CN115028665A - 一种以手性甲硫氨酸和5-氯-8-羟基喹啉为配体的亚硝酰钌配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属配合物合成及应用技术领域，提供一种以手性甲硫氨酸和5‑氯‑8‑羟基喹啉为配体的亚硝酰钌配合物及其制备方法和应用，亚硝酰钌配合物化学式为[RuCl(Met)(5cqn)(NO)]，Met为L型甲硫氨酸，5cqn为5‑氯‑8‑羟基喹啉；通过合成反应分离制备得到相同分子量但构型不同的三种配合物。明显抑制人宫颈癌细胞生长的活性。配合物1、2、3的IC50依次为0.14µM、0.88µM、4.60µM。可在筛选和制备抗肿瘤先导化合物药物中应用。通过光激发可以定量地调控配合物一氧化氮的释放，且不同构型的配合物释放一氧化氮的速率表现一定差异，可在制备光调控的溶液体系和细胞体系中的一氧化氮供体中应用。
Description
技术领域
本发明属于配合物的合成及应用技术领域，具体涉及一种以手性甲硫氨酸和5-氯-8-羟基喹啉为配体的亚硝酰钌配合物及其制备方法和应用，所制备的亚硝酰钌配合物具有不同的构型，更进一步的，涉及一种以手性甲硫氨酸（L-Met）和5-氯-8-羟基喹啉（5cqn）为配体混合配位的不同构型亚硝酰钌配合物及其制备方法，以及该类亚硝酰钌配合物在筛选和制备抗肿瘤先导化合物的药物中的应用，在溶液和细胞体系中制备作为一氧化氮供体的化合物制剂中的应用。
背景技术
亚硝酰钌{Ru-NO}配合物分子具有特殊的基态和激发态的化学和光物理性质，并且具有明显的细胞活性，在生物医学领域具有重要的应用价值[1-5]。通过选择和改变配体，可以调节配合物的反应性和生物活性，从而为发现新的生理调节制剂和抗肿瘤药物提供依据[6-7]。
研究表明8-羟基喹啉及其衍生物是一种良好的金属螯合剂，在各种分析检测中常作为离子的萃取螯合剂或荧光检测试剂。同时它也是多种药物合成的中间体，具有较好的药理活性，如在抗癌、抗艾滋病、抗真菌、抗氧化以及神经保护活性等方面发挥着积极的作用[8-10]。甲硫氨酸是一种生物体内常见的重要氨基酸。氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，是细胞内的重要组成部分，由于其特有的氨基和羧基，通常易与钌配位形成N,O-配位模式的螯合物[11-12]。此外，甲硫氨酸的侧链含有硫原子，同样具有配位能力还可与钌配位形成S,N,O-配位模式的配合物。氨基酸为配体合成的亚硝酰钌配合物可作为NO的供体化合物，并提高了配合物在体内的选择性和生物利用度，具有重要的应用价值。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的在于提供一种以手性甲硫氨酸和5-氯-8-羟基喹啉为配体的亚硝酰钌配合物及其制备方法和应用，该类亚硝酰钌配合物是以甲硫氨酸（L-Met）和5-氯-8-羟基喹啉（5cqn）为配体的混合配位的配合物，其形成六配位八面体的结构，具有多种构型。通过合成反应和精细分离，制备得到了具有相同分子量，但是构型不同的三种亚硝酰钌配合物。
本发明提供了该类亚硝酰钌配合物在筛选和制备抗肿瘤先导化合物的药物中的应用。
本发明还提供了该亚硝酰钌配合物在溶液体系和细胞体系中制备作为一氧化氮供体的化合物制剂中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物，所述亚硝酰钌配合物的化学式为[RuCl(Met)(5cqn)(NO)]，其中Met为L型甲硫氨酸，5cqn为5-氯-8-羟基喹啉；所述亚硝酰钌配合物不同构型的立体结构如下：
。
制备所述的以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物的方法，以L型甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体，通过合成反应和精细分离，制备得到具有相同分子量、六配位八面体结构，但构型不同的三种混合配体配位的配合物。
具体步骤如下：
（1）合成[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物：2 mmol RuCl3NO(H2O)2反应物和等摩尔的5-氯-8-羟基喹啉配体分别溶于15 mL乙醇溶剂中，将两者混合80℃加热回流3 h，反应结束后加入5 mL、RuCl3NO(H2O)2的摩尔数4倍的四甲基氯化铵乙醇溶液，在4℃冰箱中静置24小时后，将产生的沉淀抽滤，真空干燥得到红褐色固体产物，即为[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物；
（2）合成混合配体配位的亚硝酰钌配合物：1 mmol[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物溶于10 mL乙醇溶剂，2 mmolL型甲硫氨酸即L-Met配体溶解于10 mL水中，两溶液混合，反应溶液避光，在搅拌作用下80 ~ 85℃加热回流5小时，反应结束后减压蒸馏，除去溶剂，真空干燥，得到混合配体配位的亚硝酰钌配合物粗产物；
（3）将步骤（2）所得混合配体配位的亚硝酰钌配合物粗产物溶解后进行硅胶柱色谱分离：利用二氯甲烷CH2Cl2和无水乙醇CH3CH2OH组成的不同极性的溶液洗脱，得到三种不同构型的配合物；其中：构型1由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为40:1的溶液洗脱得到；构型2由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为20:1的溶液洗脱得到；构型3由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为4:1的溶液洗脱得到。
所制备的得到三种不同构型的配合物晶体结晶化的方法具体为：在溶剂体积比1:1 ~ 3:1的乙醇和二氯甲烷溶液中，调节溶剂挥发速度，控制溶剂缓慢蒸发得到形状规则的红棕色晶体，进一步的，所述无水乙醇和二氯甲烷的体积比为2:1。优化所得结晶为单晶，可用于不同构型化合物的纯化和晶体衍射分子结构的解析。
本发明还提供了所述的以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在筛选和制备抗肿瘤先导化合物的药物中的应用。
另外本发明还提供了所述的以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在制备光调控的一氧化氮释放剂中的应用。
进一步的，所述以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在制备一氧化氮供体化合物中的应用。
所述以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在溶液体系中制备作为一氧化氮供体的生理调节化合物制剂中的应用。
所述以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在细胞体系中制备作为一氧化氮供体的化合物制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明合成了一类三种不同构型的具有光敏活性的亚硝酰钌配合物，测试了其在溶液和细胞体系中光调控的一氧化氮释放的效果，本发明的配合物结构在国内外尚未见报道。三种新配合物具有明显地抑制人宫颈癌细胞HeLa细胞生长的活性，可在筛选和制备抗肿瘤药物先导化合物中应用。由一定功率和波长的光照射配合物的时间分辨的红外光谱图和电子自旋共振检测结果可以得出，随着光照时间的增加配合物中一氧化氮的振动峰明显降低，并且可以捕捉到溶液中产生的NO自由基信号，证实制得的亚硝酰钌配合物在光照射条件下能够有效地释放一氧化氮。并且不同构型的配合物释放一氧化氮的速率表现一定差异，改变光照的时间可以调控一氧化氮的释放量，可以用作光调控的一氧化氮释放剂。该类配合物可用做在溶液和细胞体系中的一氧化氮的供体，也可以作为制备一氧化氮的供体的催化和生理调节化合物制剂中应用。
附图说明
图1为本发明不同构型的三种亚硝酰钌配合物晶体结构图；图中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)；
图2为本发明不同构型的三种亚硝酰钌配合物对人宫颈癌细胞HeLa细胞生长的抑制活性；图中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]在0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 µM浓度范围内未光照和光照条件下对HeLa细胞生长影响的细胞活性图；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]在0、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 µM浓度范围内未光照和光照条件下对HeLa细胞生长影响的细胞活性图；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)]在0、2.0、5.0、10.0、13.0、15.0 µM浓度范围内未光照和光照条件下对HeLa细胞生长影响的细胞活性图；
图3为在无光照条件下，随浓度增加配合物构型1、2、3对人正常肝细胞HL7702细胞生长影响的抑制率图；图中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)；
图4为本发明不同构型的三种亚硝酰钌配合物在一定功率和波长（420 nm）照射条件下的时间分辨红外光谱图；图中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)；
图5为为本发明不同构型的三种亚硝酰钌配合物的电子自旋共振（EPR）谱图；图中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)；
图6为本发明不同构型的三种亚硝酰钌配合物在光照射条件下的NO实时荧光成像图；图中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)。对照组（control）为细胞培养液中只加入5 µM的NO探针。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：一种以手性甲硫氨酸和5-氯-8-羟基喹啉为配体的不同构型亚硝酰钌配合物，所述亚硝酰钌配合物的化学式为：[[RuCl(Met)(5cqn)(NO)]，其中Met为L型甲硫氨酸，5cqn为5-氯-8-羟基喹啉。
具体制备方法如下：
（1）[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体配合物的制备：按照文献（L.L. Xie,et.al. Bioinorg. Chem. Appl., 2018, 2018, 7029376）所述方法制备：称量2 mmolRuCl3NO(H2O)2反应物和等摩尔的5-氯-8-羟基喹啉配体分别溶于15 mL乙醇溶剂，将两者混合80℃加热回流3 h，反应结束后加入5 mL、摩尔数为RuCl3NO(H2O)2摩尔数4倍的四甲基氯化铵乙醇溶液，在4℃冰箱中静置24小时后抽滤，真空干燥得到红褐色固体产物。
（2）合成双配体的亚硝酰钌配合物：1 mmol[(CH3)4N][RuCl3(Qn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物溶于10 mL乙醇溶剂，2 mmol D-Pro配体溶解于10 mL水中，两溶液混合，反应溶液避光，在搅拌作用下80℃加热回流6小时，反应结束后减压蒸馏，除去溶剂。将溶剂蒸干后真空干燥，得到混合配体配位的亚硝酰钌配合物粗产物。
（3）三种不同构型的配合物的分离和纯化：通过硅胶柱层析法纯化分离，所用展开剂为二氯甲烷：无水乙醇（40：1 ~ 4：1），分别得到三种不同构型的配合物。构型1由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为40:1的溶液洗脱得到；构型2由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为20:1的溶液洗脱得到；构型3由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为4:1的溶液洗脱得到。分离纯化所得配合物分别利用核磁共振谱等结构表征方法进行结构的分析和鉴定。
配合物1：核磁共振NMR谱600M (d 6-DMSO): δ 9.14 (1H, d, J = 7.2 Hz, H2)，δ8.83 (1H, d, J = 8.4 Hz, H4)，δ 7.99 (1H, dd, J = 4.8 Hz, H3)，δ 7.72 (1H, d, J=8.4 Hz, H6)，δ 7.08 (1H, d, J = 8.4 Hz, H7)，δ 3.86 (1H, dd, J = 6.6 Hz, αH)，δ2.71 (2H, m, J = 4.8 Hz, βH)，δ 2.08 (2H, dd, J = 2.4Hz, γH)，δ 2.00 (3H, dd,J = 6.0 Hz, γH)。红外IR光谱: v NO : 1853.87 (cm-1); v CO : 1659.33 (cm-1)。
配合物2：核磁共振NMR谱600M (d 6-DMSO):δ 9.05 (1H, d, J = 7.2 Hz, H2)，δ8.72 (1H, d, J = 8.4 Hz, H4)，δ 7.91 (1H, dd, J = 4.8 Hz, H3)，δ 7.74 (1H, d, J=8.4 Hz, H6)，δ 6.99 (1H, d, J = 8.4 Hz, H7)，δ 3.69 (1H, dd, J = 4.2 Hz, αH)，δ2.72 (2H, m, J = 8.4 Hz, βH)，δ 2.10 (3H, dd, J = 1.8 Hz, γH)，δ 1.97 (3H, dd,J = 6.0 Hz, γH)。红外IR光谱: v NO : 1852.40 (cm-1); v CO : 1635.64 (cm-1)。
配合物3：核磁共振NMR谱600M (d 6-DMSO):δ 9.15 (1H, d, J = 7.2 Hz, H2)，δ8.89 (1H, d, J = 8.4 Hz, H4)，δ 8.06 (1H, dd, J = 4.8 Hz, H3)，δ 7.77 (1H, d, J=8.4 Hz, H6)，δ 7.15 (1H, d, J = 8.4 Hz, H7)，δ 4.05 (1H, d, J = 3.6 Hz, αH)，δ2.69 (2H, m, J = 6.6 Hz, βH)，δ 2.08 (3H, dd, J = 4.8 Hz, γH)，δ 1.99 (3H, dd,J = 7.8 Hz, γH)。红外IR光谱: v NO : 1884.95 (cm-1); v CO : 1673.25 (cm-1)。
实施例2：三种不同构型的亚硝酰钌配合物的单晶制备。在1:1 ~ 3:1比例的乙醇和二氯甲烷溶液中，调节溶剂挥发的速度，通过缓慢蒸发法制备得到适合X射线结晶学测定的晶体，结晶化条件优选溶剂体积比2:1。利用X射线单晶衍射仪分别测定其原子分辨率的结构，获得其准确的空间构型。
在室温298 K，使用Bruker D8 Venture衍射仪进行数据的收集，其辐射光源为石墨单色器单色化的Mo-Kα射线，波长0.71073 Å。通过运行SMART软件SAINT程序分别进行晶胞参数的测定以及数据的还原；结构解析通过SHELXTL-97程序包完成。配合物晶体结构如附图1所示，三种亚硝酰钌配合物不同构型的立体结构如下：
。
其中：（a）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）为[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）为[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)。在（a）和（c）中，L-Met配位结合在NO的对位；在（b）中，Qn配位结合在NO的对位；在（a）和（b）中Cl原子与中心Ru原子配位结合。但是在（c）中Met中的第三个配位原子S原子取代了Cl原子与中心Ru原子配位结合。它们的配位方式和构型均不相同。
优化所得结晶为单晶，晶体结构证实了三种亚硝酰钌配合物空间构型不同。如图1所示，在（a）和（c）中，L-Met的羧基氧原子配位结合在NO的对位，并且（c）中Met中的第三个配位原子S原子取代了Cl原子与中心Ru原子配位结合；在（b）中，Qn的羟基氧原子配位结合在NO的对位；它们的配位方式和构型均不相同。
实施例3：在避光无光照和光照条件下，三种不同构型配合物对HeLa肿瘤细胞生长的抑制活性。用DMSO溶解配合物样品作为母液，稀释两份各5个相同浓度梯度的样品孵育人宫颈癌HeLa细胞，每个浓度设4个复孔，最终200 µL培养基中控制DMSO浓度为1%，空白组和对照组操作相同。取两块细胞培养板分别加入（a）0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 µM的[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）0、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 µM 的[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）0、2.0、5.0、10.0、13.0、15.0 µM的[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)；将细胞培养板放于37℃，5 %CO2细胞培养箱中孵育2 h后，取出一块细胞板作为光照组，置于420 nm 96孔LED专用光源，电压为21.7 V光照20 min，然后重新放回细胞培养箱孵育24 h；孵育时间结束后取出培养板，每孔加20 µL的CCK-8溶剂，再孵育3 h后取出，通过酶标仪测450 nm处吸光度，分别计算抑制率后统计作图，结果如图2所示。
由图2通过SPSS软件程序计算，得知配合物1的IC50值为0.14 µM，配合物2的IC50值为0.88 µM，配合物3的IC50值为4.60 µM。构型1的细胞毒性大于构型2，构型2的细胞毒性大于构型3。光照条件下，配合物1的IC50值为0.12 µM，配合物2的IC50值为0.76 µM，配合物3的IC50值为3.44 µM。光照可以提高对肿瘤细胞生长的抑制作用，配合物表现一定的光动力学活性。
实施例4：三种不同构型配合物对人正常肝细胞HL7702细胞生长的影响。用DMSO溶解配合物样品作为母液，分别稀释5个浓度梯度的样品孵育HL7702细胞，每个浓度设4个复孔，最终200 µL培养基中控制DMSO浓度为1 %，空白组和对照组操作相同。细胞培养板分别加入（a）0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 µM浓度的[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]；（b）0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 µM浓度的[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]；（c）0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0µM的[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)；将细胞培养板放于37℃，5% CO2细胞培养箱中孵育24 h；孵育时间结束后取出培养板，每孔加20 µL的CCK-8溶剂，再孵育3 h后取出，通过酶标仪测450nm处吸光度，分别计算抑制率后统计作图，结果如图3所示。
由图3可知，配合物1、2、3表现对HL7702细胞的生长抑制作用。通过SPSS软件计算得知，配合物1抑制HL7702细胞生长的IC50值为0.91µM；配合物2抑制HL7702细胞生长的IC50值为2.32µM；配合物3抑制HL7702细胞生长的IC50值为44.07µM。数据表明配合物1、2、3对HL7702细胞株均表现一定的细胞毒性。但相比HeLa细胞株，选择指数SI值分别约为6.5、2.6、9.6 （SI定义为正常细胞（HL7702细胞)与肿瘤细胞（HeLa细胞）IC50的比值，当SI≧2时，被认为化合物对肿瘤细胞具有一定选择性）。说明配合物1、2、3在同浓度抑制HeLa细胞株生长的同时，对正常细胞HL7702的细胞毒性相对较小，特别是配合物1和3，对肿瘤细胞产生毒性的同时，对正常细胞表现相对低的毒性，对肿瘤细胞表现较好的选择性。
实施例5：使用Nicolet iS50R FT-IR傅里叶红外光谱仪测定三种异构体（配合物1, 2和3）的红外光谱。将配合物分别溶于DMSO中，配制为5×10-3 M母液。用移液枪分别移取60 µL DMSO和待测样品溶液缓慢装入由两个直径为25 mm、厚度为2 mm的氟化钙窗片和厚度为100µm的“O”形聚四氟乙烯垫片组成的红外样品池中，再通过红外样品架固定，保证中间无气泡时依次进行背景和样品数据的收集；后者主要观察样品在420 nm光光照30 min时间内NO的释放情况。测量前先测定DMSO溶液图谱扣除背景，设定扫描次数为64次，在2000-1800 cm-1的波数范围内进行扫描。在1850 cm-1附近强的红外振动峰为配合物中NO基团的伸缩振动峰。结果如图4所示，由图4可见，随着光照时间的增加，NO的振动峰显著降低，表明了配合物的解离和一氧化氮的释放。配合物构型1的NO释放速率大于构型2，构型2的NO释放速率大于构型3。配合物中NO的释放速率与其构型有关，改变构型可以调控NO释放的速率。随着光照时间的增加，配合物中NO的振动峰逐渐减弱，表明配合物的解离和NO的释放。
实施例6：使用Bruker E300电子顺磁共振波谱仪，利用NO自由基捕捉技术检测光照和无光照条件下溶液体系中配合物一氧化氮的释放。分别用DMSO和水（1：1）的溶液溶解配合物样品至5×10-3 M；分别用DMSO配制1×10-2 M的FeSO4•7H2O和MGD，按1：1混合得到5×10-3 M的Fe(MGD)2 NO捕捉剂；取等量待测样品溶液和Fe(MGD)2溶液混合，毛细管吸取一定量混合液（30µL），置于电子顺磁共振波谱仪的谐振腔进行数据收集。波谱宽度为3400~3500G，谱图扫描时间为30 s。避光收集完无光照时的EPR谱图后，打开光源，采集光照条件下一定间隔时间的EPR谱图，自下而上四条曲线的光照时间间隔分别为120 s，150 s和240 s。光源为100 W汞灯。结果如图5所示。
结果显示，在避光和未光照的条件下，（a）、（b）和（c）图中1号EPR谱图几乎为水平直线，说明无NO自由基的信号产生。光照后，溶液立刻产生NO自由基EPR谱三重峰的特征信号（g = 2.039），并且随着光照时间的增长，信号强度不断增强，然后趋于稳定。表明光照可以诱导NO自由基的产生，调节光照时间可以控制其释放量。同时，配合物构型1的NO释放速率明显大于构型2，构型2的NO释放速率大于构型3。这与时间分辨红外光谱的数据是一致的。
实施例7：使用ZEISS LSM-880细胞激光共聚焦显微镜，利用选择性NO荧光探针DAX-J2 Red，实时检测照光照和无光照条件下细胞体系中配合物一氧化氮的释放。取10 mM的NO探针DAX-J2 Red加入装有PBS缓冲溶液的EP管稀释为5 µM。取1 mL加至培养有HeLa细胞的共聚焦皿中孵育20 min。取提前配好的2 mM配合物样品10 µL加至共聚焦皿中继续孵育20 min，最后加PBS吹洗3次，加1 mL的PBS缓冲液置于共聚焦显微镜观察；之后用420 nm的LED单色光源分别光照0、5、10、15、20min，观察光照后NO在HeLa细胞内的成像情况。对照组（control）为细胞培养液中只加入5 µM的NO探针DAX-J2 Red；在样品组，分别加入DAX-J2Red和20 µM的配合物[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L1)]（a）；[RuCl(Met-L2)(5cqn)(NO)]（b）；[RuCl(NO)(5cqn)(Met-L3)（c）。三种不同构型的亚硝酰钌配合物在不同光照时间的NO实时荧光成像结果如图6所示。
DAX-J2 Red是特异性NO荧光探针，当它与NO反应时发出红色荧光，可选择性鉴别NO的产生。图6（a）、（b）和（c）中，分别为加入5 µM DAX-J2 Red和20 µM的配合物构型1，2和3。用420 nm光源，分别照射HeLa细胞0、5、10、15、20 min，用激光共聚焦成像分析仪实时测量HeLa细胞内的NO产生的情况。由图可知，在对照组中无配合物加入，观察不到或者仅有很弱的NO荧光。但当培养液中有亚硝酰钌配合物存在时，能观察到明显NO荧光，平且随着光照时间的增加，产生的NO荧光逐渐增强。证实了光诱导配合物在细胞体系中NO的释放。
综上实验显示，三种新配合物具有明显地抑制人宫颈癌细胞HeLa细胞生长的活性。配合物1的IC50值为0.14 µM，配合物2的IC50值为0.88 µM，配合物3的IC50值为4.60 µM。可在筛选和制备抗肿瘤先导化合物药物中应用。通过光激发可以定量地调控配合物一氧化氮的释放，并且不同构型的配合物释放一氧化氮的速率表现一定差异，可在制备光调控的溶液体系和细胞体系中的一氧化氮供体中应用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物，其特征在于：所述亚硝酰钌配合物的化学式为[RuCl(Met)(5cqn)(NO)]，其中Met为L型甲硫氨酸，5cqn为5-氯-8-羟基喹啉；所述亚硝酰钌配合物的不同构型立体结构如下：
。
2.制备权利要求1所述的以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物的方法，其特征在于：以L型甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体，通过合成反应和精细分离，制备得到具有相同分子量、六配位八面体结构，但构型不同的三种混合配体配位的配合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）合成[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物：2 mmol RuCl3NO(H2O)2反应物和等摩尔的5-氯-8-羟基喹啉配体分别溶于15mL乙醇溶剂中，将两者混合80℃加热回流3 h，反应结束后加入5 mL、RuCl3NO(H2O)2的摩尔数4倍的四甲基氯化铵乙醇溶液，在4℃冰箱静置24小时后，将产生的沉淀抽滤，真空干燥得到红褐色固体产物，即为[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物；
（2）合成混合配体配位的亚硝酰钌配合物：1 mmol[(CH3)4N][RuCl3(5cqn)(NO)]前体亚硝酰钌配合物溶于10 mL乙醇溶剂，2 mmol的L型甲硫氨酸即L-Met配体溶解于10 mL水中，两溶液混合，避光搅拌在85℃加热回流5小时，反应结束后减压蒸馏，除去溶剂后真空干燥，得到混合配体配位的亚硝酰钌配合物粗产物；
（3）将步骤（2）所得混合配体配位的亚硝酰钌配合物粗产物溶解后进行硅胶柱色谱分离：利用二氯甲烷CH2Cl2和无水乙醇CH3CH2OH组成的不同极性的溶液洗脱，得到三种不同构型的配合物；其中：构型1由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为40:1的溶液洗脱得到；构型2由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为20:1的溶液洗脱得到；构型3由CH2Cl2和CH3CH2OH的体积比为4:1的溶液洗脱得到。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所制备的得到三种不同构型的配合物晶体结晶化的方法具体为：在溶剂体积比1:1 ~ 3:1的乙醇和二氯甲烷溶液中，控制溶剂缓慢蒸发得到形状规则的红棕色晶体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述无水乙醇和二氯甲烷的体积比为2:1；所得结晶为单晶。
6.权利要求1所述的以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在筛选和制备抗肿瘤先导化合物的药物中的应用。
7.权利要求1所述的以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在制备光调控的一氧化氮释放剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在制备一氧化氮供体化合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在溶液体系中制备作为一氧化氮供体的生理调节化合物制剂中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述以手性甲硫氨酸Met和5-氯-8-羟基喹啉5cqn为配体的亚硝酰钌配合物在细胞体系中制备作为一氧化氮供体的化合物制剂中的应用。
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