CN112453050A - 一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，该方法包括：向日葵种子播种后，幼苗栽至重金属镉污染的土壤上；在向日葵幼苗移栽3～4周后，向重金属镉污染土壤中施加螯合剂，并对向日葵幼苗的叶片喷施5‑氨基乙酰丙酸试剂；所述螯合剂为乙二胺‑NN’‑二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸；对向日葵进行栽培管理，直至向日葵成熟，收获。本发明方法将生长调节剂5‑氨基乙酰丙酸和重金属螯合剂乙二胺‑NN’‑二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸进行联用，能够在确保向日葵植株正常生长的情况下，更进一步地促进向日葵对污染土壤中重金属镉的吸收，提高向日葵对重金属镉污染土壤的修复效果。
Description
技术领域
本发明涉及植物修复技术领域，尤其涉及一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法。
背景技术
近年来，镉(Cd)污染问题倍受人们关注。植物修复技术以环保、低廉、高效等特点，具有广泛应用前景。
向日葵生育周期短、生物量大、富集重金属能力较强，被广泛应用于镉污染土壤修复中。研究表明，添加丛枝菌根可以提高向日葵对重金属的累积(Andrade S,Silvei ra,A,Jorge R,Abreu M.Cadmium accumulation in sunflower plants influenced byArbuscular Mycorrhiza.International Journal of Phytoremediation,2008,(10):1-14.Awotoye O,Adewole M,Salami A,Ohiembor M.Arbuscular mycorrhiza contributionto the growth performance and hea vy metal uptake of Helianthus annuus Linnin pot culture.2009,3(7):157-163.Ker K,Charest C.Nickel remediation by AM-colonized sunflower.Mycorrhiza,2010,20(6):399-406.)；Moradk hani等(Moradkhani,S.,Nejad,R.A.K.,Dilmaghani,K.,Chaparzadeh,N.,2013.Salicylic acid decreases Cdtoxicity in sunflower plants.Annals of Biological Research,4(1):135-141.)研究表明水杨酸可以降低Cd对向日葵的毒害；
等(
E,Evangelou M W H,Robinsonb B H,et al.Effects of indole-3-acetic acid(IAA)on sunflower growth andheavy metal u ptake in combination with ethylene diamine disuccinic acid(EDDS).Chemosphere,2010,901-907)研究表明3-吲哚乙酸(IAA)可以缓解向日葵对Pb和Zn的毒害，且螯合剂EDDS与IAA复配显著提高植物吸收Cd的能力。陈立等(陈立,王丹,龙婵,等.3种螯合剂对向日葵修复镉污染土壤的影响.环境科学与技术,2017,40(11):22-29.)研究了CA、草酸和E DDS三种螯合剂的添加有效提高向日葵对Cd的吸收、转运能力。
然而，目前还没有5-氨基乙酰丙酸(ALA)与螯合剂复配提高向日葵修复土壤Cd污染的报道。
发明内容
本发明提供了一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，该方法可以在确保向日葵植株正常生长的情况下，更进一步地促进向日葵对污染土壤中重金属镉的吸收，提高向日葵对重金属镉污染土壤的修复效果。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，包括：
(1)向日葵种子播种后，幼苗栽至重金属镉污染的土壤上；
(2)在向日葵幼苗移栽3～4周后，向重金属镉污染土壤中施加螯合剂，并对向日葵幼苗的叶片喷施5-氨基乙酰丙酸试剂；
所述螯合剂为乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸；
(3)对向日葵进行栽培管理，直至向日葵成熟，收获。
本发明采用0.3g·kg-1高浓度Cd处理模拟重度镉污染土壤，并通过添加螯合剂CA或EDDS以及喷施ALA，来研究生长调节剂ALA与螯合剂CA或EDDS之间的相互作用，发现生长调节剂ALA与螯合剂CA或EDDS的联合应用提高了向日葵对土壤中Cd的吸收，为植物修复Cd污染土壤技术提供理论依据。
进一步地，所述重金属镉污染土壤中镉离子浓度为0.15g·kg-1～0.30g·kg-1。
进一步地，所述乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液的添加量为4～6mmol·kg-1。
进一步地，所述柠檬酸的添加量为9～11mmol·kg-1。
进一步地，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为9～11mg·L-1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法将生长调节剂5-氨基乙酰丙酸和重金属螯合剂乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸进行联用，能够在确保向日葵植株正常生长的情况下，更进一步地促进向日葵对污染土壤中重金属镉的吸收，提高向日葵对重金属镉污染土壤的修复效果。
附图说明
图1为不同处理对向日葵植株抗氧化酶活性的影响；
其中；CK：对照；Cd2；0.3g·kg-1Cd处理；Cd2+CA：0.3g·kg-1Cd胁迫下添加CA；Cd2+EDDS：0.3g·kg-1Cd胁迫下添加EDDS；-ALA,不喷施ALA；+ALA，叶面喷施ALA；根据Duncan’s测验，图中不同字母表示在P≤0.05水平上差异显著。
图2为不同处理对向日葵植株非蛋白巯基含量的影响；
其中；CK：对照；Cd2；0.3g·kg-1Cd处理；Cd2+CA：0.3g·kg-1Cd胁迫下添加CA；Cd2+EDDS：0.3g·kg-1Cd胁迫下添加EDDS；-ALA,不喷施ALA；+ALA，叶面喷施ALA；根据Duncan’s测验，图中不同字母表示在P≤0.05水平上差异显著。
图3为不同处理对向日葵植株谷胱甘肽含量的影响；
其中；CK：对照；Cd2；0.3g·kg-1Cd处理；Cd2+CA：0.3g·kg-1Cd胁迫下添加CA；Cd2+EDDS：0.3g·kg-1Cd胁迫下添加EDDS；-ALA,不喷施ALA；+ALA，叶面喷施ALA；根据Duncan’s测验，图中不同字母表示在P≤0.05水平上差异显著。
图4为不同处理对向日葵植株根尖细胞超微结构的影响
其中，a,c,e,g分别表示CK，0.3g·kg-1Cd2，Cd2+CA和Cd2+EDDS没有ALA处理组向日葵根尖细胞超微结构；b,d,f,h分别表示ALA，Cd2+ALA,Cd2+CA+ALA和Cd2+EDDS+ALA叶面喷施ALA的处理组向日葵根尖细胞超微结构；MC－线粒体，NM－核膜，Nuc－核，Nue－细胞核，CW－细胞壁，CM－细胞膜，P－质体小球(嗜锇颗粒)，S－淀粉粒；a,c,h－(×20000),b,e,f－(×25000),d,g－(×30000)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
1、试验材料和试剂
向日葵(TK0409)的种子均由内蒙古农牧科学研究院植保所提供。以进口泥炭土营养土(Hawita Gruppe Gmbh)为供试土壤。
5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB，麦克林)、无水氯化镉、柠檬酸(CA，麦克林)，邻苯二甲醛(OPA，索莱宝)，乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液(EDDS，Sigma)均购于杭州科德诺生物技术有限公司。磷酸二氢钠(NaH2PO4)，磷酸氢二钾(K2HPO4)，聚乙二醇PEG6000、碘化钾(麦克林)，还原辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH)，L-氧化型谷胱甘肽(源叶)，谷胱甘肽还原酶(GR，来源于酿酒酵母，索莱宝)、还原型谷胱甘肽(GSH，索莱宝)，抗坏血酸(AsA)等生理试剂均购于杭州科德诺生物技术有限公司。
2、试验方法
向日葵种子用70％酒精消毒后蒸馏水冲洗三遍，黑暗发芽两天后，将根等长的种子移栽到泥炭土、蛭石和珍珠岩体积比为4：2：1的基质中。将所有植物置于昼/夜温度恒为24/20℃，光照周期14/10h，湿度60％-70％，光强为200μmol m-2s-1的温室中进行培养，以Cd含量为0g·kg-1，0.15g·kg-1和0.3g·kg-1的CdCl2胁迫处理一周，植株仍正常生长，无萎蔫现象。
具体操作如下：
待植株长到6叶期(子叶全出土后三周左右)，Cd含量为0g·kg-1，0.3g·kg-1的CdCl2以溶液的形式浇灌在向日葵幼苗周围土壤中，胁迫处理一周后，用针头注射器吸取配置好的EDDS(5mmol·kg-1)/CA(10mmol·kg-1)溶液，贴近土壤表层附近喷施，同时以10mg·L-1ALA叶面喷湿至近滴状态，因ALA见光易分解，故选择遮光喷施，一周之后取样测定各项指标。
各处理设置如下：
CK：CdCl2胁迫处理(Cd浓度为0g·kg-1)，不做其他处理；
Cd1：CdCl2胁迫处理(Cd浓度为0.15g·kg-1)，不做其他处理；
Cd2：CdCl2胁迫处理(Cd浓度为0.30g·kg-1)，不做其他处理；
CA：10mmol·kg-1CA处理，不做其他处理；
EDDS：5mmol·kg-1EDDS处理，不做其他处理；
ALA：向植株的叶面喷施10mg·L-1 5-氨基乙酰丙酸(ALA)，不做其他处理；
Cd2+ALA：Cd浓度为0.30g·kg-1的CdCl2胁迫一周后，向植株的叶面单次喷施10mg·L-1 5-氨基乙酰丙酸(ALA)；
Cd2+CA：Cd浓度为0.30g·kg-1的CdCl2胁迫处理一次，一周后用10mmol·kg-1CA处理植株一次；
Cd2+EDDS：Cd浓度为0.30g·kg-1的CdCl2胁迫处理一次，一周后用5mmol·kg-1EDDS处理植株一次；
Cd2+CA+ALA：Cd浓度为0.30g·kg-1的CdCl2胁迫处理一次，一周后用10mmol·kg- 1CA处理植株一次，同时单次向植株的叶面喷施10mg·L-1 5-氨基乙酰丙酸(ALA)；
Cd2+EDDS+ALA：Cd浓度为0.30g·kg-1的CdCl2胁迫处理一次，一周后用5mmol·kg- 1EDDS处理植株，同时单次向植株的叶面喷施10mg·L-1 5-氨基乙酰丙酸(ALA)。
测定向日葵植株根、茎和叶中的镉积累量以及生长指标和各生理生化指标以及超微结构的变化。
(1)不同处理对向日葵植株根、茎和叶中的镉积累量的影响
取不同处理下向日葵根、茎和叶粉末0.05g，放入消解罐后加浓硝酸10mL，按照表1所示的程序在微波消解仪中进行消解，消解完全后将消解液倒入聚四氟乙烯烧杯中，在通风橱内加热至尽干，用超纯水定容于50mL离心管混匀，然后倒入5mL离心管，Cd在向日葵根、茎和叶中的积累量用电感耦合等离子体质谱仪(iCAP RQ)来测定Cd含量；并按照以下计算方法计算富集系数(BCF)、转运系数(TF)、Cd积累量(BCQ)和提取效率(RE)。富集系数(Bioconcentration factor，BCF)＝植物地上部分(地下部分)Cd含量(mg·kg-1)/土壤全Cd含量(mg·kg-1)；
转运系数(Translocation factor，TF)＝植物地上部Cd含量(mg·kg-1)/植物根部Cd含量(mg·kg-1)；
Cd积累量(Bioaccumulation quantity，BCQ)＝植物各组织中Cd含量(mg·kg-1)×植物各组织干重；
Cd提取效率(Remove efficiency，RE)＝(植物Cd积累量/土壤中Cd总量)×100％。
表1微波消解工作程序
| 阶段 | 罐数(个) | 爬坡时间(min) | 压力(PSI) | 温度(℃) | 保温(min) |
| 1 | 10 | 6 | 400 | 120 | 2 |
| 2 | 10 | 4 | 400 | 160 | 5 |
| 3 | 10 | 4 | 400 | 200 | 15 |
结果如表2和表3所示，与对照Cd2(单独0.3g·kg-1Cd处理)相比，Cd2+ALA和Cd2+EDDS、Cd2+CA处理都显著增加了植株Cd的积累量，且Cd2+EDDS处理下，单株Cd的积累量明显高于Cd2+CA处理，说明螯合剂的使用可以有效提高植物对重金属Cd的吸收，尤其是EDDS(表2)；其中，Cd+EDDS+ALA处理下Cd的提取率最高(表2)。说明ALA与EDDS/CA复配可以促进向日葵对Cd的吸收。
表2不同处理对向日葵植株根、茎和叶中的镉积累量(BCQ)和提取效率的影响
注：Cd2为单独0.3g·kg-1Cd.表中数值为平均值±SE.根据LSD测验，同一列中不同小写字母表示在P≤0.05水平上差异显著.
表3不同处理对向日葵植株各组织Cd浓度、富集系数(BCF)、转运系数(TF)的影响
注：CK为单独0.3g·kg-1Cd.表中数值为平均值±SE.根据LSD测验，同一列中不同小写字母表示在P≤0.05水平上差异显著.
(2)不同处理对向日葵植株生长的影响
如表4所示，Cd胁迫下，向日葵株高、根长、干重、鲜重与对照相比均显著降低，并且随着Cd浓度的升高(Cd1到Cd2)，受影响程度越大；单独使用ALA与对照相比显著提高了向日葵的根长和植株的干、鲜重；而Cd2胁迫下添加ALA与单独Cd2胁迫相比，向日葵幼苗生物量和株高、根长均明显升高，但都显著低于对照组。
与对照相比，单独添加EDDS/CA，向日葵株高、根长和干、鲜重均显著降低。Cd2胁迫下添加EDDS/CA与单独Cd2胁迫相比，显著降低了向日葵的株高、根长和干、鲜重，对向日葵植株生长具有抑制作用，而通过叶面喷施ALA可以显著缓解这种抑制作用，与Cd+EDDS相比，外源添加ALA显著提高了向日葵株高和根长以及根、茎、叶的鲜重和干重，增加幅度分别达到了27％和25％以及103％、51％、59％和65％、67％、89％。
表4不同处理对向日葵植株根、茎、叶鲜重、干重和株高、根长的影响
注：Cd1为0.15g·kg-1Cd，Cd2为0.30g·kg-1Cd.根据Duncan’s测验，表中同一列中不同小写字母表示差异显著(P≤0.05).
(3)不同处理对向日葵植株绿素含量的影响
由表5可以看出，与对照相比，Cd2胁迫下叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量显著降低，且随着Cd浓度升高而降低，表明高浓度Cd(Cd2,0.30g·kg-1)胁迫对向日葵叶绿素的影响更大；EDDS/CA单独使用与对照相比叶绿素b和总叶绿素含量显著下降。与Cd2单独处理相比，Cd2+CA/EDDS处理使向日葵内叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降，这可能是因为CA/EDDS增加了土壤中Cd的流动性，促进了向日葵对镉的吸收，植物细胞内Cd浓度进一步增加，加剧了对细胞内叶绿体结构的影响，进而降低了植物细胞内的叶绿素含量。而叶面喷施ALA又显著提高了叶绿素和类胡萝卜素的含量，与Cd2+EDDS/CA相比，Cd2+EDDS/CA+ALA处理下叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量显著升高，且Cd2+EDDS+ALA和Cd2+CA+ALA处理分别提高了57％，43％，54％、32％和47％，76％，52％和56％，说明ALA与EDDS/CA复配可以提高Cd胁迫下向日葵幼苗叶绿素含量。
表5不同处理对向日葵植株叶绿素和类胡萝卜素含量(mg·g-1FW)的影响
注：Cd1为0.15g·kg-1Cd，Cd2为0.30g·kg-1Cd.根据Duncan’s测验，同一列中不同小写字母表示在P≤0.05水平上差异显著.
(4)不同处理对向日葵植株ROS和MDA的影响
由表6可以看出，与空白对照相比，Cd2胁迫下，向日葵植株的ROS和MDA含量都显著升高，说明Cd胁迫使植物细胞产生了明显的膜脂质过氧化反应。与单独Cd2胁迫相比，Cd+CA/EDDS共同处理下，向日葵幼苗ROS和MDA含量显著升高，其中Cd+EDDS处理与Cd2胁迫相比，根和叶中-OH分别提高了53％和30％；与单独Cd2胁迫相比，Cd+ALA处理下ROS和MDA含量在向日葵根和叶中均显著降低。
Cd+EDDS/CA+ALA复合处理与Cd+EDDS/CA处理相比，向日葵幼苗ROS和MDA含量显著降低，但都没有单独Cd+ALA处理低。说明ALA可以降低Cd与EDDS/CA不同胁迫下植株ROS水平和MDA含量。
表6不同处理对向日葵植株H2O2、O2 -、-OH及MDA含量的影响
(5)不同处理对向日葵植株抗氧化酶活性的影响
如图1所示，与对照相比，0.3g·kg-1Cd胁迫下向日葵根和叶中抗氧化酶活性显著增强。单独使用ALA与对照相比向日葵根和叶中SOD、POD、CAT和GR活性也显著升高。与单独Cd胁迫相比，Cd胁迫下喷施ALA显著提高了向日葵根和叶中SOD、POD、CAT、APX和GR活性，且向日葵叶和根中POD活性分别提高了103％和133％。与单独Cd胁迫相比较，Cd胁迫下添加EDDS/CA螯合剂，向日葵根和叶中CAT和APX活性显著升高，根中SOD和POD也显著升高，叶中升高不明显，GR在叶中显著升高，根中升高不显著；与Cd+CA/EDDS处理相比，外源施加ALA(Cd+CA/EDDS+ALA)向日葵植株SOD、POD、CAT、APX和GR均显著升高，说明ALA的添加提高了植株的抗氧化酶活性，从而清除多余的H2O2、-OH和O2 -等。
(6)不同处理对向日葵植株非蛋白巯基含量的影响
如图2所示，与空白对照相比，单独0.3g·kg-1Cd胁迫下向日葵根和叶中NPT、GSH含量和根中其他非蛋白巯基化合物含量均显著上升。与单独Cd胁迫相比，Cd胁迫下添加EDDS/CA(Cd+EDDS/CA)向日葵根和叶中NPT和GSH含量显著升高。与空白对照相比，外源喷施ALA显著提高了向日葵根和叶NPT和GSH含量，其他非蛋白巯基化合物含量在根中显著升高，叶内升高不明显；与单独Cd胁迫相比，Cd胁迫下添加ALA向日葵根和叶中NPT含量显著升高，叶中GSH含量和根中其他非蛋白巯基化合物含量也显著升高。Cd+EDDS/CA+ALA处理与Cd+EDDS/CA相比，显著提高了向日葵根和叶中NPT和GSH含量，说明外源施加ALA可以显著提高植株NPT和GSH非蛋白巯基含量。
(7)不同处理对向日葵植株谷胱甘肽含量的影响
如图3所示，与对照相比，单一Cd处理下，总谷胱甘肽含量(GSSG+GSH)和GSH/GSSG比值在向日葵根和叶中都显著升高。Cd+EDDS处理与单独Cd胁迫相比显著增加了向日葵根和叶中GSH/GSSG比值；与单独Cd胁迫相比，Cd+ALA处理后，向日葵根和叶中GSSG+GSH、GSH含量，叶中GSH/GSSG均显著增大。与Cd+CA处理相比，Cd+CA+ALA显著增加了向日葵叶中GSSG+GSH和GSSG含量及根中GSH/GSSG比值；与Cd+EDDS处理相比，Cd+EDDS+ALA处理下向日葵根和叶中GSSG+GSH含量、根中GSH/GSSG比值以及叶中GSSG含量显著升高。
(8)不同处理对向日葵植株根尖细胞超微结构的影响
如图4所示，对照组向日葵根尖细胞线粒体结构正常，细胞核完整，细胞壁清晰、光滑(图4a)。ALA单独处理组与对照无明显差异(图4b)。Cd胁迫下，向日葵根尖细胞结构遭到破坏，细胞核结构变形，核仁消失，嗜锇颗粒明显增多，液泡变大，增多(图4c)，然而外源ALA的使用明显改善这一现象，尽管染色质聚集，但核膜、核仁仍清晰可见(图4d)。Cd+CA处理下，细胞壁部分降解，核仁消失，染色质聚集成凝胶状，电子密度增加(图4e)，而Cd+CA+ALA处理下，核质分布均匀，核仁正常，核膜完整(图4f)。Cd+EDDS处理下，没有完整的细胞器，细胞壁部分降解，没有清晰的细胞膜，细胞核核仁消失，上下端核膜开始降解(图4g)，而Cd+EDDS+ALA处理下，细胞壁光滑完整，细胞核核膜完整清晰，线粒体未消失(图4h)。
Claims (5)
1.一种利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，包括：
(1)向日葵种子播种后，幼苗栽至重金属镉污染的土壤上；
(2)在向日葵幼苗移栽3～4周后，向重金属镉污染土壤中施加螯合剂，并对向日葵幼苗的叶片喷施5-氨基乙酰丙酸试剂；
所述螯合剂为乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液或柠檬酸；
(3)对向日葵进行栽培管理，直至向日葵成熟，收获。
2.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述重金属镉污染土壤中镉离子浓度为0.15g·kg-1～0.30g·kg-1。
3.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述乙二胺-NN’-二琥珀酸三钠盐溶液的添加量为4～6mmol·kg-1。
4.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述柠檬酸的添加量为9～11mmol·kg-1。
5.如权利要求1所述的利用向日葵修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为9～11mg·L-1。
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