CN115025081A - 漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用 - Google Patents

漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用，涉及药物新用途技术领域。本发明提供漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用，漆黄素是一种黄酮类化合物，来源广泛，成本低，安全性高，本发明首次公开了漆黄素的抗铁死亡功能。本发明公开的漆黄素这一新功能，不仅为制备治疗铁死亡的医疗产品提供了一种新来源，同时发掘出了漆黄素新的医药价值。

Description

漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及药物新用途技术领域，具体涉及漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用。
背景技术
铁死亡是一种铁依赖性的、多不饱和脂肪酸过度氧化介导的调节性坏死，其在形态学、生物化学和遗传水平方面区别于细胞凋亡、坏死和自噬等细胞死亡形式。铁死亡与许多生物过程密切相关，包括氨基酸、铁和多不饱和脂肪酸代谢，以及谷胱甘肽、磷脂、NADPH和CoQ10。近年来的大量研究结果证实了铁死亡在包括神经系统疾病，肿瘤，急性脑、肺、肾损伤及铁代谢疾病等进程中的病理生理学作用。因此，对细胞铁死亡机制及其调控药物进行研究是十分迫切和必要的。目前常用的铁死亡抑制剂为Liproxstatin-1、Ferrostatin-1和DFO。但是，仍存在临床中上缺乏可行的药物输送方法、药物副作用大、价格昂贵等问题，使得此类铁死亡抑制剂尚未转化为临床应用。因此，寻找更加安全有效的铁死亡抑制剂是成为研究领域内的热点和难点。
漆黄素(Fisetin)是一种天然的黄酮类化合物，存在于多种水果、蔬菜和坚果中。漆黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒等作用，在治疗神经系统疾病、皮肤病、心脏病等模型和预防癌症等方面展现出明确的效果。目前未见其作为铁死亡抑制剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用。本申请发明人基于漆黄素已知的药理学效用和前期研究，提出漆黄素可以作为铁死亡抑制并应用于科学研究和临床治疗。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用。
漆黄素是黄酮类黄色针状结晶化合物，从漆树科植物木腊树中提取而来，广布在蔬菜和水果中。因其B环上具有邻二酚羟基的特殊结构使漆黄素具有较强的药理作用，如抗病毒、治疗黄疽型病毒肝炎、抑制细胞凋亡、人黑色素瘤、抗血管增生、神经保护、抗癌等药理活性，但目前未见其具有抑制铁死亡的报道。本申请发明人经大量实验发现漆黄素能抑制铁死亡诱导剂Erastin诱导的细胞铁死亡，能够减少细胞由于铁死亡出现的线粒体体积减小、脊数目减少，膜密度增加的现象。因此，漆黄素可用于开发一种新型有效的铁死亡抑制剂。
本发明还提供漆黄素在制备活性氧抑制剂中的应用。研究表明，诱导铁死亡发生均会导致细胞内脂质ROS升高，从而引起细胞死亡。线粒体作为含铁丰富(铁是线粒体氧化呼吸链必需离子)、产生ROS为主的细胞器，被认为是铁死亡发生的重要场所。它既是细胞内产生ROS的重要场所，其脂肪酸代谢又为细胞铁死亡提供特定的脂质前体。本申请发明人经过大量实验发现，漆黄素能够抑制由铁死亡诱导剂诱导的细胞内活性氧含量升高，减少活性氧对细胞的伤害。
本发明还提供漆黄素在制备提高超氧化物歧化酶活性中的应用。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员，广泛分布在微生物、植物和动物体内，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分。研究发现，细胞铁死亡会细胞超氧化物歧化酶含量下降。本申请发明人经过大量实验发现，漆黄素能够减少由于铁死亡诱导剂诱导的细胞内SOD值下降。
本发明还提供漆黄素在制备铁死亡相关蛋白表达促进剂中的应用。
作为本发明所述漆黄素在制备铁死亡相关蛋白表达促进剂中的应用的优选实施方式，所述铁死亡相关蛋白为GPX4，FTH1或SLC7A11中的一种。研究表明，GPX4是谷胱甘肽过氧化物酶，是一种膜脂修复酶。SLC7A11是发挥功能的主要亚基，可将胱氨酸转运入胞，用于合成GSH。抑制GPX4，FTH1或SLC7A11的表达会诱导细胞铁死亡。本申请发明人经过大量实验发现，漆黄素能够促进GPX4，FTH1或SLC7A11蛋白的表达，阻止脂质过氧化诱导的细胞死亡。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述漆黄素的浓度为1.25～10μM。本申请发明人经过大量的实验发现，当漆黄素的浓度为1.25～10μM，能够有效的抑制细胞铁死亡，抑制细胞活性氧的增加，提高超氧化物歧化酶活性和促进铁死亡相关蛋白的表达。
本发明还提供一种铁死亡抑制剂，所述铁死亡抑制剂中含有漆黄素。
本发明还提供漆黄素在制备用于治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。
作为本发明所述漆黄素在制备用于治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用的优选实施方式，所述铁死亡相关疾病包括由铁死亡引起的神经系统、肿瘤、心血管疾病。
本发明的有益效果：本发明提供漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用，漆黄素是一种黄酮类化合物，来源广泛，成本低，安全性高，本发明首次公开了漆黄素的抗铁死亡功能。本发明公开的漆黄素这一新功能，不仅为制备治疗铁死亡的医疗产品提供了一种新来源，同时发掘出了漆黄素新的医药价值。
附图说明
图1为不同浓度的漆黄素对铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞的细胞存活率的影响图。
图2为不同浓度的漆黄素对铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞的SOD值的影响图。
图3为不同浓度的漆黄素处理铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞后的流式BL-1通道图。
图4为不同浓度的漆黄素对铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞的ROS含量的影响图。
图5为不同浓度的漆黄素对铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞内铁死亡相关蛋白GPX4表达的影响图。
图6为不同浓度的漆黄素对铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞内铁死亡相关蛋白FTH1表达的影响图。
图7为不同浓度的漆黄素对铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞内铁死亡相关蛋白SLC7A11表达的影响图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
本实施例采用漆黄素培养铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞，探究漆黄素对铁死亡的抑制作用。具体实验方法如下：
1、漆黄素储存液的配制：根据分子量，用DMSO溶解并配制成190mM的储存母液，放置在-20℃冰箱保存备用。所用的漆黄素CAS号为528-48-3，分子式为C15H10O6，分子量为286.24。
2、细胞处理和检测：
(1)细胞培养：使用10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养HT22细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中常规培养。
(2)MTT法测定细胞存活率：取对数生长期的HT22细胞，按照每孔0.5万的细胞密度接种于96孔板，每组设置6个副孔。贴壁24小时后，弃去培养基，加入以完全培养基配制成的0.1μM的铁死亡诱导剂Erastin诱导HT22细胞建立细胞铁死亡模型。分别以浓度为0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的漆黄素处理细胞。培养24小时后，弃去培养基，每孔加入以纯DMEM配制而成的MTT溶液100μL，继续培养4小时，吸去上清，每孔加入100μL的DMSO，充分溶解后在490nm波长处测定吸光度值，以计算细胞存活率。实验结果如图1所示，由图1可知，漆黄素呈浓度依赖性地提高铁死亡细胞存活率。
实施例2
本实施例采用漆黄素培养铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞，探究漆黄素对细胞形态的影响。具体实验方法如下：
(1)细胞培养：使用10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养HT22细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中常规培养。
(2)电子显微镜观察细胞形态：取对数生长期的HT22细胞，按照每孔10万的细胞密度接种于6孔板。贴壁24小时后，弃去培养基，加入以完全培养基配制成的0.1μM的铁死亡诱导剂Erastin诱导HT22细胞建立细胞铁死亡模型，以浓度为5μM的漆黄素处理细胞，培养24小时后，弃去培养基，加入2.5％的常温戊二醛固定液处理，脱水包埋后，样品用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色后用透射电镜观察。结果显示，在Erastin诱导后，细胞出现线粒体体积减小、脊数目减少，膜密度增加的现象，漆黄素处理组可减少Erastin诱导的上述形态学改变。
实施例3
本实施例采用漆黄素培养铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞，探究漆黄素对细胞SOD值的影响。具体实验方法如下：
(1)细胞培养：使用10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养HT22细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中常规培养。
(2)细胞SOD值测定：取对数生长期的HT22细胞，按照每皿4万的细胞密度接种于100mm的大皿。贴壁24小时后，加入以完全培养基配制成的0.1μM的铁死亡诱导剂Erastin诱导HT22细胞建立细胞铁死亡模型，分别以浓度为2.5μM、5μM的漆黄素处理细胞。培养24小时后，用细胞刮棒刮取收集细胞，按照总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)试剂盒检测细胞SOD值。实验结果如图2所示。由图2可知，在Erastin诱导后，细胞SOD值下降，漆黄素处理组可减少Erastin诱导的细胞SOD值下降。
实施例4
本实施例采用漆黄素培养铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞，探究漆黄素对细胞ROS值的影响。具体实验方法如下：
(1)细胞培养：使用10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养HT22细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中常规培养。
(2)细胞ROS值测定：取对数生长期的HT22细胞，按照每孔10万的细胞密度接种于6孔板。贴壁24小时后，用铁死亡诱导剂Erastin诱导HT22细胞建立细胞铁死亡模型，分别以浓度为2.5μM、5μM的漆黄素处理细胞。培养24小时后，弃去培养基，用DCFH-DA的无血清培养基孵育20分钟，消化后使用流式细胞仪BL-1通道进行分析。实验结果如图3和图4所示。由图3和图4可知，在Erastin诱导后，细胞内ROS含量升高，漆黄素处理组可减少Erastin诱导的细胞内ROS含量上升。
实施例5
本实施例采用漆黄素培养铁死亡诱导剂Erastin诱导的HT22细胞，探究漆黄素对细胞铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1、SLC7A11表达的影响。具体实验方法如下：
(1)细胞培养：使用10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养HT22细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中常规培养。
(2)铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1、SLC7A11表达情况测定：取对数生长期的HT22细胞，按照每皿40万的细胞密度接种于100mm的大皿。贴壁24小时后，加入以完全培养基配制成的0.1μM的铁死亡诱导剂Erastin诱导HT22细胞建立细胞铁死亡模型，分别以浓度为2.5μM、5μM、10μM的漆黄素处理细胞，同时设置Ferrostatin-1阳性对照组。培养24小时后，弃去培养基，用预冷PBS轻洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液100μL，冰上裂解20min，用预冷的细胞刮棒将细胞收集到1.5mL EP管中，在4℃，14000rpm的条件下离心10min，收集上清。根据试剂盒说明书，BCA法测定细胞含量，并加入Loading Buffer 95℃变性。以20μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE分离后，湿转至PVDF膜进行电转，用5％脱脂牛奶室温封闭1.5h，Tublin、GPX4、FTH1、SLC7A11一抗4℃摇床封闭过夜，TBST洗涤5min×3次，二抗室温封闭1h，TBST洗涤5min×3次，按试剂盒说明书1：1混合发光液A和B，并避光保存，将配置好的发光液均匀滴于PVDF膜上曝光显影条带。实验结果如图5、图6和图7所示。由图5、图6和图7结果显示，Erastin可减少铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1、SLC7A11的表达，而使用漆黄素处理后，可增加上述蛋白的表达，阻止脂质过氧化诱导的细胞死亡。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.漆黄素在制备铁死亡抑制剂中的应用。
2.漆黄素在制备活性氧抑制剂中的应用。
3.漆黄素在制备提高超氧化物歧化酶活性中的应用。
4.漆黄素在制备铁死亡相关蛋白表达促进剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述铁死亡相关蛋白为GPX4，FTH1或SLC7A11中的一种。
6.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述漆黄素的浓度为1.25～10μM。
7.一种铁死亡抑制剂，其特征在于，所述铁死亡抑制剂中含有漆黄素。
8.漆黄素在制备用于治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述铁死亡相关疾病包括由铁死亡引起的神经系统、肿瘤、心血管疾病。
10.一种用于治疗铁死亡相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有漆黄素和药学上可接受的辅料。
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