CN115024173B - 5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合在提高重金属镉胁迫下丹参有效成分中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了5‑氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合在提高重金属镉胁迫下丹参有效成分中的应用,并提供了重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,该方法包括:在丹参幼苗移栽培养14~16天后,向栽种有丹参幼苗的重金属镉污染土壤中施加九水偏硅酸钠;7~8天后,再向丹参叶片上喷施5‑氨基乙酰丙酸水溶液;继续对丹参进行栽培管理,直至收获。本发明将生长调节剂5‑氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠Na2SiO3·9H2O联合使用,不仅能够提高丹参的抗逆性,缓解丹参在重金属镉环境下的生长,并能减少丹参植株中的镉含量,减少药用植物丹参从受污染土壤中吸收重金属的含量;还能够有效提高丹参内有效成分的含量,提高丹参药物利用率。

Description

5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合在提高重金属镉胁迫 下丹参有效成分中的应用
技术领域
本发明涉及药用植物栽培技术领域,尤其涉及5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合在提高重金属镉胁迫下丹参有效成分中的应用。
背景技术
丹参是一种重要的药用植物,在镉(Cd)污染的土壤上种植时,会经历显著的生长和生物量损失。植物组织中的高Cd积累也会增加金属进入食物链的风险。寻找改良剂减少丹参中的镉积累,备受人们关注。
研究表明,镉胁迫严重影响了丹参的生长(Dobrikova,A.G.,Apostolova,E.L.,Han,A.,et al.Cadmium toxicity in Salvia sclarea L.:An integrative response ofelement uptake,oxidative stress markers,leaf structure and photosynthesis[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2021,209(41):111851)。张鑫等(张鑫,李昆伟,陈康健,梁健,崔浪军.镉胁迫对丹参生长及有效成分积累的影响研究[J].植物科学学报,2013,31(06):583-589.)研究表明镉胁迫下丹参酮Ⅰ和隐丹参酮含量均显著降低,而丹参酮ⅡA含量变化不显著。王博等(王博,杜仲燕,王林燕,程桂林.外源添加物对丹参中Cd积累量的影响[J].耕作与栽培,2017(03):1-3+7+15.DOI:10.13605/j.cnki.52-1065/s.2017.03.001.)研究表明水杨酸和低浓度脱落酸不影响丹参根部Cd含量,高浓度脱落酸增加了丹参根部的Cd含量,锌降低了丹参根部的Cd含量。
然而,目前还没有5-氨基乙酰丙酸(ALA)与九水偏硅酸钠(Na2SiO3·9H2O)混合处理减少丹参对重金属镉吸收,及影响镉胁迫下丹参成分的报道。
发明内容
本发明提供了5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合在提高重金属镉胁迫下丹参有效成分中的应用,并提供了具体的重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,该方法不仅能够提高丹参的抗逆性,缓解丹参在重金属镉环境下的生长,并能减少丹参植株中的镉含量,减少药用植物丹参从受污染土壤中吸收重金属的含量;还能够有效提高丹参中有效成分的含量,提高丹参药物利用率。
具体技术方案如下:
本发明提供了5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合在提高重金属镉胁迫下丹参有效成分中的应用。
进一步地,所述丹参的有效成分为隐丹参酮和丹参酮I。
进一步地,所述5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠的组合方式为:将九水偏硅酸钠施加在栽种有丹参幼苗的重金属镉污染土壤中,5-氨基乙酰丙酸喷施在丹参叶片上;所述九水偏硅酸钠的施加量为540~560kg·hm-2,5-氨基乙酰丙酸的喷施浓度为9~11mg·L-1
一种重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,包括:
(1)在丹参幼苗移栽培养14~16天后,向栽种有丹参幼苗的重金属镉污染土壤中施加九水偏硅酸钠;7~8天后,再向丹参叶片上喷施5-氨基乙酰丙酸水溶液;
(2)继续对丹参进行栽培管理,直至收获。
本发明采用30mg·kg-1 CdCl2来模拟重金属镉污染的土壤,通过添加Na2SiO3·9H2O以及喷施ALA,测定生理生化指标,研究ALA与Si单独和联合处理对Cd胁迫的影响,可以发现ALA和Si都可以降低丹参中的镉含量,其中联合处理效果更明显,而且能够有效提高丹参中各种有效成分的含量,为研究如何降低药用植物丹参的重金属含量及提高丹参有效成分提供了理论依据。
进一步地,步骤(1)之前,先将丹参种子浸泡在蒸馏水中浸种10~14h,再将丹参种子进行播种育苗,育苗60~65天后,获得丹参幼苗。
进一步地,所述育苗的温度为28℃。
进一步地,所述重金属镉污染土壤中镉离子浓度为25~35mg·kg-1
进一步地,移栽后的培养条件为:活性光子通量密度为200μmol m-2s-1,昼/夜温度为24/20℃,相对湿度为60-70%,光照/黑暗时间为14/10h。
进一步地,步骤(2)中,所述九水偏硅酸钠的添加量为550kg·hm-2;5-氨基乙酰丙酸的施用浓度为10mg·L-1
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明将生长调节剂5-氨基乙酰丙酸和九水偏硅酸钠Na2SiO3·9H2O联合使用,不仅能够提高丹参的抗逆性,缓解丹参在重金属镉环境下的生长,并能减少丹参植株中的镉含量,减少药用植物丹参从受污染土壤中吸收重金属的含量;还能够有效提高丹参有效成分的含量,提高丹参药物利用率。
附图说明
图1为不同处理对丹参根和叶中镉积累量的影响;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值。通过Duncan’s测验,不同的小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
图2为不同处理对丹参植株活性氧和MDA含量的影响;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值。通过Duncan’s测验,不同的小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
图3为不同处理对丹参植株抗氧化酶活性的影响;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值。通过Duncan’s测验,不同的小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
图4为不同处理下丹参根和叶抗性基因表达图谱;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值,对照组的表达水平被标准化为“1”,利用log10处理的表达式数据绘制热图。
图5为不同处理对镉胁迫下丹参根部抗逆性相关基因表达水平的影响;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值。通过Duncan’s测验,不同的小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
图6为不同处理对镉胁迫下丹参叶片抗逆性相关基因表达水平的影响;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值。通过Duncan’s测验,不同的小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
图7为不同处理对对镉胁迫下丹参根和叶成分的影响;
其中;CK:对照;Cd;30mg·kg-1 Cd处理;Cd+Si:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O;Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd胁迫下添加10mg·L-1 ALA;-ALA,不喷施ALA;+ALA,叶面喷施ALA;数据是三次重复(平均值±SE)的平均值。通过Duncan’s测验,不同的小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异。
图8为扫描电子显微镜下Na2SiO3·9H2O样品的表面结构图;
其中,A为200μm下的Na2SiO3·9H2O图像,B为10μm下的Na2SiO3·9H2O图像,C为2μm下的Na2SiO3·9H2O图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述,以下列举的仅是本发明的具体实施例,但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
1、试验材料和试剂
丹参种子由陕西商洛提供,使用进口泥炭土(Hawita Gruppe Gmbh)培育植株。
无水氯化镉,邻苯二甲醛(OPA,索莱宝),trichloroacetic acid(TCA),乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液(EDDS,Sigma),磷酸二氢钠(NaH2PO4),磷酸氢二钾(K2HPO4),聚乙二醇PEG6000,碘化钾(麦克林),还原辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH),氯化硝基四氮唑蓝(NBT),L-氧化型谷胱甘肽(源叶),谷胱甘肽还原酶(GR,来源于酿酒酵母,索莱宝),还原型谷胱甘肽(GSH,索莱宝),抗坏血酸(AsA)。
2、试验方法
将准备好的种子浸泡在蒸馏水中12h,然后将种子放入育苗盘中,在28℃下生长7天,在育苗过程中不断补充水分。将所有植物移植到长花盆中,并放于200μmolm-2s-1活性光子通量密度,24/20℃(昼/夜温度),60-70%相对湿度和14/10h(光/夜)光周期下生长。经过两个月的生长后,将幼苗移植到含有蛭石和珍珠岩(4:2:1,v:v)作为基质的盆(180厘米)中。
将丹参幼苗移植到混合养分土壤中2周后,使用30mg·kg-1 CdCl2、550kg·hm- 2Na2SiO3·9H2O进行处理,一周后在叶片上喷洒10mg·L-1的ALA。其中,CdCl2、Na2SiO3·9H2O和ALA的浓度是根据初步实验确定的,ALA易分解,应该在遮光条件下喷施。
各处理如下所示:
CK:CdCl2胁迫处理(Cd浓度为0g·kg-1),不做其他处理;
Cd:CdCl2胁迫处理(Cd浓度为30mg·kg-1),不做其他处理;
Si:550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O处理,不做其他处理;
ALA:向植株的叶面喷施10mg·L-1 5-氨基乙酰丙酸(ALA),不做其他处理;
Cd+Si:30mg·kg-1 Cd和550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O共同处理植株;
Cd+ALA:30mg·kg-1 Cd处理一周后,向叶片喷施10mg·L-1ALA;
Cd+Si+ALA:30mg·kg-1 Cd和550kg·hm-2 Na2SiO3·9H2O共同处理植株一周后,向叶片喷施10mg·L-1ALA;
收获植物,测定丹参根、叶中的镉含量以及进行生物量测定和生化分析。
(1)不同处理对丹参根和叶中镉积累量的影响
取不同处理下的0.05g干燥的丹参根和叶样品,及10mL硝酸加入聚四氟乙烯容器中,并放于微波消化装置消解。按程序1在微波消解仪消解后,将消化的样品倒入特氟龙烧杯中,加热至接近1mL,并在离心管中用超纯水将体积调节至50mL。用iCAPTM RQ ICP-MS(美国赛默飞世尔)测定丹参根和叶中的Cd含量。计算各组织中Cd含量与各组织的干重的乘积,即Cd积累量(BCQ)。
表1 微波消解工作程序
阶段 罐数(个) 爬坡时间(min) 压力(PSI) 温度(℃) 保温(min)
1 10 6 400 120 2
2 10 4 400 160 5
3 10 4 400 200 15
结果如图1所示,在ALA和Si的施用下,与单独使用Cd胁迫相比,Cd+ALA,Cd+Si都降低了Cd在丹参根部中的镉的总积累量,相反,Cd+Si+ALA增加了丹参根和叶片中镉的总积累量。在Cd暴露植物的根和叶中,ALA和Si单独或共同处理都显着降低了Cd含量,ALA和Si联合处理对降低了根和叶片中的Cd含量有更好的效果。说明ALA与Si复配明显减少了丹参在镉污染土壤中的镉吸收量。
(2)不同处理对丹参植株生长的影响
如表1所示,Cd处理显著降低了丹参的生长和生物量产量,单独的ALA处理显著促进了植物在Cd和非胁迫环境下的生长,增加了植株的干、鲜重。与对照相比,镉胁迫植株的根叶干重分别降低了36%和42%,Si处理植物的生物量减少了22%和40%,而ALA处理植物的根叶生物量分别增加了82%和56%。然而,添加ALA,Si单独或共同处理都显着降低了Cd对植物生长的抑制作用并改变了这些生长参数。与单独镉处理相比,ALA使Cd胁迫植物的根和叶干重分别增加了36%和39%,Si使根和叶的干重分别增加了45%和72%,添加ALA和Si都增加了根和叶片的干重,且ALA和Si的联合处理下对Cd污染植株的生长改善效果最好。
表1 不同处理对丹参植株根、叶鲜重和干重(g)的影响
(3)不同处理对丹参植株叶绿素含量的影响
如表2所示,与对照相比,用Cd处理的植物减少了近一半的叶绿素a,b和类胡萝卜素含量,而单独ALA处理对叶片中的叶绿素含量影响不大。与单独Cd处理相比,添加ALA和Si后植物的叶绿素含量显著增加,在它们的处理下,叶绿素总含量分别增加29%、26%,类胡萝卜素含量分别增加3%、24%。然而,与单独使用Cd+Si胁迫相比,Cd+Si+ALA处理显著提高了总叶绿素含量42%。因此,在Cd+Si中喷洒ALA更好的促进了植物的光合作用,提高了植株的叶绿素水平。
表2 不同处理对丹参植株叶绿素和类胡萝卜素含量(mg·g-1FW)的影响
(4)不同处理对丹参植株活性氧和MDA含量的影响
与对照相比,Cd处理显著提高了对照组的根系和叶片中的ROS和MDA水平,但ALA和Si的使用降低了这些值,减少了脂质过氧化和活性氧水平(图2)。本研究通过联合应用ALA和Si,实现了ROS积累的最大减少。例如,与对照相比,单独Cd处理使根系中的H2O2含量降低了2%,使叶片中H2O2的含量增加了51%。与Cd处理相比,ALA和Si共同使用明显降低了受到Cd污染的丹参根和叶的H2O2和O2 -。同样地,ALA和Si处理降低了根系和叶片中的-OH含量,镉胁迫根的OH含量对合并处理比单独处理改善效果更显著。ALA和Si对Cd胁迫根部MDA含量下调效果不明显,但对叶片有明显的改善效果。
(5)不同处理对丹参根和叶抗氧化酶活性的影响
Cd胁迫后,植物对Cd胁迫作出反应,丹参根和叶的SOD,POD,CAT,APX和GR等抗氧化酶活性显著降低(图3)。然而,ALA与Si的外源施用显着提高了抗氧化酶在根和叶片中的活性水平,特别是在ALA和Si联合处理时。Cd+Si+ALA处理植物叶片SOD活性最高,比Cd处理植物高32%。与镉处理相比,ALA和Si处理下POD活性也显著增加,其中Cd+Si+ALA处理在根系中的活性增加最大,为159%。当ALA与Cd和Cd+Si一起处理植物时,发现CAT活性也逐渐增加。在根和叶片中,APX在Cd+Si+ALA处理下表现出最高的活性。在用ALA处理的植物中,GR的活性显着增加。根据上述数据,在Cd胁迫下,用ALA和Si处理植物的抗氧化酶活性明显高于ALA-和Si-处理植物的抗氧化酶活性,ALA和Si单独或联合处理都有效提高了抗氧化防御水平。
(6)不同处理对丹参根和叶基因表达水平的影响
研究了9个不同类型基因的表达水平(图4),包括Cd转运相关基因(HMA3,NRAMP1),Mn转运相关基因(CAX2,ECA1,ECA3,PML3,MTP8,MTP11),ROS清除基因(APX1,FSD2,MSD1,MSD2,PPT),生长素相关基因(IAA4,AXR3,AMI1,PIN3),ABA信号通路基因(LEW3,CDPK2,PYL4,RWA2),乙烯相关基因(COI1,XCT,ETR1,ERF73),钙离子通道基因(CPK4,CPK6,ACA2),MAPK级联反应基因(MPK2,MPK17,MPK18,MMK2,PTPA)和丹参成分相关基因(PAL,C4H,DXS2,DXR,HMGR3)。
实验结果表明,几种胁迫条件影响了丹参根和叶抗逆性相关基因的相对表达水平(图5,图6)。在Cd暴露植物的叶片中,施用ALA、Si、Si+ALA分别显著提高了HMA3的转录水平203%、279%、403%。在Cd处理植物的根系中,应用ALA,Si显着降低了HMA3的转录水平,而Si+ALA协同处理提高了HMA3的转录水平。然而,根部多种处理下NRAMP1的转录水平都低于镉处理,仅Cd+Si+ALA处理的叶片转录水平高于镉处理。此外,ALA降低了Cd处理植物中与丹参成分相关基因(即DXS2和C4H)的相对表达,而Si+ALA处理下,相对表达水平提高了。ALA、Si、Si+ALA的加入均显著提高了Cd处理植物中PAL和DXR的相对表达。
(7)不同处理对丹参根和叶成分的影响
与对照相比,Cd胁迫使隐丹参酮,丹参酮I,丹参酮IIA的含量分别降低了8%,22%和1%,而丹酚酸B的含量增加了0.7%(图7)。与Cd处理相比,在Cd污染植株的叶片上喷洒ALA降低了这些含量,而施用Si增加了丹参酮I和丹酚酸B的含量,降低了隐丹参酮和丹参酮IIA的含量。Si和ALA的联合处理使隐丹参酮,丹参酮I和丹酚酸B的含量分别增加了33%,13%和19%,丹参酮IIA的含量降低了8%。根据上述数据,Cd胁迫减少了丹参有效成分的含量,而Si和ALA的联合处理有效提高了其有效成分的含量。
(8)扫描电子显微镜下Na2SiO3·9H2O样品的表面结构分析
图8显示了Na2SiO3·9H2O样品的扫描电镜照片。Na2SiO3·9H2O颗粒的直径相对较小,在200μm处可以观察到完整的Na2SiO3·9H2O颗粒,其表面照片是在3kV的电压和8.1mm的工作距离下拍摄的。从图中可以看出,Na2SiO3·9H2O具有较高的粒径和表面积,这可能使重金属更容易固定在受污染的土壤中,并且还可以提高土壤的pH值,从而降低金属的溶解度,减少重金属镉在土壤中的积累。

Claims (6)

1.一种重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,其特征在于,包括:
(1)在丹参幼苗移栽培养14~16天后,向栽种有丹参幼苗的重金属镉污染土壤中施加九水偏硅酸钠;7~8天后,再向丹参叶片上喷施5-氨基乙酰丙酸水溶液;
所述丹参的有效成分为隐丹参酮和丹参酮I;所述九水偏硅酸钠的施加量为540~560kg·hm-2,5-氨基乙酰丙酸的喷施浓度为9~11 mg·L-1
(2)继续对丹参进行栽培管理,直至收获。
2.如权利要求1所述的重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,其特征在于,步骤(1)之前,先将丹参种子浸泡在蒸馏水中浸种10~14 h,再将丹参种子进行播种育苗,育苗60~65天后,获得丹参幼苗。
3.如权利要求2所述的重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,其特征在于,所述育苗的温度为28℃。
4.如权利要求1所述的重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,其特征在于,所述重金属镉污染土壤中镉离子浓度为25~35 mg·kg-1
5.如权利要求1所述的重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,其特征在于,移栽后的培养条件为:活性光子通量密度为200 μmol m-2 s−1,昼/夜温度为24/20 °C,相对湿度为60-70%,光照/黑暗时间为14/10 h。
6.如权利要求1所述的重金属镉胁迫下的丹参的栽培方法,其特征在于,所述九水偏硅酸钠的施加量为550 kg·hm-2,5-氨基乙酰丙酸的喷施浓度为10 mg·L-1
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