出现固体颗粒团聚和沉淀析出，说明粘均分子量为19万～31万Da的壳聚糖也可以与光甘草定包合物形成能够在分散液中稳定分散的复合物。而按照实施例21-40中的方法将壳聚糖的粘均分子量由5万～19万Da替换为31万～375万Da时，制备的复合物的分散液在室温条件下静置48h后，出现固体颗粒团聚和沉淀析出，说明粘均分子量为31万～375万Da的壳聚糖不能与光甘草定包合物形成稳定的分散液。
因此，实施例21-39中制备的分散液的稳定性较好，说明当稀释后的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:1且稀释后的光甘草定包合物溶液的质量体积浓度为0.00125～0.005g/L时，稀释后的pH为3～5.5的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液混合后均能形成稳定的分散液。当稀释后的壳聚糖溶液和光甘草定包合物溶液的质量体积浓度之比为2:1且稀释后的壳聚糖溶液的质量体积浓度为0.0034g/L时，稀释后的pH为4.5～5.5的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液混合后均能形成稳定的分散液。当稀释后的壳聚糖溶液和光甘草定包合物溶液的质量体积浓度之比为2:1且稀释后的壳聚糖溶液的质量体积浓度为0.005g/L时，稀释后的pH为5.5的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液混合后均能形成稳定的分散液。当稀释后的壳聚糖溶液和光甘草定包合物溶液的质量体积浓度之比为1:2且稀释后的壳聚糖溶液的质量体积浓度为0.0008g/L时，稀释后的pH为3～4的光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液混合后均能形成稳定的分散液。
然后将实施例21-23中制备的分散液采用等pH的盐酸稀释50倍，再采用Nano-ZS90动态光散射粒度仪测定稀释后的分散液中的复合物的粒度、分布强度和分散系数PDI，测试温度为25℃，分散介质为水，测量次数选择Automatic，每个样品重复测三次取平均值。最后采用zeta电位分析仪测定稀释后的分散液中的复合物的表面电位，实施例21-23中制备的分散液中的复合物分别用GLD/2-SBE-β-CD/CS(4.5)、GLD/2-SBE-β-CD/CS(5.0)和GLD/2-SBE-β-CD/CS(5.5)表示，测试结果如图1和表4所示。
表4实施例1-3中制备的分散液中的复合物的粒度、体积分布、分散系数PDI和表面电位
结果表明，实施例22中制备的分散液中的复合物的粒径分布呈单峰状，平均粒径为596.77nm；PDI值较小，为0.28；Zeta电位为27.33mV；说明实施例22中制备的分散液中的复合物的表面带正电荷、且粒径分布均匀。Zeta电位能在一定程度上反应复合物分散体系的静电稳定性，Zeta电位越高，离子间静电斥力越大，粒子越不容易相互吸引而发生凝聚，稳定性越好。由此可预测实施例22中制备的分散液中的复合物的稳定性较好。实施例21和实施例23中制备的分散液中的复合物的平均粒径分别为362nm和661nm，Zeta电位分别为25.87mV和-0.91mV(接近电中性)，说明光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的pH对制备的分散液中的复合物的粒径和表面电位有显著影响。
虽然实施例21中制备的分散液中的复合物的粒径较小，同时带有较多的正电荷，但其粒度分布呈三峰，PDI值较大。因此，综合考虑粒径和表面电位的测定结果，实施例22中制备的分散液中的复合物具有最优的综合性能。
实验例2
通过观察实施例22和实施例40以及对比例18-19制备的光甘草定复合物外观来考察干燥方法对制备的光甘草定复合物外观的影响，实验结果如图2-5所示。结果表明，喷雾干燥法制得的光甘草定复合物呈分散性较好的粉末状，冷冻干燥法制得的光甘草定复合物呈现出薄膜片状结构。对比例18-19中制备的不含有光甘草定的制剂的形态分别为粉末状和薄膜片状。
将实施例22和实施例40制备的光甘草定复合物进行复溶性实验，结果显示实施例22和实施例40制备的光甘草定复合物的复溶性无明显差异。复溶性实验是测试光甘草定复合物在25℃时于1mL水中的最大溶解量。
实验例3
采用扫描电镜观察光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、对比例18和实施例22制备的复合物的形貌，结果如图6-10所示。结果表明，光甘草定呈柱状晶体结构，轮廓清晰；2-磺丁基-β-环糊精为大小不一、表面光滑并有凹陷的球状结构，粒径均在60μm以内；壳聚糖呈现不规则的块状结构；实施例22和对比例18制备的复合物均为颗粒，呈明显的扁球形结构，部分颗粒表面呈现缩皱现象，粒径均在5μm以内，并且实施例22制备的光甘草定复合物的粒径略大于对比例18制备的复合物的粒径，这可能是由于2-磺丁基-β-环糊精内部包合有光甘草定所致。
实验例4
采用差示扫描量热仪分别测试了光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、对比例18和实施例22制备的复合物的DSC曲线，测试所需的样品均为5mg，温度扫描范围为25℃～300℃，升温速率为10℃/min，氮气流量为10mL/min，测试时以空盘做参比，测试结果如图11所示，其中，光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、实施例22和对比例18制备的复合物分别用GLD、2-SBE-β-CD、CS、GLD/2-SBE-β-CD/CS和2-SBE-β-CD/CS表示。结果表明，光甘草定的DSC曲线在233℃处有尖锐的熔融峰，说明光甘草定的熔点为233℃。2-磺丁基-β-环糊精的DSC曲线有两个峰，第一个峰矮而宽，出现在40～160℃处，是由水从2-磺丁基-β-环糊精空腔内释放而产生的吸热峰；第二个峰位于270℃处，属于吸热峰，此峰代表2-磺丁基-β-环糊精的分解。壳聚糖的DSC曲线在88℃处有一个矮而宽的吸热峰，可能是由于壳聚糖分子中有结晶水存在。实施例22和对比例18制备的复合物的DSC曲线均在100℃附近有吸热峰，并且未在270℃处出现峰，说明壳聚糖成功与光甘草定包合物复合，进而有效阻止了2-磺丁基-β-环糊精的分解。另外，实施例22制备的光甘草定复合物的DSC曲线中未出现光甘草定的熔点峰，说明光甘草定被包裹在2-磺丁基-β-环糊精内部，以非晶态的结构存在。
实验例5
分别通过红外光谱表征了光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、实施例22和对比例18制备的复合物的结构。测试方法如下：称取样品适量，将样品与KBr粉末以质量比1:100混合，然后放入研钵内充分研磨，再采用压片法制得样品薄片，将样品薄片放入仪器内进行光谱扫描。扫描条件为：扫描范围为400cm-1～4000cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。以纯KBr粉末作背景单通道扫描。测试结果如图12所示，其中，光甘草定、2-磺丁基-β-环糊精、壳聚糖、实施例22和对比例18制备的复合物分别用GLD、2-SBE-β-CD、CS、GLD/2-SBE-β-CD/CS和2-SBE-β-CD/CS表示。结果表明，在光甘草定的红外光谱图中，在3346cm-1处出现了一个强而宽的峰，为O-H的伸缩振动峰，位于1518cm-1、1464cm-1处的峰为芳香环C＝C的伸缩振动峰，位于2964cm-1、2920cm-1处的峰为-CH3的吸收峰。
在2-磺丁基-β-环糊精的红外光谱图中，位于3430cm-1附近的峰为O-H伸缩振动相关的特征峰，位于2935cm-1处的峰为C-H的伸缩振动峰，位于1653cm-1处的峰为水分子H-O-H的弯曲振动峰，位于1163cm-1、1039cm-1处的峰为C-O的伸缩振动峰。
在壳聚糖的红外光谱图中，位于3407cm-1处的宽的吸收峰是由壳聚糖分子中氨基的N-H伸缩振动产生的，位于2877cm-1处的峰为饱和C-H的伸缩振动吸收峰，位于1655cm-1处的峰为酰胺I带的特征峰，是酰胺中C＝O的伸缩振动产生的吸收峰，裂缝的原因是酰胺的C＝O与O-H、N-H形成不同的氢键所造成的。位于1582cm-1处的峰为酰胺II带的特征峰，是由于N-H的面内弯曲和C-N伸缩振动混合在一起造成的，位于1378cm-1处的峰为酰胺III带的特征峰，是N-H的面外弯曲特征峰。位于1414cm-1处的峰为C-H弯曲振动的吸收峰，位于1156cm-1处的峰为氧桥C-O-C的反对称伸缩振动的吸收峰，位于1085cm-1处的峰为苯环的反对称伸缩振动的吸收峰。
实施例22和对比例18制备的复合物的红外光谱图无显著差异，在3428cm-1处出现的宽且钝化的吸收峰是由于壳聚糖分子中的N-H、O-H以及2-磺丁基-β-环糊精分子中的O-H与多种基团产生氢键所造成的。位于1641cm-1处的峰是酰胺基I带的特征峰。与壳聚糖的红外光谱图相比，光甘草定复合物的红外光谱图中的酰胺基I带的特征峰发生了红移现象，这可能是由于负电子的磺酸基的引入，影响了酰胺基的电子云密度，造成羰基C＝O的键长增加，伸缩振动吸收峰向低波长方向移动。位于1563cm-1处的峰为N-H的面内弯曲和C-N伸缩振动的混合吸收峰，为酰胺II带的特征峰。与壳聚糖的红外光谱图相比，光甘草定复合物的红外光谱图中的酰胺II带的特征峰发生了较大的红移现象，这正是由于磺酸基负离子与质子化氨基之间存在静电结合作用，使C-N键与N-H键增长，吸收峰向低波长处移动所致。并且实施例22制备的光甘草定复合物的红外光谱图中无光甘草定的吸收特征峰，表明光甘草定被完全包裹在2-磺丁基-β-环糊精内部。这些结果有效地证明了光甘草定复合物的形成。
实验例6
利用Transwell小室法研究了光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物在黏液层中的渗透行为。
Transwell小室法包括以下步骤：(1)首先配制pH＝7.4的PBS缓冲液，然后称取20mg黏蛋白，再将黏蛋白溶于1mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，得到浓度为20mg/mL的黏蛋白溶液，以该黏蛋白溶液作为黏液层。(2)利用24孔Transwell小室研究光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物在黏液层中的扩散行为。Transwell小室包含一个供体室和一个受体室，供体室和受体室之间设置有聚碳酸酯半透膜，聚碳酸酯半透膜能允许粒子穿过但不允许粘液渗透通过。Transwell小室在使用前，供体室加入200μL pH＝7.4的PBS缓冲液，受体室中加入1000μL pH＝7.4的PBS缓冲液，平衡30min。平衡结束后，将40μL黏蛋白溶液加入到供体室中，再将1000μL pH＝7.4的PBS缓冲液加入到受体室中，然后将体积为200μL的光甘草定分散液(溶剂由质量比为1:99的DMSO和水组成)、实施例22中制备的光甘草定包合物分散液(溶剂为去离子水)或实施例22制备的光甘草定复合物分散液(溶剂为去离子水)加入至供体室中，再将Transwell小室置于温度为37℃、转速为100rpm的摇床上培养6h，分别于培养时间为1、2、3、4、5、6h时，从受体室取出0.15mL液体，并向受体室中加入0.15mL温度为37℃的PBS缓冲液(pH＝7.4)，然后测试从受体室中取出的液体中光甘草定的含量。光甘草定分散液、实施例22中制备的光甘草定包合物分散液和实施例22制备的光甘草定复合物分散液中光甘草定的浓度均为1mg/mL。
测试样品为光甘草定时，首先将从受体室中取出的液体置于冷冻干燥机中冻干，再加入200μL乙腈复溶，然后用0.45μm滤膜过滤，最后采用HPLC法检测滤液中光甘草定的含量，光甘草定在黏液层中培养时间为6h时测试对应的滤液中的光甘草定得到的HPLC谱图如图13所示。HPLC法采用的仪器为依利特Eclassical 3100高效液相色谱系统，色谱条件如下：色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×250nm，1.7μm)；流动相A为质量分数为1％的冰醋酸的水溶液，流动相B为乙腈，采用A:B＝40:60进行等度洗脱；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样量为20μL；检测波长为281nm。为了通过测试滤液中光甘草定的峰面积以得到滤液中光甘草定的含量，首先选取光甘草定的浓度为10、20、40、60、80、100ng/mL的标准溶液，然后采用HPLC法测试光甘草定的峰面积，再以光甘草定的浓度为横坐标，光甘草定的峰面积为纵坐标绘制标准曲线方程，得到的标准曲线方程为y＝0.16492x+0.11758。
测试样品为实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物时，从受体室中取出的液体可直接用紫外分光光度计检测液体的吸光度并计算其中光甘草定的含量。
然后按照式1计算光甘草定通过黏液层的表观渗透系数(Papp)：
dQ为光甘草定透过黏液层的累积渗透量(μg)；dQ/dt为单位时间渗透量(μg/s)；A为Transwell小室的孔面积(0.33cm2)；C0为初始光甘草定的浓度(μg/mL)。
累积渗透率的计算方法为：累积渗透率(％)＝(A×1.0+B)/C×100，其中，A为某一时间点检测到的光甘草定浓度，单位为μg/mL；1.0为受体室液体体积，单位为mL；B为之前所有时间点取出的光甘草定质量，单位为μg；C为供体室中加入的光甘草定总质量。
光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物在黏液层中的渗透行为的实验结果表1所示。
表1培养时间为6h时不同样品通过肠黏液层的累积渗透率和Papp值
结果表明，测试样品为光甘草定时，样品在黏液层中培养时间为6h时的累积渗透率为0.02％，渗透系数为9.24×10-9cm/s，表明光甘草定几乎无法渗透通过黏液层。
测试样品为实施例22中制备的光甘草定包合物时，样品在黏液层中的累积渗透率呈时间依赖性，培养时间为6h时的累积渗透率达到54.06％，渗透系数为1.54×10-5cm/s，显著高于光甘草定的累积渗透率和渗透系数，说明实施例22中制备的光甘草定包合物具有较强的穿透黏液层的能力，可极大程度地提高肠上皮细胞肠腔侧的光甘草定浓度。
测试样品为实施例22制备的光甘草定复合物时，样品在黏液层中的累积渗透率呈时间依赖性，培养时间为6h时的累积渗透率达到54.41％，渗透系数为1.52×10-5cm/s，显著高于光甘草定的累积渗透率和渗透系数，说明实施例22制备的光甘草定复合物具有较强的穿透黏液层的能力，可有效提高肠上皮细胞肠腔侧的光甘草定浓度。
因此，当培养时间均为6h时，实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物通过黏液层中的累积渗透率和渗透系数无显著差异。说明在提高肠黏液层的透过能力方面，两种样品的效果基本一致。
实验例7
Caco-2细胞在结构和生化特性上都与小肠上皮细胞相似，因此被国内外广泛地用于研究药物的小肠摄取和吸收。本实验采用Caco-2细胞单层膜模型模拟小肠吸收实验，通过测定目标物通过Caco-2细胞单层膜的跨膜转运率和渗透系数，研究小肠对光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例2制备的光甘草定复合物中光甘草定的吸收效果。
Caco-2细胞单层膜对光甘草定吸收的方法包括以下步骤：
(1)确定光甘草定的安全使用浓度
①样品准备：将光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物用MEM培养基溶解或分散，分别配制光甘草定浓度为10、30、50、70、90、100μmol/L的样品测试液。
②毒性实验：采用MTT法研究不同浓度的样品测试液对Caco-2细胞增殖的抑制作用，用于确定Caco-2细胞单层膜吸收实验中光甘草定的安全使用浓度。具体方法如下：将Caco-2细胞用含20％胎牛血清、100U/mL双抗的MEM培养基培养，在37℃、含5％CO2气体的恒温培养箱中培养至80％的瓶底铺满Caco-2细胞；再用胰酶消化8min，然后以1×105个/mL的浓度接种至96孔板，每孔接种200μL，培养24h。然后弃去旧培养基，加入200μL新鲜培养基或样品测试液，继续培养4h。然后再弃去旧培养基，使用PBS溶液(pH＝7.4)清洗孔板两次，再将每孔中加入200μL新鲜培养基和10μL MTT，继续培养4h。培养基结束后，倒掉培养基中液体，吸掉泡沫，再向培养基中加150μL DMSO反应10min，然后采用酶标仪测定样品在550nm处的吸光度，加样品测试液和MTT的样品测试所得的吸光度记为A2，未加样品测试液但加入MTT的样品测试所得的吸光度记为A1，未加样品测试液和MTT的样品测试所得的吸光度记为A0，最后根据式2计算细胞存活率，取细胞存活率大于85％的样品对应的光甘草定的浓度，进行后续Caco-2细胞单层膜的小肠吸收实验。
(2)Caco-2细胞转运实验
①Caco-2细胞单层模型的建立：细胞生长至80％融合后，用含0.02％EDTA的胰蛋白酶(0.25％)消化，加入新鲜DMEM培养基制成细胞悬液，取0.5mL、以3×105个/cm2密度接种至12孔Transwell板(孔径0.4μm，表面积1.12cm2)的顶侧(apical，AP)，基底外侧(basolateral，BL)加1.5mL DMEM培养基，置于37℃、含5％CO2的恒温培养箱中培养；细胞培养前5天，每两天更换培养基一次，5天后每天换液，并在接种后21天内检测其跨膜电阻值(Transepithelial electrical resistance，TEER)。
②TEER跨膜电阻的测定：采用TEER跨膜电阻值判断Caco-2细胞单层的完整性。测定跨膜电阻前，将电极插入70％乙醇溶液中浸泡15min进行灭菌，取出电极，自然风干1min；然后将电极短端浸入培养板顶侧，长端浸入培养板底侧，保证短端不能碰到膜上的细胞，长端需碰到细胞板底侧的底部，电极与培养板成90°并保持电极稳定。每孔任意位置测3次，记录电阻值(R1)，同时记录无细胞的空白孔电阻值(R0)，根据TEER＝(R1-R0)×S计算跨膜电阻值(S为膜面积，1.12cm2)。一般TEER大于250Ω·cm2，说明已形成致密完整的细胞单层，可用于转运实验。
③Caco-2细胞转运实验：取含有培养21d并制备成功的Caco-2细胞单层的Transwell培养板，弃去培养基，以37℃HBSS缓冲液(pH＝7.4)清洗细胞表面杂质，反复冲洗3次；在培养板两侧加入HBSS缓冲液(pH＝7.4)，置于37℃、含5％CO2气体的恒温培养箱中孵育30min。吸弃培养板两侧的HBSS缓冲液后，在Transwell培养板AP侧加入0.5mL含样品的HBSS缓冲液(HBSS用甲磺酸调整至pH＝6.5)，BL侧加入1.5mL不含样品的HBSS缓冲液(pH＝7.4)，置于37℃、含5％CO2气体的恒温培养箱中孵育，分别间隔一定时间于BL侧采样0.5mL并立即放入-20℃冰箱中保存，同时补充等体积的空白HBSS缓冲液(pH＝7.4)。采用HPLC法测定光甘草定含量，并计算各样品在Caco-2细胞单层膜中的转运率和表观渗透系数。
加到细胞板AP侧的样品由光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物或实施例22制备的光甘草定复合物与pH＝6.5的HBSS缓冲液混合而成，样品中光甘草定的浓度均为50μmol/L。
④光甘草定含量测定：将从BL侧采取的0.5mL样品于冷冻干燥机中冻干，再用100μL乙腈萃取光甘草定，然后用0.45μm有机膜过滤。采用HPLC法测定滤液中的光甘草定含量，仪器为依利特Eclassical 3100高效液相色谱系统，色谱条件如下：色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×250nm，1.7μm)；流动相A为质量分数为1％的冰醋酸的水溶液，流动相B为乙腈，采用A:B＝40:60进行等度洗脱；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样量为20μL；检测波长为281nm。为了通过测试滤液中光甘草定的峰面积以得到滤液中光甘草定的含量，首先选取光甘草定的浓度为10、20、40、60、80、100ng/mL的标准溶液，然后采用HPLC法测试光甘草定的峰面积，再以光甘草定的浓度为横坐标，光甘草定的峰面积为纵坐标绘制标准曲线方程，得到的标准曲线方程为y＝0.16492x+0.11758。
(3)按照式3计算光甘草定通过Caco-2细胞单层膜的表观渗透系数(Papp)：
dQ为光甘草定的累积跨膜转运量(μg)；dQ/dt为单位时间透过量(μg/s)；A为细胞单层的表面积(1.12cm2)；C0为光甘草定的初始浓度(μg/mL)。
光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物对Caco-2细胞的细胞毒性实验结果如图14所示。结果表明，向Caco-2细胞中加入不同浓度的样品测试液培养6h后，当样品测试液的浓度为10～50μmol/L时，光甘草定、光甘草定包合物和光甘草定复合物处理的细胞的存活率均在90％以上。因此，可以采用浓度为50μmol/L的样品测试液进行后期Caco-2细胞单层膜转运的吸收实验。
光甘草定、实施例22中制备的光甘草定包合物和实施例22制备的光甘草定复合物通过Caco-2细胞单层膜转运的实验结果如表2所示。其中，累积跨膜转运率的计算方法为：累积跨膜转运率(％)＝(A×1.5+B)/C×100，其中，A为某一时间点检测到的光甘草定浓度，单位为ng/mL；1.5为Transwell培养板BL侧液体体积，单位为mL；B为之前所有时间点取出的光甘草定质量，单位为ng；C为Transwell培养板AP侧加入的光甘草定总质量。
表2培养时间为6h时不同样品通过Caco-2细胞单层膜的累积跨膜转运率和Papp值
结果表明，测试样品为光甘草定时，样品在6h时透过Caco-2细胞单层膜的累积跨膜转运率为18.95％，表观渗透系数为3.92×10-6cm/s。测试样品为实施例22中制备的光甘草定包合物时，样品在6h时透过Caco-2细胞单层膜的累积跨膜转运率为30.01％，表观渗透系数为6.41×10-6cm/s，显著高于光甘草定的累积渗透率和表观渗透系数。测试样品为实施例22制备的光甘草定复合物时，样品在6h时透过Caco-2细胞单层膜的累积渗透率为43.88％，是光甘草定的2.32倍、为光甘草定包合物的1.46倍，表观渗透系数为9.07×10- 6cm/s。因此，光甘草定复合物的累积渗透率和表观渗透系数显著高于光甘草定和光甘草定包合物；说明实施例22制备的光甘草定复合物可以显著提高光甘草定透过肠上皮细胞的能力，从而显著提高小肠对光甘草定的吸收，且效果优于光甘草定包合物。
综上，实施例22制备的光甘草定复合物极大程度地提高了光甘草定透过肠上皮表面黏液层的能力，并显著提高光甘草定通过小肠上皮细胞的跨膜转运能力。以上实验结果表明：实施例22制备的光甘草定复合物能提高光甘草定的吸收，从而提高其口服生物利用度。

Claims (5)

1.一种光甘草定复合物，其特征在于，包括光甘草定包合物和壳聚糖；所述光甘草定包合物由磺丁基-β-环糊精包合光甘草定而成，壳聚糖通过静电作用与磺丁基-β-环糊精结合；所述光甘草定包合物中的磺丁基-β-环糊精和光甘草定的摩尔比为1:1，所述壳聚糖的粘均分子量为5万~31万Da，所述磺丁基-β-环糊精为2-磺丁基-β-环糊精，所述光甘草定包合物和壳聚糖的质量比为(1~2):(1~2)。
2.一种如权利要求1所述的光甘草定复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液混合使光甘草定包合物和壳聚糖进行复合，得到含有固体颗粒的分散液，然后将分散液进行干燥，得到光甘草定复合物；所述固体颗粒的平均粒径为350~800nm；所述光甘草定包合物溶液的pH为3~5.5；所述壳聚糖溶液的pH为3~5.5；所述光甘草定包合物溶液的质量体积浓度为2.5~10g/L；所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为1.7~10g/L。
3.如权利要求2所述的光甘草定复合物的制备方法，其特征在于，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的pH值相等，所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的体积比为1:1；
所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:1；
或者所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:2，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为6.6g/L，所述壳聚糖溶液的pH为4.5~5.5；
或者所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为1:2，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为10g/L，所述壳聚糖溶液的pH为5.5；
或者所述光甘草定包合物溶液和壳聚糖溶液的质量体积浓度之比为2:1，所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为1.7g/L，所述壳聚糖溶液的pH为3~4。
4.如权利要求2或3所述的光甘草定复合物的制备方法，其特征在于，所述光甘草定包合物溶液由光甘草定包合物溶于水后再用pH调节剂调节pH得到；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶于由水和醋酸组成的混合溶剂中后再用pH调节剂调节pH得到，所述混合溶剂中水和醋酸的质量比为(99~99.5):(0.5~1)。
5.一种如权利要求1所述的光甘草定复合物或如权利要求2-4中任一项所述的光甘草定复合物的制备方法制备的光甘草定复合物在制备药物中的应用。
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