CN114990135A - 一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法 - Google Patents
一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114990135A CN114990135A CN202210724200.6A CN202210724200A CN114990135A CN 114990135 A CN114990135 A CN 114990135A CN 202210724200 A CN202210724200 A CN 202210724200A CN 114990135 A CN114990135 A CN 114990135A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rice
- seq
- beta
- pcr amplification
- glucan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 78
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 71
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 title claims abstract description 38
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims abstract description 27
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 10
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 70
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 35
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 2
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011529 cardiovascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种籽粒β‑葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，该方法包括：将GluB‑1启动子和CslF6基因进行重组，重组后的目标基因转入至受体植株中，得到转基因水稻；所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明方法获得的转基因水稻能够显著提高水稻籽粒中的β‑葡聚糖含量，在水稻遗传育种领域可用于培育高β‑葡聚糖含量的水稻新品种，为功能稻的筛选和培育提供理论指导。
Description
技术领域
本发明涉及作物生理技术领域，尤其涉及一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法。
背景技术
β-葡聚糖是禾谷类植物籽粒细胞壁中的非淀粉多糖，是籽粒细胞壁的主要成分。β-葡聚糖属于膳食纤维成分之一，具有许多有益的健康特性，主要体现在以下几个方面：1.降低血糖血脂和血清胆固醇。β-葡聚糖能够减少小肠对脂肪及胆固醇的吸收率，从而降低血清胆固醇；同时β-葡聚糖作为一种粘性纤维，可通过影响肠道粘度而减缓碳水化合物的吸收，从而降低血糖；β-葡聚糖可降低血液中的胆固醇和葡萄糖浓度，从而降低心血管疾病和糖尿病的风险。2.改善肠道健康。β-葡聚糖在小肠中不能水解，而在大肠中降解并作为细菌发酵的底物，发酵产生乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸，抑制腐败菌，促进益生菌，维持肠道菌群平衡，从而促进肠道健康，其在胃肠道的正常运作和预防炎症以及结肠癌方面发挥着重要作用。总之，β-葡聚糖具有许多有益健康特性，其可能在改善健康和预防慢性非传染性疾病方面发挥关键作用，例如糖尿病、高胆固醇血症、肥胖症、心血管疾病和癌症等。
水稻是我国主要的粮食作物，随着我国经济的发展，国民对稻米的需求由吃得饱变为吃的健康，对高端稻米产业的功能稻供给研究逐渐提上日程。功能稻应具备优质的营养结构和丰富的营养供给，同时具有部分高端保健功能，对一些疾病的预防和防治都具有良好的效果。目前，生产上功能稻的主栽品种十分缺乏，选育进程缓慢，极大限制了人们日常饮食中对功能营养成分的摄取，限制了人们对高品质稻米的需求。已知水稻中β-葡聚糖含量极低，远远低于大麦和燕麦。
因此，提高水稻中β-葡聚糖含量可以提高人们日常饮食中对β-葡聚糖的摄取，通过食疗对糖尿病、高胆固醇血症、肥胖症和心血管疾病等有较好的辅助治疗功能；同时也为水稻功能营养品质育种提供材料基础，为功能稻的筛选和培育提供参考。
发明内容
本发明提供了一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，该方法能够使水稻籽粒中的β-葡聚糖含量提高至少3～4倍。
具体技术方案如下：
一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，包括：将GluB-1启动子和CslF6基因转入至受体植株中，得到转基因水稻；
将GluB-1启动子和CslF6基因进行重组，重组后的目标基因转入至受体植株中，得到转基因水稻；所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述受体植株为水稻中花11或和华占。
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)分别获取GluB-1启动子和CslF6基因；所述GluB-1启动子的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述CslF6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)将步骤(1)的GluB-1启动子和CslF6基因连接至原始表达载体上，得到同时包含有GluB-1启动子和CslF6基因的重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化至感受态细胞进行培养，得到基因工程菌；
(4)将步骤(3)的基因工程菌转化至受体植株内，得到转基因植株；
(5)验证步骤(4)的转基因植株，测定转基因植株籽粒中的β-葡聚糖含量，得到籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻。
进一步地，步骤(1)中，获取GluB-1启动子的方法为：
(A)提取水稻中花11幼苗叶片的基因组DNA；
(B)对基因组DNA进行一次PCR扩增，再对一次扩增后的产物进行二次PCR扩增，得到目标扩增产物；
所述一次PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述二次PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
进一步地，步骤(1)中，获取CslF6基因的方法为：
(a)提取水稻叶片总RNA，反转录成单链cDNA；
(b)以单链cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，再对第一轮PCR扩增后的产物进行第二轮PCR扩增，得到目标扩增产物；
所述第一轮PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述第一轮PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
进一步地，所述原始表达载体为B24_pCAMBIA-1300-35S-GFP-Nos。
进一步地，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将GluB-1启动子和CslF6基因进行重组，重组后的目标基因转入至受体植株中，获得的转基因水稻能够显著提高水稻籽粒中的β-葡聚糖含量，在水稻遗传育种领域可用于培育高β-葡聚糖含量的水稻新品种，为功能稻的筛选和培育提供理论指导。
附图说明
图1为实施例1、2、3中过表达植株与对照植株籽粒β-葡聚糖含量的比较；
其中，图A受体材料为中花11，图B受体材料为华占；CK表示阴性对照材料；OE1，OE2，OE3分别表示实施例1、2、3中的转基因阳性植株；**所示为实施例1中的转基因植株与对照植株的差异为极显著，显著水平为P<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1转基因植株的制备(GluB-1启动子连接CslF6基因)
1)水稻基因组DNA的提取
水稻种子(中花11)在25℃条件下发芽，水稻幼苗长到3～4片叶时，采用CTAB法提取水稻幼苗叶片基因组DNA。
2)启动子的分离
以上述步骤中的基因组DNA为模板，用以下引物按下述方法进行两轮PCR扩增，获得启动子核苷酸序列。
第一轮PCR扩增：
模板：步骤1)中的基因组DNA
引物如下：
F:5’-ACAGATTCTTGCTACCAACAAC-3’；
R:5’-AGTTCAAAGACAGACCAAGCTAG-3’；
以水稻基因组DNA为模板，在上述引物的作用下，通过PCR扩增得到启动子片段。
PCR体系(50μL)：
PCR程序：
第二轮PCR扩增：
模板：第一轮纯化后的PCR产物
引物：
F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACAGATTCTTGCTACCAACAAC-3’；
R:5’-AGTTCAAAGACAGACCAAGCTAG-3’；
PCR体系和程序与第一轮相同。
扩增结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(长约为2.3kb的特异性扩增条带)并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
3)水稻总RNA提取及cDNA合成
采用Takara公司的TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取水稻(中花11)叶片中总RNA，采用DNase I酶去除基因组DNA，随后使用Takara公司的
RTreagent Kit Perfect Real Time试剂盒将提取的总RNA反转录成单链cDNA。
4)A基因编码区扩增
以上述步骤中的cDNA为模板，用以下引物按下述方法进行两轮PCR扩增，选用TOYOBO公司的KOD-FX聚合酶，扩增得到PCR产物，全长为2865bp。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
第一轮PCR扩增：
模板：步骤3)中的cDNA
引物：F:5’-TTAGCAATGGCGCCAGCGGT-3’；
R:5’-TCATGGCCAGGCGTAGGTGA-3’；
PCR体系(50μL)：
PCR程序：
第二轮PCR扩增：
模板：第一轮纯化后的PCR产物
引物：
F:5’-CTAGCTTGGTCTGTCTTTGAACTTTAGCAATGGCGCCAGCGGT-3’；
R:5’-TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATGGCCAGGCGTAGGTGA-3’；
PCR体系和程序与第一轮相同。
5)重组载体构建
采用Vazyme的同源重组试剂盒进行线性化载体、启动子片段和基因编码区片段的同源重组，在此所用载体为pCAMBIA-1300-35S-GFP-Nos，限制性酶切位点分别为HindIII(AAGCTT)和SacI(GAGCTC)。
将重组载体转化大肠杆菌感受态，涂板至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，过夜培养后挑取单克隆采用引物F(5’-CTAGCTTGGTCTGTCTTTGAACTTTAGCAATGGCGCCAGCGGT-3’)和R:(5’-TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATGGCCAGGCGTAGGTGA-3’)进行菌液PCR验证并测序验证其序列(即如SEQ ID No.1所示，重组片段总长为5209bp)。
将序列正确的阳性克隆进行过夜培养抽提质粒。质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，提取方法参照说明书。将质粒进行遗传转化，转化受体材料为中花11。
经潮霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株；再依次提取转基因候选植株和对照组植株CK(不含潮霉素抗性基因)的DNA，通过PCR的验证方法获得转基因阳性植株和阴性植株(作为对照组材料)，其中验证引物为上述菌液PCR验证引物，引物信息如前所述。
实施例2转基因植株的制备(35S启动子连接CslF6基因)
1)水稻总RNA提取及cDNA合成
采用Takara公司的TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取水稻(中花11)叶片中总RNA，采用DNase I酶去除基因组DNA，随后使用Takara公司的
RTreagent Kit Perfect Real Time试剂盒将提取的总RNA反转录成单链cDNA。
2)基因编码区扩增
以上述步骤中的cDNA为模板，用以下引物按下述方法进行两轮PCR扩增，选用TOYOBO公司的KOD-FX聚合酶，扩增得到PCR产物，全长为2865bp。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
第一轮PCR扩增：
模板：步骤3)中的cDNA
引物：F:5’-TTAGCAATGGCGCCAGCGGT-3’；
R:5’-TCATGGCCAGGCGTAGGTGA-3’；
PCR体系(50μL)：
PCR程序：
第二轮PCR扩增：
模板：第一轮纯化后的PCR产物
引物：
F:5’-AGAACACGGGGGACTCTAGATTAGCAATGGCGCCAGCGGT-3’；
R:5’-TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATGGCCAGGCGTAGGTGA-3’；
PCR体系和程序与第一轮相同。
3)重组载体构建
采用Vazyme的同源重组试剂盒进行线性化载体、启动子片段和基因编码区片段的同源重组，在此所用载体为pCAMBIA-1300-35S-GFP-Nos，限制性酶切位点分别为XbaI(TCTAGA)和SacI(GAGCTC)。
将重组载体转化大肠杆菌感受态，涂板至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，过夜培养后挑取单克隆采用引物F(5’-AGAACACGGGGGACTCTAGATTAGCAATGGCGCCAGCGGT-3’)和R:(5’-TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATGGCCAGGCGTAGGTGA-3’)进行菌液PCR验证并测序验证其序列(即如SEQ ID No.3所示，重组片段总长为3739bp)。
将序列正确的阳性克隆进行过夜培养抽提质粒。质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，提取方法参照说明书。将质粒进行遗传转化，转化受体材料为中花11和华占。
经潮霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株；再依次提取转基因候选植株和对照组植株CK(不含潮霉素抗性基因)的DNA，通过PCR的验证方法获得转基因阳性植株和阴性植株(作为对照组材料)，其中验证引物为上述菌液PCR验证引物，引物信息前已所述。
实施例3转基因植株的制备(GluB-1启动子连接CslF3基因)
1)水稻基因组DNA的提取
水稻种子(中花11)在25℃条件下发芽，水稻幼苗长到3～4片叶时，采用CTAB法提取水稻幼苗叶片基因组DNA。
2)启动子的分离
以上述步骤中的基因组DNA为模板，用以下引物按下述方法进行两轮PCR扩增，获得启动子核苷酸序列。
第一轮PCR扩增：
模板：步骤1)中的基因组DNA
引物如下：
F:5’-ACAGATTCTTGCTACCAACAAC-3’；
R:5’-AGTTCAAAGACAGACCAAGCTAG-3’；
以水稻基因组DNA为模板，在上述引物的作用下，通过PCR扩增得到启动子片段。
PCR体系(50μL)：
PCR程序：
第二轮PCR扩增：
模板：第一轮纯化后的PCR产物
引物：
F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACAGATTCTTGCTACCAACAAC-3’；
R:5’-AGTTCAAAGACAGACCAAGCTAG-3’；
PCR体系和程序与第一轮相同。
扩增结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(长约为2.3kb的特异性扩增条带)并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
3)水稻总RNA提取及cDNA合成
采用Takara公司的TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取水稻(中花11)叶片中总RNA，采用DNase I酶去除基因组DNA，随后使用Takara公司的
RTreagent Kit Perfect Real Time试剂盒将提取的总RNA反转录成单链cDNA。
4)基因编码区扩增
以上述步骤中的cDNA为模板，用以下引物按下述方法进行两轮PCR扩增，选用TOYOBO公司的KOD-FX聚合酶，扩增得到PCR产物，全长为2553bp。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
第一轮PCR扩增：
模板：步骤3)中的cDNA
引物：F:5’-ATGGCGTCGGCGGCCGGTGC-3’；
R:5’-AAATGGAAGAAAACTAAGAA-3’；
PCR体系(50μL)：
PCR程序：
第二轮PCR扩增：
模板：第一轮纯化后的PCR产物
引物：
F:5’-CTAGCTTGGTCTGTCTTTGAACTATGGCGTCGGCGGCCGGTGC-3’；
R:5’-TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCAAATGGAAGAAAACTAAGAA-3’；
PCR体系和程序与第一轮相同。
5)重组载体构建
采用Vazyme的同源重组试剂盒进行线性化载体、启动子片段和基因编码区片段的同源重组，在此所用载体为pCAMBIA-1300-35S-GFP-Nos，限制性酶切位点分别为HindIII(AAGCTT)和SacI(GAGCTC)。
将重组载体转化大肠杆菌感受态，涂板至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，过夜培养后挑取单克隆采用引物F(5’-CTAGCTTGGTCTGTCTTTGAACTATGGCGTCGGCGGCCGGTGC-3’)和R:(5’-TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCAAATGGAAGAAAACTAAGAA-3’)进行菌液PCR验证并测序验证其序列(即如SEQ ID No.4所示，重组片段总长为4897bp)。
将序列正确的阳性克隆进行过夜培养抽提质粒。质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，提取方法参照说明书。将质粒进行遗传转化，转化受体材料为中花11。
经潮霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株；再依次提取转基因候选植株和对照组植株CK(不含潮霉素抗性基因)的DNA，通过PCR的验证方法获得转基因阳性植株和阴性植株(作为对照组材料)，其中验证引物为上述菌液PCR验证引物，引物信息前已所述。
实施例4功能验证
对上述实施例1～3中的转基因阳性植株与对照组植株CK(非转基因植株)成熟籽粒进行β-葡聚糖含量的测定分析，测定采用Megazyme试剂盒。结果发现，与对照相比，仅实施例1中导入SEQ ID No.1(GluB-1启动子连接CslF6基因组合)的转基因阳性植株籽粒β-葡聚糖含量极显著升高，最高可分别达对照的350％(中花11)和500％(华占)左右，而实施例2和3(其他启动子和基因组合)在两个受体材料中均不能提高水稻籽粒β-葡聚糖含量。因此，通过以上分析发现通过在水稻中外源导入SEQ ID No.1序列可提高水稻籽粒β-葡聚糖含量。
序列表
<110> 浙江大学中原研究院
<120> 一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5209
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttacag attcttgcta ccaacaactt cacaaagtag 60
tagtcaacca aaactatgct aaggaatcac ctcacttccg cccatgaccg tgagcacgac 120
tgttcaaaca gtttgttaat ctctacaaag aaggtacact ttacctacac aacgccacta 180
acctgagtta cccagcccat gcaaaatagc cacgtcttgt gacttaaggg atttcgcgac 240
aaggcatttc gaaagcccac acaaggacac cttatgaaaa ctggaggggt cccacagacc 300
aacaacaagt taggtcccaa accatgttgt gccaggaaaa atccaagggg tcctccccaa 360
caccaccccg acaaatccac ttgtccattg gcatcaagat ttgcctgacc tagctaatta 420
ctcagccagg catgtcacaa ttcacccatg tggtcacaca tgttaggttg gagaaattct 480
aaaggaaagg aatcggtcca tatgagcaag accgagaaac cataccacca gtacttctac 540
cgaaatacga gtttagtaaa ctcatttgtt ttcaaggcac ccgacccagg tgtgtcgggt 600
tttccaggga ttttgtaaac ccaagtttta cccatagttg atcattcaaa ttttgaggag 660
ggtcattggt atccgtacct gagggcacga atactgagac ctagcattgt agtcgaccaa 720
ggaggttaat gcagcaattg taggtggggc ctgttggtta tattgcaaac tgcggccaac 780
atttcatgtg taatttagag atgtgcattt tgagaaatga aatacttagt ttcaaattat 840
gggctcaaat aatgaaaggt gacctacctt gcttgatatc ttgagcttct tcctcgtatt 900
ccgcgcacta ggagatcttc tggctccgaa gctacacgtg gaacgagata actcaacaaa 960
acgaccaagg aaaagctcgt attagtgagt actaagtgtg ccactgaata gatctcgatt 1020
tttgaggaat tttagaagtt gaacagagtc aatcgaacag acagttgaag agatatggat 1080
tttctaagat taattgattc tctgtataaa gaaaaaaagt attattgaat taaatggaaa 1140
aagaaaaagg aaaaagggga tggcttctgc tttttgggct gaaggcggcg tgtggccagc 1200
gtgctgcgtg cggacagcga gcgaacacac gacggagcag ctacgacgaa cgggggaccg 1260
agtggaccgg acgaggatgt ggcctaggac gagtgcacaa ggctagtgga ctcggtcccc 1320
gcgcggtatc ccgagtggtc cactgtctgc aaacacgatt cacatagagc gggcagacgc 1380
gggagccgtc ctaggtgcac cggaagcaaa tccgtcgcct gggtggattt gagtgacacg 1440
gcccacgtgt agcctcacag ctctccgtgg tcagatgtgt aaaattatca taatatgtgt 1500
ttttcaaata gttaaataat atatataggc aagttatatg ggtcaataag cagtaaaaag 1560
gcttatgaca tggtaaaatt acttacacca atatgcctta ctgtctgata tattttacat 1620
gacaacaaag ttacaagtac gtcatttaaa aatacaagtt acttatcaat tgtagtgtat 1680
caagtaaatg acaacaaacc tacaaatttg ctattttgaa ggaacactta aaaaaatcaa 1740
taggcaagtt atatagtcaa taaactgcaa gaaggcttat gacatggaaa aattacatac 1800
accaatatgc tttattgtcc ggtatatttt acaagacaac aaagttataa gtatgtcatt 1860
taaaaataca agttacttat caattgtcaa gtaaatgaaa acaaacctac aaatttgtta 1920
ttttgaagga acacctaaat tatcaaatat agcttgctac gcaaaatgac aacatgctta 1980
caagttatta tcatcttaaa gttagactca tcttctcaag cataagagct ttatggtgca 2040
aaaacaaata taatgacaag gcaaagatac atacatatta agagtatgga cagacatttc 2100
tttaacaaac tccatttgta ttactccaaa agcaccagaa gtttgtcatg gctgagtcat 2160
gaaatgtata gttcaatctt gcaaagttgc ctttcctttt gtactgtgtt ttaacactac 2220
aagccatata ttgtctgtac gtgcaacaaa ctatatcacc atgtatccca agatgctttt 2280
ttattgctat ataaactagc ttggtctgtc tttgaacttt agcaatggcg ccagcggtgg 2340
ccggcggcgg agggaggagg aacaatgagg gggtgaacgg gaacgcggcg gcgccggcgt 2400
gcgtgtgcgg gttcccggtg tgcgcgtgcg cgggggcggc ggcggtggcg tcggcggcgt 2460
cgtcggcgga catggacatc gtggcggcgg ggcagatcgg cgccgtcaac gacgagagct 2520
gggtcgccgt cgacctcagc gacagcgacg acgcccccgc cgccggcgac gtccagggcg 2580
ccctcgacga ccgccccgtc ttccgtaccg agaagatcaa gggcgtcctc ctccacccct 2640
accgggtgct gatctttgtg aggctgatcg cgttcacact gttcgtgata tggcgtatcg 2700
agcacaagaa cccggacgcg atgtggctgt gggtgacgtc gatcgccggc gagttctggt 2760
tcgggttctc gtggctgctc gaccagctcc ccaagctgaa cccgatcaac cgcgtccccg 2820
acctcgccgt cctccgccgc cgcttcgacc acgccgacgg gacctcctcc ctcccggggc 2880
tggacatctt cgtcaccacc gccgacccga tcaaggagcc catcctgtcg acggcgaact 2940
ccatcctctc catcctcgcc gccgactacc ccgtcgaccg caacacctgc tacctctccg 3000
acgactctgg gatgctcctc acctacgagg ccatggcgga ggcggccaag ttcgcgacgc 3060
tgtgggtgcc cttctgccgg aagcacgcca tcgagccgcg cgggcctgag agctacttcg 3120
agctcaagtc ccacccctac atggggaggg cgcaggagga gttcgtcaac gaccgccgcc 3180
gcgtccgcaa ggagtacgac gacttcaagg ccaggatcaa cggcctcgag cacgacatca 3240
agcagaggtc cgactcctac aacgccgccg ccggcgtcaa ggacggcgag ccccgcgcca 3300
cctggatggc cgacgggtcg cagtgggagg gcacctggat cgagcagtcg gagaaccacc 3360
gcaagggcga ccacgccggc atcgtcctgg tgttgctgaa ccacccgagc cacgcacggc 3420
agctggggcc gccggcgagc gccgacaacc cgctggactt cagcggcgtg gacgtgcggc 3480
tgccgatgct ggtgtacgtc gcacgtgaga agcgccccgg gtgcaaccac cagaagaagg 3540
ccggcgccat gaacgcgctg acccgcgcct ccgccgtgct ctccaactcc cccttcatcc 3600
tcaacctcga ctgcgaccac tacatcaaca actcccaggc gctccgcgcc ggcatctgct 3660
tcatgctcgg ccgcgacagc gacaccgtcg cgttcgtcca gttcccgcag cgcttcgagg 3720
gcgtcgaccc caccgacctc tatgctaacc acaaccgtat cttcttcgac ggcacgctcc 3780
gtgccctcga cgggctgcag gggcctatct acgtcggcac cgggtgtctc ttccgccgca 3840
tcacgctgta cgggttcgag ccgccgagga tcaacgtcgg cggaccgtgc ttcccgaggc 3900
tcggtgggat gttcgccaag aacaggtacc agaagcctgg gttcgagatg accaagcctg 3960
gtgccaagcc ggtggcgccg ccgccggcgg cgacggtggc gaaggggaag cacgggttcc 4020
tgccgatgcc caagaaggcg tacggcaagt cggacgcgtt cgccgacacc atcccgcgcg 4080
cgtcgcaccc gtcgccgtac gcggcggagg cggcggtggc ggccgacgag gcggcgatcg 4140
cggaggccgt gatggtgacg gcggcggcgt acgagaagaa gaccgggtgg gggagcgaca 4200
tcgggtgggt gtacggcacg gtgacggagg acgtggtgac cggctaccgg atgcacatca 4260
aggggtggag gtcgcgctac tgctccatct acccgcacgc gttcatcggg acggcgccga 4320
tcaacctgac ggagaggctg ttccaggtgc tccggtggtc gacgggttcg ctggagatct 4380
tcttctcgag gaacaacccg ctgttcggga gcacgttcct gcacccgctg cagcgcgtgg 4440
cgtacatcaa catcaccacc tacccgttca cggcgctgtt cctcatcttc tacaccaccg 4500
tgccggcgct gtcgttcgtg acggggcact tcatcgtgca gaggccgacc accatgttct 4560
acgtctacct cgccatcgtg ctcgggacgc tgctcatcct cgccgtgctg gaggtgaagt 4620
gggcgggggt caccgtgttc gagtggttca ggaacgggca gttctggatg acggccagct 4680
gctccgccta cctcgccgcc gtgctgcagg tggtcaccaa ggtggtgttc cggcgggaca 4740
tctcgttcaa gctcacctcc aagctccccg ccggcgacga gaagaaggac ccctacgccg 4800
acctgtacgt ggtgcggtgg acgtggctca tgatcacccc catcatcatc atcctcgtca 4860
acatcatcgg ctccgccgtc gccttcgcca aggtgctcga cggcgagtgg acgcactggc 4920
tcaaggtcgc cggcggcgtg ttcttcaact tctgggtcct cttccacctc taccccttcg 4980
ccaagggcat cctcgggaag cacggcaaga cgccggtggt ggtgctcgtc tggtgggcct 5040
tcaccttcgt catcaccgcc gtgctctaca tcaacatccc ccacatccat ggccccggcc 5100
gccacggcgc cgcctcacca tcccacggcc accacagcgc ccatggcacc aagaagtacg 5160
acttcaccta cgcctggcca tgagagctcg aatttccccg atcgttcaa 5209
<210> 2
<211> 2292
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
acagattctt gctaccaaca acttcacaaa gtagtagtca accaaaacta tgctaaggaa 60
tcacctcact tccgcccatg accgtgagca cgactgttca aacagtttgt taatctctac 120
aaagaaggta cactttacct acacaacgcc actaacctga gttacccagc ccatgcaaaa 180
tagccacgtc ttgtgactta agggatttcg cgacaaggca tttcgaaagc ccacacaagg 240
acaccttatg aaaactggag gggtcccaca gaccaacaac aagttaggtc ccaaaccatg 300
ttgtgccagg aaaaatccaa ggggtcctcc ccaacaccac cccgacaaat ccacttgtcc 360
attggcatca agatttgcct gacctagcta attactcagc caggcatgtc acaattcacc 420
catgtggtca cacatgttag gttggagaaa ttctaaagga aaggaatcgg tccatatgag 480
caagaccgag aaaccatacc accagtactt ctaccgaaat acgagtttag taaactcatt 540
tgttttcaag gcacccgacc caggtgtgtc gggttttcca gggattttgt aaacccaagt 600
tttacccata gttgatcatt caaattttga ggagggtcat tggtatccgt acctgagggc 660
acgaatactg agacctagca ttgtagtcga ccaaggaggt taatgcagca attgtaggtg 720
gggcctgttg gttatattgc aaactgcggc caacatttca tgtgtaattt agagatgtgc 780
attttgagaa atgaaatact tagtttcaaa ttatgggctc aaataatgaa aggtgaccta 840
ccttgcttga tatcttgagc ttcttcctcg tattccgcgc actaggagat cttctggctc 900
cgaagctaca cgtggaacga gataactcaa caaaacgacc aaggaaaagc tcgtattagt 960
gagtactaag tgtgccactg aatagatctc gatttttgag gaattttaga agttgaacag 1020
agtcaatcga acagacagtt gaagagatat ggattttcta agattaattg attctctgta 1080
taaagaaaaa aagtattatt gaattaaatg gaaaaagaaa aaggaaaaag gggatggctt 1140
ctgctttttg ggctgaaggc ggcgtgtggc cagcgtgctg cgtgcggaca gcgagcgaac 1200
acacgacgga gcagctacga cgaacggggg accgagtgga ccggacgagg atgtggccta 1260
ggacgagtgc acaaggctag tggactcggt ccccgcgcgg tatcccgagt ggtccactgt 1320
ctgcaaacac gattcacata gagcgggcag acgcgggagc cgtcctaggt gcaccggaag 1380
caaatccgtc gcctgggtgg atttgagtga cacggcccac gtgtagcctc acagctctcc 1440
gtggtcagat gtgtaaaatt atcataatat gtgtttttca aatagttaaa taatatatat 1500
aggcaagtta tatgggtcaa taagcagtaa aaaggcttat gacatggtaa aattacttac 1560
accaatatgc cttactgtct gatatatttt acatgacaac aaagttacaa gtacgtcatt 1620
taaaaataca agttacttat caattgtagt gtatcaagta aatgacaaca aacctacaaa 1680
tttgctattt tgaaggaaca cttaaaaaaa tcaataggca agttatatag tcaataaact 1740
gcaagaaggc ttatgacatg gaaaaattac atacaccaat atgctttatt gtccggtata 1800
ttttacaaga caacaaagtt ataagtatgt catttaaaaa tacaagttac ttatcaattg 1860
tcaagtaaat gaaaacaaac ctacaaattt gttattttga aggaacacct aaattatcaa 1920
atatagcttg ctacgcaaaa tgacaacatg cttacaagtt attatcatct taaagttaga 1980
ctcatcttct caagcataag agctttatgg tgcaaaaaca aatataatga caaggcaaag 2040
atacatacat attaagagta tggacagaca tttctttaac aaactccatt tgtattactc 2100
caaaagcacc agaagtttgt catggctgag tcatgaaatg tatagttcaa tcttgcaaag 2160
ttgcctttcc ttttgtactg tgttttaaca ctacaagcca tatattgtct gtacgtgcaa 2220
caaactatat caccatgtat cccaagatgc ttttttattg ctatataaac tagcttggtc 2280
tgtctttgaa ct 2292
<210> 3
<211> 2859
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 3
atggcgccag cggtggccgg cggcggaggg aggaggaaca atgagggggt gaacgggaac 60
gcggcggcgc cggcgtgcgt gtgcgggttc ccggtgtgcg cgtgcgcggg ggcggcggcg 120
gtggcgtcgg cggcgtcgtc ggcggacatg gacatcgtgg cggcggggca gatcggcgcc 180
gtcaacgacg agagctgggt cgccgtcgac ctcagcgaca gcgacgacgc ccccgccgcc 240
ggcgacgtcc agggcgccct cgacgaccgc cccgtcttcc gtaccgagaa gatcaagggc 300
gtcctcctcc acccctaccg ggtgctgatc tttgtgaggc tgatcgcgtt cacactgttc 360
gtgatatggc gtatcgagca caagaacccg gacgcgatgt ggctgtgggt gacgtcgatc 420
gccggcgagt tctggttcgg gttctcgtgg ctgctcgacc agctccccaa gctgaacccg 480
atcaaccgcg tccccgacct cgccgtcctc cgccgccgct tcgaccacgc cgacgggacc 540
tcctccctcc cggggctgga catcttcgtc accaccgccg acccgatcaa ggagcccatc 600
ctgtcgacgg cgaactccat cctctccatc ctcgccgccg actaccccgt cgaccgcaac 660
acctgctacc tctccgacga ctctgggatg ctcctcacct acgaggccat ggcggaggcg 720
gccaagttcg cgacgctgtg ggtgcccttc tgccggaagc acgccatcga gccgcgcggg 780
cctgagagct acttcgagct caagtcccac ccctacatgg ggagggcgca ggaggagttc 840
gtcaacgacc gccgccgcgt ccgcaaggag tacgacgact tcaaggccag gatcaacggc 900
ctcgagcacg acatcaagca gaggtccgac tcctacaacg ccgccgccgg cgtcaaggac 960
ggcgagcccc gcgccacctg gatggccgac gggtcgcagt gggagggcac ctggatcgag 1020
cagtcggaga accaccgcaa gggcgaccac gccggcatcg tcctggtgtt gctgaaccac 1080
ccgagccacg cacggcagct ggggccgccg gcgagcgccg acaacccgct ggacttcagc 1140
ggcgtggacg tgcggctgcc gatgctggtg tacgtcgcac gtgagaagcg ccccgggtgc 1200
aaccaccaga agaaggccgg cgccatgaac gcgctgaccc gcgcctccgc cgtgctctcc 1260
aactccccct tcatcctcaa cctcgactgc gaccactaca tcaacaactc ccaggcgctc 1320
cgcgccggca tctgcttcat gctcggccgc gacagcgaca ccgtcgcgtt cgtccagttc 1380
ccgcagcgct tcgagggcgt cgaccccacc gacctctatg ctaaccacaa ccgtatcttc 1440
ttcgacggca cgctccgtgc cctcgacggg ctgcaggggc ctatctacgt cggcaccggg 1500
tgtctcttcc gccgcatcac gctgtacggg ttcgagccgc cgaggatcaa cgtcggcgga 1560
ccgtgcttcc cgaggctcgg tgggatgttc gccaagaaca ggtaccagaa gcctgggttc 1620
gagatgacca agcctggtgc caagccggtg gcgccgccgc cggcggcgac ggtggcgaag 1680
gggaagcacg ggttcctgcc gatgcccaag aaggcgtacg gcaagtcgga cgcgttcgcc 1740
gacaccatcc cgcgcgcgtc gcacccgtcg ccgtacgcgg cggaggcggc ggtggcggcc 1800
gacgaggcgg cgatcgcgga ggccgtgatg gtgacggcgg cggcgtacga gaagaagacc 1860
gggtggggga gcgacatcgg gtgggtgtac ggcacggtga cggaggacgt ggtgaccggc 1920
taccggatgc acatcaaggg gtggaggtcg cgctactgct ccatctaccc gcacgcgttc 1980
atcgggacgg cgccgatcaa cctgacggag aggctgttcc aggtgctccg gtggtcgacg 2040
ggttcgctgg agatcttctt ctcgaggaac aacccgctgt tcgggagcac gttcctgcac 2100
ccgctgcagc gcgtggcgta catcaacatc accacctacc cgttcacggc gctgttcctc 2160
atcttctaca ccaccgtgcc ggcgctgtcg ttcgtgacgg ggcacttcat cgtgcagagg 2220
ccgaccacca tgttctacgt ctacctcgcc atcgtgctcg ggacgctgct catcctcgcc 2280
gtgctggagg tgaagtgggc gggggtcacc gtgttcgagt ggttcaggaa cgggcagttc 2340
tggatgacgg ccagctgctc cgcctacctc gccgccgtgc tgcaggtggt caccaaggtg 2400
gtgttccggc gggacatctc gttcaagctc acctccaagc tccccgccgg cgacgagaag 2460
aaggacccct acgccgacct gtacgtggtg cggtggacgt ggctcatgat cacccccatc 2520
atcatcatcc tcgtcaacat catcggctcc gccgtcgcct tcgccaaggt gctcgacggc 2580
gagtggacgc actggctcaa ggtcgccggc ggcgtgttct tcaacttctg ggtcctcttc 2640
cacctctacc ccttcgccaa gggcatcctc gggaagcacg gcaagacgcc ggtggtggtg 2700
ctcgtctggt gggccttcac cttcgtcatc accgccgtgc tctacatcaa catcccccac 2760
atccatggcc ccggccgcca cggcgccgcc tcaccatccc acggccacca cagcgcccat 2820
ggcaccaaga agtacgactt cacctacgcc tggccatga 2859
<210> 4
<211> 3733
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 4
ccgtgttctc tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag gaagggtctt gcgaaggata 60
gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga 120
agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt 180
gggaccactg tcggcagagg catcttcaac gatggccttt cctttatcgc aatgatggca 240
tttgtaggag ccaccttcct tttccactat cttcacaata aagtgacaga tagctgggca 300
atggaatccg aggaggtttc cggatattac cctttgttga aaagtctcaa ttgccctttg 360
gtcttctgag actgtatctt tgatattttt ggagtagaca agtgtgtcgt gctccaccat 420
gttgacgaag attttcttct tgtcattgag tcgtaagaga ctctgtatga actgttcgcc 480
agtctttacg gcgagttctg ttaggtcctc tatttgaatc tttgactcca tggcctttga 540
ttcagtggga actacctttt tagagactcc aatctctatt acttgccttg gtttgtgaag 600
caagccttga atcgtccata ctggaatagt acttctgatc ttgagaaata tatctttctc 660
tgtgttcttg atgcagttag tcctgaatct tttgactgca tctttaacct tcttgggaag 720
gtatttgatt tcctggagat tattgctcgg gtagatcgtc ttgatgagac ctgctgcgta 780
agcctctcta accatctgtg ggttagcatt ctttctgaaa ttgaaaaggc taatctgggg 840
acctgcaggc atgctctaga gtcccccgtg ttctatggcg ccagcggtgg ccggcggcgg 900
agggaggagg aacaatgagg gggtgaacgg gaacgcggcg gcgccggcgt gcgtgtgcgg 960
gttcccggtg tgcgcgtgcg cgggggcggc ggcggtggcg tcggcggcgt cgtcggcgga 1020
catggacatc gtggcggcgg ggcagatcgg cgccgtcaac gacgagagct gggtcgccgt 1080
cgacctcagc gacagcgacg acgcccccgc cgccggcgac gtccagggcg ccctcgacga 1140
ccgccccgtc ttccgtaccg agaagatcaa gggcgtcctc ctccacccct accgggtgct 1200
gatctttgtg aggctgatcg cgttcacact gttcgtgata tggcgtatcg agcacaagaa 1260
cccggacgcg atgtggctgt gggtgacgtc gatcgccggc gagttctggt tcgggttctc 1320
gtggctgctc gaccagctcc ccaagctgaa cccgatcaac cgcgtccccg acctcgccgt 1380
cctccgccgc cgcttcgacc acgccgacgg gacctcctcc ctcccggggc tggacatctt 1440
cgtcaccacc gccgacccga tcaaggagcc catcctgtcg acggcgaact ccatcctctc 1500
catcctcgcc gccgactacc ccgtcgaccg caacacctgc tacctctccg acgactctgg 1560
gatgctcctc acctacgagg ccatggcgga ggcggccaag ttcgcgacgc tgtgggtgcc 1620
cttctgccgg aagcacgcca tcgagccgcg cgggcctgag agctacttcg agctcaagtc 1680
ccacccctac atggggaggg cgcaggagga gttcgtcaac gaccgccgcc gcgtccgcaa 1740
ggagtacgac gacttcaagg ccaggatcaa cggcctcgag cacgacatca agcagaggtc 1800
cgactcctac aacgccgccg ccggcgtcaa ggacggcgag ccccgcgcca cctggatggc 1860
cgacgggtcg cagtgggagg gcacctggat cgagcagtcg gagaaccacc gcaagggcga 1920
ccacgccggc atcgtcctgg tgttgctgaa ccacccgagc cacgcacggc agctggggcc 1980
gccggcgagc gccgacaacc cgctggactt cagcggcgtg gacgtgcggc tgccgatgct 2040
ggtgtacgtc gcacgtgaga agcgccccgg gtgcaaccac cagaagaagg ccggcgccat 2100
gaacgcgctg acccgcgcct ccgccgtgct ctccaactcc cccttcatcc tcaacctcga 2160
ctgcgaccac tacatcaaca actcccaggc gctccgcgcc ggcatctgct tcatgctcgg 2220
ccgcgacagc gacaccgtcg cgttcgtcca gttcccgcag cgcttcgagg gcgtcgaccc 2280
caccgacctc tatgctaacc acaaccgtat cttcttcgac ggcacgctcc gtgccctcga 2340
cgggctgcag gggcctatct acgtcggcac cgggtgtctc ttccgccgca tcacgctgta 2400
cgggttcgag ccgccgagga tcaacgtcgg cggaccgtgc ttcccgaggc tcggtgggat 2460
gttcgccaag aacaggtacc agaagcctgg gttcgagatg accaagcctg gtgccaagcc 2520
ggtggcgccg ccgccggcgg cgacggtggc gaaggggaag cacgggttcc tgccgatgcc 2580
caagaaggcg tacggcaagt cggacgcgtt cgccgacacc atcccgcgcg cgtcgcaccc 2640
gtcgccgtac gcggcggagg cggcggtggc ggccgacgag gcggcgatcg cggaggccgt 2700
gatggtgacg gcggcggcgt acgagaagaa gaccgggtgg gggagcgaca tcgggtgggt 2760
gtacggcacg gtgacggagg acgtggtgac cggctaccgg atgcacatca aggggtggag 2820
gtcgcgctac tgctccatct acccgcacgc gttcatcggg acggcgccga tcaacctgac 2880
ggagaggctg ttccaggtgc tccggtggtc gacgggttcg ctggagatct tcttctcgag 2940
gaacaacccg ctgttcggga gcacgttcct gcacccgctg cagcgcgtgg cgtacatcaa 3000
catcaccacc tacccgttca cggcgctgtt cctcatcttc tacaccaccg tgccggcgct 3060
gtcgttcgtg acggggcact tcatcgtgca gaggccgacc accatgttct acgtctacct 3120
cgccatcgtg ctcgggacgc tgctcatcct cgccgtgctg gaggtgaagt gggcgggggt 3180
caccgtgttc gagtggttca ggaacgggca gttctggatg acggccagct gctccgccta 3240
cctcgccgcc gtgctgcagg tggtcaccaa ggtggtgttc cggcgggaca tctcgttcaa 3300
gctcacctcc aagctccccg ccggcgacga gaagaaggac ccctacgccg acctgtacgt 3360
ggtgcggtgg acgtggctca tgatcacccc catcatcatc atcctcgtca acatcatcgg 3420
ctccgccgtc gccttcgcca aggtgctcga cggcgagtgg acgcactggc tcaaggtcgc 3480
cggcggcgtg ttcttcaact tctgggtcct cttccacctc taccccttcg ccaagggcat 3540
cctcgggaag cacggcaaga cgccggtggt ggtgctcgtc tggtgggcct tcaccttcgt 3600
catcaccgcc gtgctctaca tcaacatccc ccacatccat ggccccggcc gccacggcgc 3660
cgcctcacca tcccacggcc accacagcgc ccatggcacc aagaagtacg acttcaccta 3720
cgcctggcca tga 3733
<210> 5
<211> 4845
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 5
acagattctt gctaccaaca acttcacaaa gtagtagtca accaaaacta tgctaaggaa 60
tcacctcact tccgcccatg accgtgagca cgactgttca aacagtttgt taatctctac 120
aaagaaggta cactttacct acacaacgcc actaacctga gttacccagc ccatgcaaaa 180
tagccacgtc ttgtgactta agggatttcg cgacaaggca tttcgaaagc ccacacaagg 240
acaccttatg aaaactggag gggtcccaca gaccaacaac aagttaggtc ccaaaccatg 300
ttgtgccagg aaaaatccaa ggggtcctcc ccaacaccac cccgacaaat ccacttgtcc 360
attggcatca agatttgcct gacctagcta attactcagc caggcatgtc acaattcacc 420
catgtggtca cacatgttag gttggagaaa ttctaaagga aaggaatcgg tccatatgag 480
caagaccgag aaaccatacc accagtactt ctaccgaaat acgagtttag taaactcatt 540
tgttttcaag gcacccgacc caggtgtgtc gggttttcca gggattttgt aaacccaagt 600
tttacccata gttgatcatt caaattttga ggagggtcat tggtatccgt acctgagggc 660
acgaatactg agacctagca ttgtagtcga ccaaggaggt taatgcagca attgtaggtg 720
gggcctgttg gttatattgc aaactgcggc caacatttca tgtgtaattt agagatgtgc 780
attttgagaa atgaaatact tagtttcaaa ttatgggctc aaataatgaa aggtgaccta 840
ccttgcttga tatcttgagc ttcttcctcg tattccgcgc actaggagat cttctggctc 900
cgaagctaca cgtggaacga gataactcaa caaaacgacc aaggaaaagc tcgtattagt 960
gagtactaag tgtgccactg aatagatctc gatttttgag gaattttaga agttgaacag 1020
agtcaatcga acagacagtt gaagagatat ggattttcta agattaattg attctctgta 1080
taaagaaaaa aagtattatt gaattaaatg gaaaaagaaa aaggaaaaag gggatggctt 1140
ctgctttttg ggctgaaggc ggcgtgtggc cagcgtgctg cgtgcggaca gcgagcgaac 1200
acacgacgga gcagctacga cgaacggggg accgagtgga ccggacgagg atgtggccta 1260
ggacgagtgc acaaggctag tggactcggt ccccgcgcgg tatcccgagt ggtccactgt 1320
ctgcaaacac gattcacata gagcgggcag acgcgggagc cgtcctaggt gcaccggaag 1380
caaatccgtc gcctgggtgg atttgagtga cacggcccac gtgtagcctc acagctctcc 1440
gtggtcagat gtgtaaaatt atcataatat gtgtttttca aatagttaaa taatatatat 1500
aggcaagtta tatgggtcaa taagcagtaa aaaggcttat gacatggtaa aattacttac 1560
accaatatgc cttactgtct gatatatttt acatgacaac aaagttacaa gtacgtcatt 1620
taaaaataca agttacttat caattgtagt gtatcaagta aatgacaaca aacctacaaa 1680
tttgctattt tgaaggaaca cttaaaaaaa tcaataggca agttatatag tcaataaact 1740
gcaagaaggc ttatgacatg gaaaaattac atacaccaat atgctttatt gtccggtata 1800
ttttacaaga caacaaagtt ataagtatgt catttaaaaa tacaagttac ttatcaattg 1860
tcaagtaaat gaaaacaaac ctacaaattt gttattttga aggaacacct aaattatcaa 1920
atatagcttg ctacgcaaaa tgacaacatg cttacaagtt attatcatct taaagttaga 1980
ctcatcttct caagcataag agctttatgg tgcaaaaaca aatataatga caaggcaaag 2040
atacatacat attaagagta tggacagaca tttctttaac aaactccatt tgtattactc 2100
caaaagcacc agaagtttgt catggctgag tcatgaaatg tatagttcaa tcttgcaaag 2160
ttgcctttcc ttttgtactg tgttttaaca ctacaagcca tatattgtct gtacgtgcaa 2220
caaactatat caccatgtat cccaagatgc ttttttattg ctatataaac tagcttggtc 2280
tgtctttgaa ctatggcgtc ggcggccggt gctgctgggt caaatgccag cctcgccgcc 2340
ccgctgctgg cgagccgcga gggaggtgcc aagaagccgg tcggtgccaa gggcaagcac 2400
tgggaggccg ccgacaagga cgagcggcgg gccgccaagg agagcggcgg cgaggacggc 2460
aggccgctgc tgttccggac gtacaaggtc aaaggcaccc tcctgcaccc atacagggcg 2520
ctaatcttca ttcgcttaat tgcggtcctt ctattcttcg tatggcgcat caagcacaac 2580
aaatccgaca tcatgtggtt ttggacaata tcagtcgtcg gggacgtatg gttcgggttc 2640
tcgtggctgc tcaaccaact cccaaagttc aaccctatca aaaccatacc tgatatggtc 2700
gcccttaggc gacaatacga tctttcagat gggacatcta cactcccggg catagatgtc 2760
tttgtcacca ccgctgaccc aatcgatgag ccgatactat acaccatgaa ttgtgtcctt 2820
tctatccttg cttctgacta tcctgtcgat aggtgtgcct gctatctctc agatgatagt 2880
ggagcattga ttcaatacga ggccttagtt gagaccgcaa agtttgctac tttgtgggtc 2940
ccattttgtc ggaagcattg cattgagcca agagccccag aaagctactt tgaaatagag 3000
gcaccgttgt acactggaac tgcaccagag gagttcaaga atgattatag tagtgtacat 3060
aaagagtatg atgagttcaa agagcgcttg gactcactat ccgatgctat ttccaagcgt 3120
tctgatgctt acaacagcat gaagactgag gaaggagatg caaaggccac gtggatggca 3180
aatgggacac aatggccagg atcatggatt gacacaacgg aaatccatag gaaaggacat 3240
catgccggaa ttgttaaggt tgtgttggac cattcgatcc gtgggcataa tcttggttca 3300
caagaaagca cccacaacct cagcttcgcc aacaccgatg agcgcctccc gatgcttgtg 3360
tatatctctc gtggaaagaa cccaagctat gaccacaaca agaaagctgg tgccttgaat 3420
gcgcaattgc gtgcctctgc actactctcc aacgcacaat tcatcatcaa ctttgactgc 3480
gaccactaca tcaacaactc tcaagcccta cgtgcagcta tgtgcttcat gcttgatcaa 3540
aggcaaggtg ataacactgc ctttgttcaa ttccctcaac gcttcgacaa tgttgatcca 3600
tcagaccgat atggaaacca caaccgtgtc ttctttgacg gcacaatgct cgccctcaat 3660
ggcctccaag ggccatctta ccttggcact ggttgcatgt tccgccgcat agcactttat 3720
ggcattgacc cacctgactg gagacatgac aacatcatag ttgatgataa aaagtttggt 3780
agctccatac ccttcctaga ttccgtatca aaagccataa accaagaaag gtctaccata 3840
cctccaccca ttagtgaaac attggtggct gagatggaaa gggttgtgtc ggcttcacac 3900
gataaagcca ctggttgggg caagggtgtt gggtacatat atgacatagc cacagaggat 3960
atcgtgactg gtttccgcat ccatgggcaa ggttggcgtt ccatgtattg tacaatggag 4020
cgtgacgcct tctgtggcat tgcaccaatc aacctaaccg agcgcctcca ccaaattgtg 4080
cgctggtccg gtggatcttt agagatgttc ttctcactaa ataacccact cataggtggt 4140
cgccggatcc aagcccttca gcgtgtctcc tacctcaaca tgacagtcta cccagtcaca 4200
tcactcttta tcctactcta tgctctcagc ccagtgatgt ggcttatccc tgatgaagta 4260
tacatccaga ggccattcac caaatatgtc gtgttccttc tcgtgatcat tctgatgatc 4320
catataattg ggtggctcga gataaaatgg gcgggggtca catggttgga ttactggagg 4380
aatgaacagt tctttatgat cgggtcgacg agtgcatacc cagcagccgt gctgcacatg 4440
gtggtgaatc tccttacaaa gaagggtata cacttcagag ttacttcgaa gcaaacaacg 4500
gcagacacca atgacaagtt tgctgacttg tatgacatgc gatgggtgcc aatgttaatc 4560
cctacaacag tggtgctgat tgccaatgtt ggtgcaatcg gtgtagccat gggtaaaacg 4620
atagtataca tgggagcatg gacaattgca cagaagacac atgccgcatt gggtctgctc 4680
ttcaacgtgt ggatcatggt cctgctctat ccgtttgcat tggcgatcat gggacggtgg 4740
gcaaagaggc cagtcatcct ggtggtcttg ttgccggttg cctttacaat agtttgcctt 4800
gtatatgttt ctgttcatat attacttctt agttttcttc cattt 4845
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
acagattctt gctaccaaca ac 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
agttcaaaga cagaccaagc tag 23
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttacag attcttgcta ccaacaac 48
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
agttcaaaga cagaccaagc tag 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ttagcaatgg cgccagcggt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tcatggccag gcgtaggtga 20
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ctagcttggt ctgtctttga actttagcaa tggcgccagc ggt 43
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ttgaacgatc ggggaaattc gagctctcat ggccaggcgt aggtga 46
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ctagcttggt ctgtctttga actttagcaa tggcgccagc ggt 43
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ttgaacgatc ggggaaattc gagctctcat ggccaggcgt aggtga 46
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ttagcaatgg cgccagcggt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
tcatggccag gcgtaggtga 20
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
agaacacggg ggactctaga ttagcaatgg cgccagcggt 40
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ttgaacgatc ggggaaattc gagctctcat ggccaggcgt aggtga 46
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
agaacacggg ggactctaga ttagcaatgg cgccagcggt 40
<210> 21
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
ttgaacgatc ggggaaattc gagctctcat ggccaggcgt aggtga 46
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
acagattctt gctaccaaca ac 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
agttcaaaga cagaccaagc tag 23
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttacag attcttgcta ccaacaac 48
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
agttcaaaga cagaccaagc tag 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
atggcgtcgg cggccggtgc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
aaatggaaga aaactaagaa 20
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
ctagcttggt ctgtctttga actatggcgt cggcggccgg tgc 43
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
ttgaacgatc ggggaaattc gagctcaaat ggaagaaaac taagaa 46
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
ctagcttggt ctgtctttga actatggcgt cggcggccgg tgc 43
<210> 31
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
ttgaacgatc ggggaaattc gagctcaaat ggaagaaaac taagaa 46
Claims (7)
1.一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，包括：将GluB-1启动子和CslF6基因进行重组，重组后的目标基因转入至受体植株中，得到转基因水稻；所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，所述受体植株为水稻中花11或和华占。
3.如权利要求1所述的籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别获取GluB-1启动子和CslF6基因；所述GluB-1启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述CslF6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)将步骤(1)的GluB-1启动子和CslF6基因连接至原始表达载体上，得到同时包含有GluB-1启动子和CslF6基因的重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化至感受态细胞进行培养，得到基因工程菌；
(4)将步骤(3)的基因工程菌转化至受体植株内，得到转基因植株；
(5)验证步骤(4)的转基因植株，测定转基因植株籽粒中的β-葡聚糖含量，得到籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻。
4.如权利要求3所述的籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，获取GluB-1启动子的方法为：
(A)提取水稻中花11幼苗叶片的基因组DNA；
(B)对基因组DNA进行一次PCR扩增，再对一次扩增后的产物进行二次PCR扩增，得到目标扩增产物；
所述一次PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述二次PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
5.如权利要求3所述的籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，获取CslF6基因的方法为：
(a)提取水稻叶片总RNA，反转录成单链cDNA；
(b)以单链cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，再对第一轮PCR扩增后的产物进行第二轮PCR扩增，得到目标扩增产物；
所述第一轮PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述第一轮PCR扩增所用引物如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
6.如权利要求3所述的籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，所述原始表达载体为B24_pCAMBIA-1300-35S-GFP-Nos。
7.如权利要求3所述的籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210724200.6A CN114990135B (zh) | 2022-06-23 | 2022-06-23 | 一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210724200.6A CN114990135B (zh) | 2022-06-23 | 2022-06-23 | 一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114990135A true CN114990135A (zh) | 2022-09-02 |
| CN114990135B CN114990135B (zh) | 2024-02-27 |
Family
ID=83037469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210724200.6A Active CN114990135B (zh) | 2022-06-23 | 2022-06-23 | 一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114990135B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116024232A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-04-28 | 浙江大学 | HvBGlu3基因在调控大麦籽粒β-葡聚糖含量中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105830184A (zh) * | 2013-08-06 | 2016-08-03 | 联邦科学与工业研究组织 | 具有高水平β-葡聚糖的小麦 |
-
2022
- 2022-06-23 CN CN202210724200.6A patent/CN114990135B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105830184A (zh) * | 2013-08-06 | 2016-08-03 | 联邦科学与工业研究组织 | 具有高水平β-葡聚糖的小麦 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| "Oryza sativa (japonica cultivar-group) seed storage glutelin GluB-1 gene, promoter region and 5\'UTR.", GENBANK: AY427569.1 * |
| "Oryza sativa CslF6 mRNA, complete cds", GENBANK: KP260643.1 * |
| "PREDICTED: Oryza sativa Japonica Group probable mixed-linked glucan synthase 6 (LOC4344719), mRNA", NCBI REFERENCE SEQUENCE: XM_015794846.2 * |
| MIGUEL E. VEGA-SANCHEZ等: "Loss of Cellulose Synthase-Like F6 Function Affects Mixed-Linkage Glucan Deposition, Cell Wall Mechanical Properties, and Defense Responses in Vegetative Tissues of Rice", PLANT PHYSIOLOGY * |
| 赵艳等: "水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达", 中国水稻科学 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116024232A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-04-28 | 浙江大学 | HvBGlu3基因在调控大麦籽粒β-葡聚糖含量中的应用 |
| CN116024232B (zh) * | 2022-12-08 | 2023-11-28 | 浙江大学 | HvBGlu3基因在调控大麦籽粒β-葡聚糖含量中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114990135B (zh) | 2024-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107567499A (zh) | 大豆u6核小rna基因启动子及其在植物小rna基因的组成型表达中的用途 | |
| CN111778265B (zh) | 玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用 | |
| CN114990135B (zh) | 一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法 | |
| CN104628839B (zh) | 一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN116640195B (zh) | 柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用 | |
| CN106749571B (zh) | 一种植物淀粉合成相关蛋白OsNPPR及其编码基因与应用 | |
| CN1265704A (zh) | 增加植物产量的方法 | |
| Li et al. | Rapid generation of selectable marker-free transgenic rice with three target genes by co-transformation and anther culture | |
| CN109776664A (zh) | 一种控制稻类小粒和半矮秆的基因及其应用 | |
| US20060156430A1 (en) | Novel cytochrome P450 monooxygenase | |
| CN115466747A (zh) | 糖基转移酶ZmKOB1基因及其在调控玉米雌穗结实性状或发育上的应用 | |
| CN111593059A (zh) | 一种调控番茄果实颜色的基因、snp、分子标记及应用 | |
| CN112194713B (zh) | 一种与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白fse5及其编码基因和应用 | |
| CN114752605B (zh) | 一种水稻OsOFP22s基因及利用其提高水稻粒长、千粒重和改良直链淀粉含量的方法 | |
| CN115927237B (zh) | 一种油菜海藻糖-6-磷酸合成酶基因在调控含油量与脂肪酸组成中的用途 | |
| CN113912689B (zh) | OsSGD1蛋白在提高水稻纹枯病抗病性中的应用 | |
| CN112899274B (zh) | miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用 | |
| NL2028064B1 (en) | Gene for controlling small grain and semi-dwarf of oryza sativa and application thereof | |
| CN114752608B (zh) | 一种高含量油菜素内酯番茄植株的培育方法 | |
| CN110734911B (zh) | miR159b在调控水稻白叶枯病抗性中的应用 | |
| CN116676329A (zh) | 一种油茶sqs基因的克隆及表达载体构建的方法 | |
| WO1999036551A1 (en) | Plant phosphoglucomutase homologs | |
| CN118086364A (zh) | OsFE4蛋白或其编码基因在调控淀粉合成的植物育种中的应用 | |
| CN116790620A (zh) | 水稻产量调控基因Os04t0686700、其编码蛋白、表达载体及其应用 | |
| CN117887755A (zh) | ZmGCH2蛋白及其编码基因在调控植物籽粒叶酸含量中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |