CN115005333A - 一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂及应用。一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂由益生菌和乳膏基质混合制成；所述乳膏基质按重量百分比计包括：羧甲基纤维素钠1％‑2％、淀粉1％‑2％、三聚甘油酯5％‑10％、大豆卵磷脂1％‑5％，余量为水。本发明的乳膏制剂粘稠、坚硬，且防止营养物质的破坏和损失，同时还具有预防幼龄反刍动物腹泻、调节肠道菌群、提高免疫力等功能。
Description
技术领域
本发明涉及畜用益生菌制剂技术领域，具体涉及一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂及应用。
背景技术
为了提高养殖业经济利益，人们在饲料中添加各种添加剂，包括化学制剂、微生态制剂，抗生素、中草药等，以提高机体抗病力、增强免疫力、降低料重比、增加产仔率等。微生态制剂是指能够使动物机体维持微生态平衡、增强动物健康状态的一类活性生物制品及其代谢产物。益生菌是市面上常用的生物制品之一，其可以通过调节肠道菌群的平衡、改善肠道组织形态和刺激特异性和非特异性免疫来调控肠道。同时也不会破坏原有肠道菌群平衡，导致机体出现耐药性，还能提高饲料利用率、减少有害气体产生、降低养殖成本、提高经济效益等。
肠道黏膜被看作是一个庞大而复杂的三维防御系统，由物理、生物、化学和免疫屏障组成，其功能是阻止有害物质进入体循环。动物体内的肠道微生物数量大约是体内细胞数量的10倍，在肠道内形成了一个相互依存、相互作用的微生态系统。幼龄动物在出生后肠道细菌迅速定植，其肠道菌群的建立主要来自环境和母乳。在动物初生后饲喂益生菌制剂能够帮助动物建立完善的肠道菌群系统，益生菌不仅能够发挥其益生作用，还能起到占位作用，减少有害菌的定植。同时微生态制剂在肠道中可以激活巨噬细胞，刺激机体加强细胞免疫和体液免疫。
目前市面上常用的兽用益生菌制剂为粉剂，常拌料使用，但初生反刍动物只能通过哺乳获取食物和营养而无法摄食粉状饲草料。乳膏制剂是一种新型活性生物制品，但市面上产品种类较少，难以满足养殖业的快速发展。因而寻找一种新型益生菌乳膏制剂以适应幼龄反刍动物采食方式并提高其免疫力是非常重要的。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂及应用，该乳膏制剂粘稠、坚硬，且防止营养物质的破坏和损失，同时改善初生反刍动物的肠道菌群、预防腹泻并提高其免疫力。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，所述乳膏制剂由益生菌和乳膏基质混合制成；所述乳膏基质按重量百分比计包括：羧甲基纤维素钠1％-2％、淀粉1％-2％、三聚甘油酯5％-10％、大豆卵磷脂1％-5％，余量为水。
进一步地，所述乳膏基质按重量百分比计包括：羧甲基纤维素钠1.5％、淀粉2％、三聚甘油酯10％、大豆卵磷脂1％，余量为水。
进一步地，所述乳膏基质按重量百分比计还包括甘油1％-10％和香精0.001％-0.02％。
进一步地，所述香精包括食用奶味香精和/或苹果味香精。本发明发现，加入上述保湿剂和香精，可提高乳膏制剂的保湿、调味等功能。
进一步地，所述益生菌由活菌数比为1:1:1:1的枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌和丁酸梭菌组成。本发明进一步发现，上述益生菌发挥增效作用，能够显著降低羔羊腹泻率和腹泻程度以及提高细胞免疫的作用。
进一步地，所述乳膏基质的制备方法包括如下步骤：
1)将羧甲基纤维素钠置于烧杯中，加适量水均匀分散溶胀过夜；
2)另取一烧杯，加入淀粉、三聚甘油酯、大豆卵磷脂和适量水，混合均匀，置电炉上加热并不断搅拌，至形成透明澄清溶液；
3)将两烧杯中溶液混合并不断搅拌，补加剩余水量，搅拌均匀至冷却到室温，得所述乳膏基质。
进一步地，步骤1)中，所述水的添加量为羧甲基纤维素钠质量的20-30倍。
进一步地，步骤2)中，所述水的添加量为淀粉、三聚甘油酯与大豆卵磷脂总质量的2-3倍；所述加热的温度为65-75℃，加热的时间为3-5min。
本发明的第二方面提供了如上所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂在保护肠道健康方面中的应用。
进一步地，所述幼龄反刍动物为羔羊。
本发明具有如下优点：
(1)本发明的益生菌乳膏制剂中的乳膏基质以羧甲基纤维素钠为主要基质，淀粉与三聚甘油酯为增稠剂，大豆卵磷脂为乳化剂。其中，羧甲基纤维素钠在水中能形成胶体溶液，能够增稠、持水，也具有不易发酵、热稳定好等优点；淀粉易于在水中分散，加热产生较强粘性，常作为饲料添加剂的辅料，除增稠作用外，还可以为动物补充能量；三聚甘油酯具有乳化、调节粘度和防腐保鲜等功能；大豆卵磷脂具有吸水性、氧化性、不易溶解、不易分散等特点，能够将乳膏基质与不良的外界环境隔绝，防止营养物质的破坏和损失，以上原料按照特定用量配合使用，所得乳膏基质更加粘稠、坚硬，且防止营养物质的破坏和损失。
(2)本发明的益生菌乳膏制剂在人工模拟酸、碱环境中，益生菌能够很好地存活，即其可以耐受胃液低酸性环境从而进入小肠、耐受高胆盐环境通过小肠并到达大肠发挥益生作用。与传统益生菌制剂相比，该乳膏制剂能够保护益生菌在体内不被杀死，通过率高，能够有效到达肠道。
(3)本发明的益生菌乳膏制剂，使用前无需称量，通过膏状体长度计算用量，且投服时不会像液体剂一样从嘴边流出。同时幼龄反刍动物主要为母乳喂养，本产品仅在初生后饲喂一次，能够减少反复饲喂导致的应激，在临床使用上具有明显优点。
(4)本发明的益生菌乳膏制剂中的益生菌由枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌和丁酸梭菌组成，其中，粪肠球菌属于乳酸菌，能够产生乳酸等抑菌物质，改变肠道内的pH值从而抑制肠道内的病原菌的生长；枯草芽孢杆菌能够竞争性抑制肠道病原菌生长，常用于治疗腹泻性疾病；酵母菌能提供动物机体所需各种营养物质及大量的促生长因子，促进提高畜禽免疫力；丁酸梭菌不仅能够产生丁酸等短链脂肪酸，也能够提高机体的抗氧化功能。以上四种益生菌复配后一次性饲喂初生羔羊，首先在羔羊出生后有益菌迅速占位，与致病菌竞争肠道黏膜结合位点，抑制致病菌的生长繁殖；其次分泌抑菌物质，刺激机体免疫反应的发生，维持肠道稳态的平衡，具有显著降低羔羊腹泻率和腹泻程度以及提高细胞免疫的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的益生菌乳膏制剂耐受性试验结果，其中，DY：胆汁盐环境中复合益生菌液体制剂；DG：胆汁盐环境中复合益生菌乳膏制剂；WY：胃酸环境中复合益生菌液体制剂；WG：胃酸环境中复合益生菌乳膏制剂。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
供试材料：
(1)枯草芽孢杆菌(1×1011cfu/g)、粪肠球菌(1×1011cfu/g)、丁酸梭菌(1×1010cfu/g)、酵母菌(2×1010cfu/g)、复合酶制剂、维生素A乙酸酯(5×104IU/g)、维生素D3(5×104IU/g)、维生素E(50％)、维生素B12(1％)，由河南安进生物技术股份有限公司提供；
(2)羧甲基纤维素钠，批号200358；海藻酸钠，批号20201119；明胶，批号20201203；三聚甘油酯，批号20201126；淀粉，批号200468；大豆卵磷脂，批号20201124；甘油，批号20201027；苹果味香精，批号20201016；乳味香精，批号20201016，购自浙江一诺生物科技有限公司；
(3)胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆汁盐，购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1乳膏主要基质的筛选
准确称取羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、海藻酸钠和明胶置于合适的烧杯中，加适量双蒸水均匀分散溶胀过夜。另取三烧杯，分别加入等量的三聚甘油酯、淀粉、大豆卵磷脂和水，混合均匀，置电炉上加热并不断搅拌，至形成透明澄清溶液；之后将该液体分别倒入CMC-Na、海藻酸钠和明胶中，加双蒸水至1000mL，并不断搅拌均匀至冷却到室温即得到CMC-Na乳膏、海藻酸钠乳膏和明胶乳膏。以4000r·min-1的转速(约1800×g)离心10、30、60、90min，观察乳膏分层现象；根据药典通则0982第一法，取适量乳膏置于载玻片上，覆以盖玻片，轻压使颗粒分布均匀，在50～100倍显微镜下观察，计算视野内直径大于100μm的粒子所占比例。选取水乳不分离及颗粒最少的基质。
表1主要基质筛选结果
由表1可知，CMC-Na在离心90min后析水率最低，且根据药典粒度分布测定法(通则0982第一法)，其粒度大于100μm的颗粒所占比例最少，为1％。因此选用CMC-Na为乳膏主要基质。
实施例2乳膏基质配方筛选
经过查阅相关资料和大量的预实验确定乳膏基质的配方为CMC-Na、淀粉、三聚甘油酯、大豆卵磷脂、甘油、乳味香精、苹果香精。以CMC-Na、淀粉、三聚甘油酯、大豆卵磷脂所占的重量百分比为主要考察因素设立三个水平，通过L9(34)的正交试验进行配方的筛选。
采用如下制备方法：准确称取CMC-Na置于合适的烧杯中，加入质量为CMC-Na质量25倍的水，均匀分散溶胀过夜；另取一烧杯，加入精确称量的三聚甘油酯、淀粉、大豆卵磷脂，以及质量为三聚甘油酯、淀粉与大豆卵磷脂总质量的2.5倍的水，混合均匀，置70℃的电炉上加热并不断搅拌，至形成澄清溶液；之后将该溶液倒入CMC-Na溶胀溶液中，补加剩余水量，并不断搅拌均匀至冷却到室温即得到乳膏基质。
评分标准见表2。各指标测试方法如下：
(1)外观标准：观察乳膏基质外观、颜色。
(2)粒度标准：取适量乳膏基质置于载玻片上，覆以盖玻片，轻压使颗粒分布均匀，在50～100倍显微镜下观察，计算视野内直径大于100μm的粒子所占比例。
(3)稳定性标准：取5mL乳膏基质置于10mL离心管中，以4000r·min-1的转速离心15分钟，观察分层现象。
(4)保湿性标准：取乳膏基质于平板上，室温放置1d，观察乳膏表面水分蒸发干裂情况。
(5)耐热性：取乳膏基质于离心管中，在37℃恒温箱中放置3d，观察乳膏水分析出情况。
(6)耐低温性：取乳膏基质于离心管中，在4℃恒温箱中放置3d，观察乳膏水分析出情况。
(7)耐冻性：取乳膏基质于离心管中，在-20℃恒温箱中放置3d，拿出在室温下解冻后，观察乳膏基质水分析出情况。
表2乳膏基质评分标准对照表
各因素水平表见表3。按照表2设定的评分标准进行评分，结果见表4。
表3乳膏基质配方筛选正交试验水平因素表
表4复合益生菌乳膏制剂配方筛选试验设计与结果
结果显示，各因素影响顺序为CMC-Na＞淀粉＞三聚甘油酯＞大豆卵磷脂。根据K值可得最佳配比为a2、b3、c3、d1。该配方中，CMC-Na使本产品与常见乳膏剂相较更软，粘性更小，喂药时更易挤出，对于幼龄反刍动物更适口。使用淀粉和三聚甘油酯共同作为增稠剂，不仅能保证乳膏剂性状稳定，还能为幼龄动物提供能量物质。同时，加入甘油作为保湿剂，可食用奶味香精和苹果味香精作为调味剂。其中，乳膏基质最佳配方为：每100g乳膏基质中含1.5g CMC-Na、2g淀粉、10g三聚甘油酯、1g大豆卵磷、5g甘油及0.01g可食用奶味香精和苹果味香精。
根据各评分因素，规定合格益生菌乳膏基质需满足以下条件：颜色乳白色，无肉眼可见颗粒，静置不出现分层现象，能在4℃和-20℃条件下保存。
实施例3益生菌乳膏制剂耐受性试验
1、方法
将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌和丁酸梭菌按活菌数1:1:1:1的比例加入1000mL水制备为益生菌液体制剂；将枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌和丁酸梭菌按活菌数1:1:1:1的比例混入1000mL实施例2制备的乳膏基质制备为益生菌乳膏制剂。
采用人工模拟胃酸性环境检测微生物对低pH值耐受性。配5％氯化钠溶液1000mL，加3g胃蛋白酶，用盐酸调节溶液的pH值为2.0。将制备好的益生菌乳膏制剂和益生菌液体制剂分别加到人工模拟的胃液中，37℃恒温水浴锅中避光培养，在0h、1h、2h、3h分别取样，测定活菌总数，做平行试验三次，计算其存活率。
采用人工模拟肠道环境检测微生物对胆汁耐受性。配5％氯化钠溶液1000mL，加1g胰蛋白酶，3g牛胆汁盐，用氢氧化钠调节溶液的pH值为8.0。将制备好的益生菌乳膏制剂和益生菌液体制剂加到人工模拟的肠液中，37℃恒温水浴锅中避光培养，在0h、1h、2h、3h分别取样，测定活菌总数，做平行试验三次，计算其存活率。
2、结果
由图1可见，在pH值为2时，益生菌乳膏制剂能够停留3h，且存活率在20％左右，即其可以耐受胃液低酸性环境从而进入小肠发挥其益生作用，且益生菌乳膏制剂耐酸性优于益生菌液体制剂。在胆汁盐浓度为0.3％时，益生菌乳膏制剂能够停留3h，且存活率在20％左右，即其可以耐受高胆盐环境通过小肠并到达大肠。以上结果表明本发明的益生菌乳膏制剂能够在动物肠道内存活，增加其定植的可能性。
实施例4益生菌乳膏制剂对初生羔羊腹泻指数的影响
1、方法
选择产2羔的母羊及其羔羊按分组同圈喂养至试验结束。共12只母羊及其所产24只羔羊分为4组，每组3只母羊和6只羔羊。在羔羊出生12h内，按4mL/只剂量，分别按试验设计逐只经口投饲喂低、中、高剂量实施例2的益生菌乳膏制剂(每1000mL分别含益生菌4×1011、4×1012、4×1013cfu)，对照组不饲喂益生菌。观察其在第50d的腹泻率和腹泻指数。
腹泻的判定标准：粪便不成形，呈粘稠便、稀便、水样便、粘液便或脓血便，以粪便评分≥5分判定为腹泻。
腹泻指数＝粪便评分之和/供试羔羊只数。
粪便评分标准见表5。
表5粪便评分标准
2、结果
如表6所示，本发明益生菌乳膏制剂能够有效降低羔羊腹泻率和腹泻严重程度。与对照组相比，各剂量益生菌乳膏制剂的腹泻率与腹泻指数均显著低于空白对照组。
益生菌在进入动物肠道后迅速粘附，占据竞争位点，有效的阻止病原微生物的繁殖。除了维持生物屏障作用外，四种菌相互作用，创造健康的肠道环境。枯草芽孢杆菌能够迅速消耗肠道内的游离氧，创造低氧环境，促进厌氧菌粪肠球菌和丁酸梭菌的增殖。粪肠球菌和丁酸梭菌不仅能够作为定植菌粘附于肠道黏膜，还能够产生乳酸、丁酸，降低肠道pH值，从而抑制病原菌生长。酵母菌属于真菌，可作为免疫调节剂促进机体免疫反应，且同时使用酵母菌和细菌性益生菌可以提高其存活率和生长率，也可以增强抗病效果。幼龄动物免疫力较低，常发生细菌感染或寄生虫感染导致腹泻，使用枯草芽孢杆菌、粪肠球菌丁酸梭菌和酵母菌复合益生菌能够有效调节肠道菌群减轻腹泻。总体来说，本发明的益生菌乳膏制剂在保护肠道健康方面具有良好效果。
表6益生菌乳膏制剂对羔羊腹泻率和平均腹泻指数的影响
实施例5益生菌乳膏制剂对初生羔羊免疫性能的影响
1、方法
分别于试验第30d、50d，逐只颈静脉采集供试羔羊血液样品，每只采血5mL，置于促凝管中，室温静置2h，于3500r·min-1离心10min分离血清。采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)分别测定CD4+和CD8+含量以评价绵羊机体的免疫功能。
2、结果
由表7结果可知，在30d时，高剂量益生菌乳膏制剂显著高于低剂量组和对照组CD4+含量、显著高于低剂量组CD8+含量；在50d时，高剂量益生菌乳膏制剂显著高于低剂量组、中剂量组和对照组CD4+含量、显著高于低剂量组和对照组CD8+含量。说明本发明高剂量益生菌乳膏制剂能够显著提高CD4+和CD8+含量，中剂量次之。CD4+、CD8+T淋巴细胞能分泌细胞因子，CD4+细胞可以促进T、B细胞免疫应答，而CD8+细胞具有免疫抑制和细胞毒性的作用。因此本发明可以通过增加CD4+和CD8+含量，促进机体细胞免疫应答，以此抵抗病毒或细菌的侵袭。
表7益生菌乳膏制剂对羔羊平均CD4+、CD8+含量(ng/mL)的影响
注：同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，字母相同或无标记表示差异不显著(P＞0.05)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，所述乳膏制剂由益生菌和乳膏基质混合制成；所述乳膏基质按重量百分比计包括：羧甲基纤维素钠1％-2％、淀粉1％-2％、三聚甘油酯5％-10％、大豆卵磷脂1％-5％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，所述乳膏基质按重量百分比计包括：羧甲基纤维素钠1.5％、淀粉2％、三聚甘油酯10％、大豆卵磷脂1％，余量为水。
3.根据权利要求1所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，所述乳膏基质按重量百分比计还包括甘油1％-10％和香精0.001％-0.02％。
4.根据权利要求3所述的幼龄反刍动物用复合益生菌乳膏制剂，其特征在于，所述香精为食用奶味香精和/或苹果味香精。
5.根据权利要求1-4任一项所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，所述益生菌由活菌数比为1:1:1:1的枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌和丁酸梭菌组成。
6.根据权利要求1所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，所述乳膏基质的制备方法包括如下步骤：
1)将羧甲基纤维素钠置于烧杯中，加适量水均匀分散溶胀过夜；
2)另取一烧杯，加入淀粉、三聚甘油酯、大豆卵磷脂和适量水，混合均匀，置电炉上加热并不断搅拌，至形成透明澄清溶液；
3)将两烧杯中溶液混合并不断搅拌，补加剩余水量，搅拌均匀至冷却到室温，得所述乳膏基质。
7.根据权利要求6所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，步骤1)中，所述水的添加量为羧甲基纤维素钠质量的20-30倍。
8.根据权利要求6所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂，其特征在于，步骤2)中，所述水的添加量为淀粉、三聚甘油酯与大豆卵磷脂总质量的2-3倍；所述加热的温度为65-75℃，加热的时间为3-5min。
9.权利要求1所述的幼龄反刍动物用益生菌乳膏制剂在保护肠道健康方面中的应用。
10.根据权利要9所述的应用，其特征在于，所述幼龄反刍动物为羔羊。
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