CN115006421A - 一种酸枣仁皂苷b在制备抑制血管生成药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用。所述的血管生成包括肿瘤血管新生，还包括白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌症的血管新生。所述的酸枣仁皂苷B作为单一成分或与其它药学上可接受的成分构成组合物应用在制备抑制血管生成的药物中，所述的其他药学上可接受的成分包括与酸枣仁皂苷B没有拮抗作用的药物，或药学上允许的一种或多种辅料。与现有技术相比，本发明的酸枣仁皂苷B为天然植物提取物，能够有效抑制肿瘤血管生成从而达到抗肿瘤作用的目的，可为开发新的抗肿瘤血管生成药物提供广阔选择。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用。
背景技术
癌症作为人类死亡的主要原因，每年的死亡人数超过1000万。而在过去两年中，全球报告了超过1700万例新的癌症病例，预计到2040年这一数字将增加到2750万例，全球癌症发病率正在迅速上升。近年来，癌症已经成为中国的首要死亡原因，并造成严重的社会经济负担。目前化疗是癌症的重要治疗方法，但其通常导致严重的毒副作用，进而导致生活质量低下。近年来，靶向疗法和免疫疗法等新型疗法也在逐渐兴起，但其造成的多起不良影响事件表明此种疗法未能取得理想的治疗效果。在目前正进行的临床试验或已有治疗手段中，抗血管生成疗法是目前广受关注的抗肿瘤治疗方法之一。
自Folkman于1971年首次提出肿瘤的生长和转移依赖于病理性血管生成(angiogenesis)以来，血管生成说这一概念为今后半个多世纪以来开发抗血管治疗药物奠定了坚实的理论基础。仅靠被动扩散提供氧气和营养物质将使肿瘤大小将限制在～1-2mm3，体积超过该大小的肿瘤将通过产生促血管生成因子或抑制抗血管生成因子的表达来触发血管开关，从而引起血管生成，肿瘤中新形成的血管为肿瘤的生长、扩散和转移提供了先决条件。
正常情况下，血管生成受到严格调控，该过程由促血管生成因子和抑制因子共同协调，维持在一个稳定的状态。但在肿瘤环境中，二者平衡被打破，血管生成机制被异常激活，病理性生成的血管为肿瘤细胞带来丰富的养料和氧气，并为肿瘤的转移创造了条件。此外，异常新生的血管也与类风湿、视网膜眼底病和银屑病等疾病有关。
中国专利文献CN100577180C公开了一种藤黄酸在制备抑制血管生成中的应用。该发明提供了藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用特别是在制备抑制肿瘤、关节炎、视网膜病、血管瘤、银屑病等疾病的病变组织血管生成药物中的应用。中国专利文献CN109692182A公开了蒲公英多糖在抑制血管中的新用途，研究表明，蒲公英多糖能够通过下调肿瘤细胞VEGF、VEGFR-2表达,在体内外抑制肿瘤血管生成；具有能够有效抑制肿瘤血管生成从而达到抗肿瘤作用的优点。中国专利文献CN112402474A公开了竹节参总皂苷在制备类风湿性关节炎血管生成的药物中的应用。该发明公开了竹节参总皂苷在抑制类风湿性关节炎血管生成中的新用途。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
发明人知晓，酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子。中国多个省份均有分布，其具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津之功效。常用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等疾病。酸枣仁皂苷B作为其主要的活性物质之一，研究报道称酸枣仁皂苷B可促进白血病细胞的凋亡，抑制血小板聚集及抗肿瘤作用。但目前未有关于酸枣仁皂苷B抗肿瘤血管生成方面的研究。
另外，发明人首次发现酸枣仁中的主要活性四环三萜化合物酸枣仁皂苷B具有显著的抗血管生成作用，随后我们对其抗肿瘤血管生成作用及机制进行了探究。在查询文献基础上发现，关于酸枣仁皂苷B在抑制血管生成中的应用还未见报道。
一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用。
进一步地，所述的血管生成包括肿瘤血管新生，还包括白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌症的血管新生。
进一步地，所述的肿瘤为实体肿瘤。
进一步地，所述的实体肿瘤包括原发性或继发性实体肿瘤。
进一步地，所述的肿瘤血管新生包括肿瘤病变组织的血管新生或肿瘤导致的血管新生。
进一步地，所述的血管生成包括银屑病病变组织血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、关节炎病变组织的血管新生或新生血管性眼病的血管生成。
进一步地，所述的新生血管性眼病包括原发性或继发性新生血管性眼病。
进一步地，所述的酸枣仁皂苷B作为单一成分或与其它药学上可接受的成分构成组合物应用在制备抑制血管生成的药物中，所述的其他药学上可接受的成分包括与酸枣仁皂苷B没有拮抗作用的药物，或药学上允许的一种或多种辅料。
进一步地，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
进一步地，所述的药物的给药方式包括注射、口服、吸入式喷雾或透皮给药。
与现有技术相比，本发明提供了酸枣仁皂苷B的一种新用途；首次发现酸枣仁皂苷B抗血管生成作用，首次发现酸枣仁皂苷B可有效抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，首次发现酸枣仁皂苷B在鸡胚绒毛尿囊膜实验中可剂量性依赖性抑制血管生成，首次发现酸枣仁皂苷B可抑制小鼠体内接种基质胶中血管的生成，首次发现酸枣仁皂苷B可通过抗血管生成抑制BALB/c裸鼠皮下肿瘤的生长，并首次发现酸枣仁皂苷B可阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)介导的信号通路发挥其抗血管生成作用，以上发现可说明酸枣仁皂苷B具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂使用，能够作为血管生成抑制剂应用于血管生成药物的制备以治疗肿瘤、关节炎、银屑病、眼科疾病等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病。酸枣仁皂苷B为天然植物提取物，能够有效抑制肿瘤血管生成从而达到抗肿瘤作用的目的，可为开发新的抗肿瘤血管生成药物提供广阔选择。
附图说明
图1为酸枣仁皂苷B在不影响肿瘤细胞HCT-15结肠癌细胞活力的情况下抑制HUVECs的增殖；
图2为酸枣仁皂苷B效果照片；
图3为酸枣仁皂苷B抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成；
图4为酸枣仁皂苷B抑制小鼠体内基质胶血管形成；
图5为酸枣仁皂苷B通过抗血管生成作用抑制HCT-15荷瘤小鼠肿瘤生长；
图6为酸枣仁皂苷B抑制VEGFR2及其下游信号分子磷酸化。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施案列中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所用试剂均可以在市场上购买。
图1：酸枣仁皂苷B在不影响肿瘤细胞HCT-15结肠癌细胞活力的情况下抑制HUVECs的增殖。(A)酸枣仁皂苷B结构式。(B)相比于HCT-15结肠癌细胞，HUVEC细胞对酸枣仁皂苷B更敏感。(C、D)酸枣仁皂苷B抑制HUVEC增殖。
图2：(A)酸枣仁皂苷B抑制HUVEC Transwell小室垂直迁移的照片。(B)酸枣仁皂苷B抑制HUVEC划痕迁移照片。(C)酸枣仁皂苷B抑制HUVEC抑制小管生成的照片。
图3：酸枣仁皂苷B抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。
图4：酸枣仁皂苷B抑制小鼠体内基质胶血管形成。(A)体内培养12天后取出Martrigel栓的照片。(B)Martrigel栓CD31免疫组化荧光检测。(C)CD31免疫荧光统计图。(D)不同浓度酸枣仁皂苷B处理的Martrigel血红蛋白含量统计。
图5：酸枣仁皂苷B通过抗血管生成作用抑制HCT-15荷瘤小鼠肿瘤生长。(A)小鼠肿瘤体积监测。(B)治疗组和对照组荷瘤小鼠及肿瘤代表性照片。(C)肿瘤重量统计。(D)小鼠体重监测。(E、F)肿瘤组织免疫组化染色CD31(微血管密度)及统计。(G、H)H&E染色(肿瘤坏死)及统计。(I、J)Ki67(肿瘤细胞增殖)及统计。
图6：酸枣仁皂苷B抑制VEGFR2及其下游信号分子磷酸化。(A)酸枣仁皂苷B抑制VEGF诱导的HUVEC细胞内VEGFR-2及其下游信号分子(PLCγ1,FAK,Src和Akt)磷酸化水平。(B)酸枣仁皂苷B阻断VEGFR-2介导信号通路的模式图。
实施例1：酸枣仁皂苷B抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验
目的和原理：采用CCK-8法，Calcein-AM/PI法检测HUVEC的增殖。CCK-8试剂中含有水溶性四唑盐WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料(formazan)。甲臜染料能够溶解在组织培养基中，与活细胞数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
方法：HUVEC细胞接种于96孔板中培养。细胞过夜培育，将酸枣仁皂苷B按以下浓度1、3、10、30、100μM加入孔板中，作用48小时后加入CCK-8与培养基的混合溶液(1:9)，每孔100μL。置于的恒温培养箱中继续孵育2h，在450nm处检测96孔板中溶液的OD值，以不含细胞的孔作为空白对照。按如下公式计算细胞活力：
细胞活力(％)＝(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100％
结果与结论：请参照附图1B，如图所示酸枣仁皂苷B对HUVEC增殖有明显的抑制作用。酸枣仁皂苷B的浓度在30～100μM时对HUVEC的增殖抑制明显大于HCT-15结肠癌细胞。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例2：酸枣仁皂苷B抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖
目的和原理：Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的低毒性细胞染色试剂。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm且仅对活细胞染色。
作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488，545nm，发射：617nm)，因此PI仅对死细胞染色。所以，Calcein，AM和PI经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。通过该种方法可以评价药物对HUVEC增值的影响。
方法：HUVEC细胞接种于96孔板中培养。细胞过夜培育，将酸枣仁皂苷B按以下浓度1、3、10、30、100μM加入孔板中，48h后吸出含药培养基，并用PBS洗涤除去多余的药液，每孔加入200μL Calcein-AM(2μM)和PI(4.5μM)的染色工作液，混匀，在细胞培养箱中继续孵育15min，在荧光显微镜下观察细胞染色情况并拍照，并用Image-Pro Plus 6.0分析统计。
结果：如图1C-D所示，酸枣仁皂苷B能剂量依赖性的抑制HUVEC的增殖。
实施例3：酸枣仁皂苷B抑制HUVEC垂直迁移实验
目的和原理：Transwell实验技术，这项技术的主要材料时Transwell小室(Transwell chamber)，小室的底层有一层通透性的膜(一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane))，这层膜带有孔径大小0.1-12μm的微孔，实验中细胞置于小室上，在小室下含有的趋化因子或生长因子的作用下，细胞透过聚碳酸酯膜，从而进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
方法：下室中加入VEGF165的HUVEC培养液700μL，在上室中加入含有不同浓度酸枣仁皂苷B与细胞的培养液100μL，细胞密度为8×105/mL，同时设置不加药物的对照组。置于恒温培养箱中培养8h后，弃去孔板中旧的培养液，加入600μL 4％多聚甲醛常温固定15min。用棉签去除上室中未迁移的细胞，然后向下室中加入300μL 0.1％结晶紫溶液室温下过夜染色。用PBS浸洗下室五次，除去多余的结晶紫溶液，在正置显微镜下观察HUVEC细胞迁移情况并拍照统计。
结果与结论：迁移后的细胞经结晶紫染色后呈紫红色。由图2A显示，与对照组相比，酸枣仁皂苷B的浓度在10～100μM范围内，HUVEC的迁移能力被显著抑制。
*：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有较显著性差异(P＜0.05)。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例4：酸枣仁皂苷B抑制HUVEC水平迁移实验
目的与原理：细胞划痕实验是一种操作简易，且价格低廉的研究细胞迁移的体外实验方法，通过融合在单层细胞上人为造成一道空白区域，称为划痕。划痕边缘细胞逐渐迁移进入空白区域“愈合”该划痕。
方法：将HUVEC接种于96孔板中，生长至80％融合。用划痕器在每孔中间轻轻划一道痕。加入不同浓度的酸枣仁皂苷B的细胞培养液，置于IncuCyte培养箱中孵育48小时。观察并统计HUVEC的迁移情况。
结果与结论：如图2B所示，酸枣仁皂苷B在10～100μM范围内可显著抑制HUVEC的水平迁移。
*：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有较显著性差异(P＜0.05)。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例5：酸枣仁皂苷B抑制HUVEC小管形成实验
目的和原理：Matrigel是从是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。人脐静脉内皮细胞可以在Matrigel上黏附成管，从而可用于研究药物对内皮细胞成管作用的影响。
方法：将Matrigel溶液放置于冰上，使其融化。用预冷的枪头取Matrigel溶液加入到预冷的96孔培养板中，每孔60μL。在冰上放置5min后，待Matrigel溶液液面水平。将96孔板放置于37℃恒温培养箱中孵育30min，使Matrigel溶液固化。将HUVEC细胞用胰蛋白酶消化，并重悬于培养液中，调整细胞密度为2×105/mL。用细胞悬液稀释酸枣仁皂苷B，调整其浓度为1、3、10、30、100μM。向铺有Matrigel溶液的96孔板中加入含药的细胞悬液，每孔100μL。将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，10h后，使用光学显微镜观察血管形成情况，拍照并统计。
结果与结论：HUVEC可在Matrigel上延伸生长呈管状并相互连接，形成三维网状结构。由图2C所示，与对照组相比，酸枣仁皂苷B的浓度在30～100μM范围内，HUVEC细胞的小管形成被显著抑制。
*：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有较显著性差异(P＜0.05)。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例6：酸枣仁皂苷B抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验
目的和原理：鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)具有丰富的血管网，对于刺激或抑制血管生成的药物敏感，是较为理想的研究抗血管生成药物的体内实验模型。
方法：种蛋用温水(40-50℃)清洗两次后，于1：10000新洁儿灭液中浸泡3分钟；将种蛋孵育于普通培养箱中，温度37.8℃，培养箱中放入水盘(1000ml水杯)，以保持湿度65-70％；在孵化过程中将种蛋钝端(大头端)向上，呈45°倾斜，每天转蛋3-5次，可防止胚胎发生粘连；采用照蛋灯每日检查胚胎发育情况，识别胚胎发育的标志特征，淘汰死精弱精种蛋和死胎以及胚胎发育不良的种蛋；于第3-5天，在照蛋灯下观测，确定CAM为止，先在气室顶端1mm-2mm小孔，用眼科镊轻轻揭去凹陷处蛋皮，轻轻撕掉内壳膜，此时该处CAM下陷，形成假气室，制备假气室时切勿损伤CAM，用消毒后的封口膜封闭假气室；将随机分组好的向其中加入含有不同浓度药物的滤纸片(5mm×5mm)，用封口膜密封，继续孵育48h后观察鸡胚绒毛尿囊膜上血管形成情况体内抗血管生成活性研究。
结果与结论：由图3所示酸枣仁皂苷B的浓度在10～100μM范围内，与对照组相比能显著抑制CAM血管新生。
*：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有较显著性差异(P＜0.05)。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例7：酸枣仁皂苷B对Matrigel体内种植的抗血管生成实验
目的与原理：研究酸枣仁皂苷B对体内血管生成的抑制效果，Matrigel是一种细胞外基质的混合物，其中包含粘连蛋白和多种生长因子，与药物混合注入小鼠体内能很好研究药物对血管生成的抑制作用。
方法：将Matrigel冰浴30min后，实验组种植的Matrigel中加入肝素30U和不同浓度的酸枣仁皂苷B，对照组中Matrigel只加入肝素；将充分混匀的Matrigel以0.5mL注射于小鼠腹部正中区域皮下,待Matrigel形成单一固体胶样种植体后，拔出针头。种植12天后,颈椎脱臼处死小鼠,取出Matrigel胶栓；取出的基质胶用4％多聚甲醛固定，进行石蜡包埋与切片处理以免疫组织化学法完成血管内皮细胞CD31分子的染色，用光镜对切片进行整体扫描观察，查找高密度血管区域，并拍照记录。
结果与结论：如图4(B-C)所示，酸枣仁皂苷B在10-100μM范围内，与对照组相比能显著抑制Matrigel内血管生成的数量。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例8：酸枣仁皂苷B对Matrigel体内种植的血红蛋白检测
目的与原理：探究酸枣仁皂苷B对Matrigel内血红蛋白含量的影响，血红蛋白含量代表血管形成的数量。
方法：将生理盐水中的Matrigel胶分装在2ml的组织研磨管中，在每只研磨管汇中加入3-4粒直径为1mm的研磨磁珠，置于Precellys研磨器内震荡研磨(5400g×20s×3×10s)。得到的研磨液加入15mL离心管中进行离心：3000g离心10min，取上清。随后将血红蛋白(Hb)ELISA检测试剂盒中的孔板取出，样本孔中加入待测上清10μL，再加样本稀释液40μL，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗涤5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min，加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
结果与结论：用血红蛋白定量胶塞中的微血管发现，血管抑制效果呈剂量依赖性(图4A、D)。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例9：酸枣仁皂苷B抗血管生成抑制荷HCT-15人结直肠癌小鼠肿瘤生长实验分析(CD31：微血管密度；H&E染色：肿瘤坏死面积；Ki67：肿瘤细胞增殖)，考察药物对于荷瘤小鼠的抗血管生成抑制肿瘤生长的疗效。
方法：将5周龄裸鼠分为对照组(生理盐水)和给药组(酸枣仁皂苷B)，每组各6只，逐一麻醉后，将HCT-15细胞于右腹部皮下注射100ul(3×106/只)，用马克笔标记并编号；每日观察肿瘤生长的状态，待HCT-15结肠癌肿瘤体积达到80mm3时，并开始给药处理，按照隔日剂量20mg/kg进行腹腔注射，连续给药15天。对照组(Control)用生理盐水做相同处理。从第一次给药开始，每次给药时随即对荷瘤裸鼠称重，游标卡尺测量肿瘤的长和宽并记录。同时观察肿瘤的生长状况及裸鼠的健康状况。处死所有荷瘤裸鼠，剥离出肿瘤，称重并记录。得到的肿瘤组织，经石蜡包埋、切片后进行CD31、H&E及Ki67染色以考察酸枣仁皂苷B的抗肿瘤作用。
结果与结论:如图5A-C所示，酸枣仁皂苷B能有效抑制肿瘤生长，治疗组平均肿瘤体积为339.8mm3，瘤重约为0.38g，免疫组化分析表明，酸枣仁皂苷B能显著抑制肿瘤微血管密度(图5E-F)，从而增加肿瘤坏死面积(图5G-H)，降低肿瘤阳性细胞比例(图5I-J)，表明酸枣仁皂苷B能通过抗血管生成发挥抗肿瘤活性。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例10：酸枣仁皂苷B抑制HUVEC内VEGF刺激的VEGFR-2及其下游分子激活实验
目的和原理：在肿瘤血管新生过程中，VEGF通过与细胞表面受体VEGFR结合，在内皮细胞的增殖，迁移和小管形成中发挥重要作用。新生血管形成VEGF通路主要是由VEGFR-2介导。本研究采用免疫印迹实验(Western Blot)方法考察酸枣仁皂苷B对于VEGF刺激引起的HUVEC内VEGFR-2及其下游通路的影响。
方法：当HUVEC细胞直至长满整个六孔板，吸去旧培养基，PBS冲洗两次，用无刺激因子培养基饥饿细胞6h；
加入不同浓度的酸枣仁皂苷B溶液2ml处理0.5h，PBS冲洗两次后，用含100ng/mlVEGF培养基刺激4min；将6孔板培养板置于冰上。用PBS浸洗两次，向6孔板中加入细胞裂解液(RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂)，每孔50μL，反复研磨。将细胞碎片及裂解液置于1.5mL离心管中，涡旋30s。离心后，弃去沉淀，将上清液转移至新的1.5mL离心管中；样品BCA蛋白定量后，100℃水浴加热5min后，保存至-20℃冰箱。按照计算的量，每孔上样量约为30μg；在60V的条件下，电泳1h使溴酚蓝进入到分离胶中；随后将电压调至90V，电泳1h。接着将电压调至120V，继续电泳直至溴酚蓝到达凝胶底部。然后将PVDF裁剪成合适的大小，甲醇浸润PVDF膜2min，将样品胶与PVDF膜装入转膜夹中，在220V条件下转膜2h。随后把PVDF膜转移至含5％milk-TBST的封闭液中，室温条件下，封闭1h左右；封闭结束后，在脱色摇床上使用足量的TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次5min；使用一抗稀释液按相应的比例稀释待测分子的一抗。将PVDF膜与稀释后的一抗置于孵育盒中，在4℃条件下过夜孵育，采用羊抗兔的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h。将超显试剂盒中A液和B液按1:1的比例混匀稀释至20％-50％，滴加到PVDF膜蛋白面，置于双色成像系统进行显色。
结果与结论：如图6A所示，酸枣仁皂苷B能剂量依赖性的抑制VEGF诱导的HUVEC内的VEGFR-2及其下游信号分子PLCγ1，FAK,Src和Akt的磷酸化水平。图6B表示酸枣仁皂苷B特异性阻断VEGFR-2介导信号通路的模式图。
*：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有较显著性差异(P＜0.05)。
**：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有显著性差异(P＜0.01)。
***：与对照组(酸枣仁皂苷B的浓度为0μM)比具有极显著性差异(P＜0.001)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的血管生成包括肿瘤血管新生，还包括白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌症的血管新生。
3.根据权利要求2所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为实体肿瘤。
4.根据权利要求3所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的实体肿瘤包括原发性或继发性实体肿瘤。
5.根据权利要求2所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤血管新生包括肿瘤病变组织的血管新生或肿瘤导致的血管新生。
6.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的血管生成包括银屑病病变组织血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、关节炎病变组织的血管新生或新生血管性眼病的血管生成。
7.根据权利要求6所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的新生血管性眼病包括原发性或继发性新生血管性眼病。
8.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的酸枣仁皂苷B作为单一成分或与其它药学上可接受的成分构成组合物应用在制备抑制血管生成的药物中，所述的其他药学上可接受的成分包括与酸枣仁皂苷B没有拮抗作用的药物，或药学上允许的一种或多种辅料。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种酸枣仁皂苷B在制备抑制血管生成药物中的应用，其特征在于，所述的药物的给药方式包括注射、口服、吸入式喷雾或透皮给药。
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