CN114989980B - 多层骨-软骨复合组织培养装置、制备方法及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多层骨‑软骨复合组织培养装置、制备方法及培养方法，使得种子细胞的空间分布均匀，支架内部物质容易交换。所述培养装置包括本体，所述本体中设有位于上部的软骨培养层和位于下部的骨培养层；所述软骨培养层包括第一纵向通孔层、第一横向通孔层、上层诱导液管道，所述第一横向通孔层和第一纵向通孔层上下布设；所述骨培养层包括第二纵向通孔层、第二横向通孔层、下层诱导液管道，所述第二横向通孔层和第二纵向通孔层上下布设；所述上层诱导液管道与第一横向通孔层的两端连通，下层诱导液管道与第二横向通孔层的两端连通。
Description
技术领域
本发明涉及3D打印细胞培养和生物医疗器械领域，尤其涉及一种多层骨-软骨复合组织培养装置、制备方法及培养方法。
背景技术
关节软骨在外伤或炎症因子刺激下一旦发生损伤，常常难以进行有效的自身修复，最终发展为骨关节炎。近年来，通过软骨组织工程方法修复关节软骨损伤已展现出良好的应用前景。通过应用复层支架构建骨-软骨复合组织块修复骨-软骨损伤已成为当前的研究热点和难点。尽管应用复层支架构建骨-软骨复合组织块已经取得可喜的结果，但在该领域仍然存在诸多热点问题亟待解决。
种子细胞在支架材料上的接种和培养是体外构建骨-软骨复合组织块的基础。然而，在通过常规构建方法接种种子细胞时，种子细胞在支架上的空间分布并不均匀，往往集中在支架的表层；而支架中心区域的细胞密度较低。虽然3D生物打印技术可以控制种子细胞在空间上的分布并且展现出良好的细胞存活率，但种子细胞在支架表层和中心区域的生长状况仍然存在差异。此外，常规构建模式是将接种细胞的支架直接浸泡在培养液中进行体外培养，支架中心区域的细胞往往难以得到充分的营养物质供给，进行物质交换困难，最终导致支架中心区域的细胞发生死亡。
传统复层支架的构建是一种“叠加”模式，在研究和应用过程中其缺点也逐渐突显。特别是在体外构建骨-软骨复合组织块时，往往需要在复层支架的相应层次中接种不同类型的种子细胞，或对干细胞分别进行成软骨和成骨分化诱导。
应用复层支架构建骨-软骨复合组织的另一个难点问题是再生骨与软骨组织的交界面整合程度低。如何提高交界面的整合程度是目前应用组织工程方法构建骨-软骨复合组织所面临的重大挑战。关节软骨的天然结构可主要分为三个区域，分别为软骨层、软骨钙化层和骨层。不同区域的组织结构之间逐渐过渡，从而能够维持物理结构的连续性和生物力学的稳定性。相比之下，既往研究所报道的骨-软骨组织工程支架均是在某一层次构建完成的基础上进行另一层次的简单添加，这就使得构建组织的不同层次之间存在明显的界限，物理结构的连续性较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种多层骨-软骨复合组织培养装置、制备方法及培养方法，解决了骨-软骨复合组织构建中不同特性的细胞或组织进行共同培养的技术难题。
为解决上述技术问题，本发明采用以下的技术方案：
第一方面，本发明实施例提供一种多层骨-软骨复合组织培养装置，所述装置包括本体，所述本体中设有位于上部的软骨培养层和位于下部的骨培养层；所述软骨培养层包括第一纵向通孔层、第一横向通孔层、上层诱导液管道，所述第一横向通孔层和第一纵向通孔层上下布设；所述骨培养层包括第二纵向通孔层、第二横向通孔层、下层诱导液管道，所述第二横向通孔层和第二纵向通孔层上下布设；所述上层诱导液管道与第一横向通孔层的两端连通，下层诱导液管道与第二横向通孔层的两端连通。
作为优选例，所述软骨培养层中，第一横向通孔层和第一纵向通孔层交替布设；所述骨培养层中，第二横向通孔层和第二纵向通孔层交替布设。
作为优选例，所述第一横向通孔层包括平行布设的第一横向通孔；第一纵向通孔层包括平行布设的第一纵向通孔；第一横向通孔和第一纵向通孔垂直布设；所述第二横向通孔层包括平行布设的第二横向通孔；第二纵向通孔层包括平行布设的第二纵向通孔；第二横向通孔和第二纵向通孔垂直布设；第二横向通孔和第一横向通孔平行布设，第二纵向通孔和第一纵向通孔平行布设。
作为优选例，所述第二横向通孔、第二纵向通孔、第一横向通孔、第一纵向通孔的孔径均分别为200～500微米，轴线位于同一水平面上的相邻第一横向通孔的间距、轴线位于同一水平面上的相邻第一纵向通孔的间距、轴线位于同一水平面上的相邻第二横向通孔的间距、轴线位于同一水平面上的相邻第二纵向通孔的间距均分别为200～800微米；所述软骨培养层中，相邻第一纵向通孔层和第一横向通孔层的间距为500～2000微米；所述骨培养层中，相邻第二横向通孔层和第二纵向通孔层的间距为500～2000微米。
作为优选例，所述本体由生物相容性可降解多孔材料制成，孔隙率为60～95％，孔隙的孔径为0.1～100微米；在35～40℃温度范围内，降解周期为4～8周。
第二方面，本发明实施例提供一种多层骨-软骨复合组织培养装置的制作方法，该方法包括:
步骤10)将NN-2甲基吡咯烷酮溶解在聚碳酸酯中，配制成质量浓度为15～25％混合溶液；在混合溶液中加入可溶于水的矿物盐，制成浆料；
步骤20)将所述浆料加热至60～65℃；然后在光滑的平面上均匀平铺一层所述浆料，等待所述浆料冷却之后，形成一均匀的隔离层；
步骤30)在所述隔离层上利用3D打印设备按照预设的几何结构，将明胶打印生成互相平行排列的横向明胶条，利用所述浆料填补所述横向明胶条之间的孔隙；
旋转隔离层90度，利用3D打印设备按照预设的几何结构，将明胶打印生成互相平行排列的纵向明胶条，用所述浆料填补所述纵向明胶条之间的孔隙；
步骤40)重复步骤30)，直至按照预设的几何结构，完成培养装置的坯体制作；
步骤50)将所述坯体置于37～40℃的质量浓度为50～55％乙醇水溶液中，并保温，清除所述横向明胶条、纵向明胶条和所述矿物盐，取出干燥后，制得培养装置。
作为优选例，所述步骤10)中，所述的矿物盐的颗粒粒径不超过20μm，矿物盐在浆料中的体积比为5～20％；所述步骤20)中，隔离层的厚度为800～1200μm；横向明胶条的直径为200～500μm，横向明胶条的水平间距为200～800μm；纵向明胶条的直径为200～500μm，纵向明胶条的水平间距为200～800μm；所述步骤50)中，保温时间为6小时以上。
第三方面，本发明实施例提供一种多层骨-软骨复合组织培养装置的培养方法，包括：
步骤10)将所述第一横向通孔层连接上层泵，用于注入第一诱导液；将第二横向通孔层连接下层泵，用于注入第二诱导液；
将向所述第一纵向通孔注入的含有培养细胞的混合溶液置于细胞培养箱内静置；
步骤20)向第一纵向通孔层和第二纵向通孔分别注入静置后的含有培养细胞的混合溶液；
步骤30)开启上层泵，将第一诱导液通过上层诱导液管道通入第一横向通孔层中；
开启下层泵，将第二诱导液通过下层诱导液管道通入第二横向通孔层中；
步骤40)当上层泵和/或下层泵连续运行1～5分钟后，待第一诱导液均匀渗透后，关闭上层泵；待第二诱导液均匀渗透后，关闭下层泵；
步骤50)间隔1～5小时，返回步骤30)，直至2～4周后，停止运行上层泵和下层泵，允许细胞在无诱导液情况下增殖2～4周，获得多层骨-软骨复合组织。
作为优选例，所述的多层骨-软骨复合组织培养装置的培养方法，还包括：调控上层泵和/或下层泵的流速。
作为优选例，所述步骤10)中，静置时间为2～4小时；所述第一诱导液为成软骨诱导液；所述第二诱导液为成骨诱导液。
有益效果：与现有技术相比，本发明的多层骨-软骨复合组织培养装置、制备方法及培养方法，解决了骨-软骨复合组织构建中不同特性的细胞或组织进行共同培养的技术难题。本申请中，同时向第一横向通孔层、第二横向通孔层中注入不同的诱导液。诱导液通过渗透进入本体的上下两层结构中，从而实现不同特性的细胞或组织的共同培养。本实施例中，位于本体上部的软骨培养层中，实现软骨细胞或组织的培养；位于本体下部的骨培养层中，实现骨细胞或组织的培养。
附图说明
图1是本发明实施例的装配示意图；
图2是本发明实施例的结构图；
图3是本发明实施例中本体的结构图；
图4是本发明实施例中本体的透视图。
附图标记为：第一纵向通孔层1、第一横向通孔层2、上层诱导液管道3、下层诱导液管道4、管道接口5、第二纵向通孔层6、第二横向通孔层7。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明实施例的技术方案进行详细的说明。
如图1至图4所示，本发明实施例的一种多层骨-软骨复合组织培养装置，包括本体。本体中设有位于上部的软骨培养层和位于下部的骨培养层。软骨培养层和骨培养层上下布设。软骨培养层包括第一纵向通孔层1、第一横向通孔层2、上层诱导液管道3，第一横向通孔层2和第一纵向通孔层1上下布设。骨培养层包括第二纵向通孔层6、第二横向通孔层7、下层诱导液管道4，第二横向通孔层7和第二纵向通孔层6上下布设。上层诱导液管道3与第一横向通孔层2的两端连通，下层诱导液管道4与第二横向通孔层6的两端连通。
本发明实施例的一种多层骨-软骨复合组织培养装置，在本体结构内部有横向和纵向两个方向互相垂直排列的细小通孔，即第一纵向通孔层1、第一横向通孔层2、第二纵向通孔层6和第二横向通孔层7，互不相通。两个方向的通孔交错排列，互相垂直，而且互相之间不直接连通，确保诱导液仅能通过渗透实现物质交换形成浓度梯度。
纵向通孔内部为细胞培养区域，同外部培养液接触。横向通孔内部允许带有诱导成分的培养液流通，两端设置管道接口5，可以同液体循环泵连接。第一横向通孔层2和第二横向通孔层7，上下分布，互相隔离，可以各自流通两种不同培养液。诱导液通过多孔材料内部的微小孔洞渗透到细胞培养管道，利用多孔材料的低渗透性实现诱导液浓度的梯度性分布。
横向通孔用于流通两种不同成分或浓度的诱导液。纵向通孔用于种植培养细胞。上层诱导液管道3和下层诱导液管道4分别连接管道接口5，同外部装置连接，用于输送诱导液。
优选的，所述软骨培养层中，第一横向通孔层2和第一纵向通孔层1交替布设。布设多层第一横向通孔层2和第一纵向通孔层1，且两者交替布设，有利于第一横向通孔层2中的横向通孔中的物质同第一纵向通孔层1中的纵向通孔中的液体进行渗透和交换。优选的，骨培养层中，第二横向通孔层7和第二纵向通孔层6交替布设。布设多层第二横向通孔层7和第二纵向通孔层6且两者交替布设，有利于第二横向通孔层7中的横向通孔中的物质同第二纵向通孔层6中的纵向通孔中的液体进行渗透和交换，并且保持单个通孔中的浓度均匀。
优选的，第一横向通孔层2包括平行布设的第一横向通孔；第一纵向通孔层1包括平行布设的第一纵向通孔；第一横向通孔和第一纵向通孔垂直布设。每个第一横向通孔层2包括多个第一横向通孔，每个第一纵向通孔层1包括多个第一纵向通孔。这可以减小通孔直径，提高交换物质浓度梯度的分辨率。
第二横向通孔层7包括平行布设的第二横向通孔；第二纵向通孔层6包括平行布设的第二纵向通孔；第二横向通孔和第二纵向通孔垂直布设；第二横向通孔和第一横向通孔平行布设，第二纵向通孔和第一纵向通孔平行布设。每个第二横向通孔层7包括多个第二横向通孔，每个第二纵向通孔层6包括多个第二纵向通孔。该结构允许液体均匀流过同一通孔层中的不同通孔。
优选的，第二横向通孔、第二纵向通孔、第一横向通孔、第一纵向通孔的孔径均分别为200～500微米。该范围大小的孔径允许细胞流过，有利于布置种子细胞。轴线位于同一水平面上的相邻第一横向通孔的间距、轴线位于同一水平面上的相邻第一纵向通孔的间距、轴线位于同一水平面上的相邻第二横向通孔的间距、轴线位于同一水平面上的相邻第二纵向通孔的间距均分别为200～800微米。该范围大小的间距，在不破坏结构的情况下保证一定浓度梯度。软骨培养层中，相邻第一纵向通孔层1和第一横向通孔层2的间距为500～2000微米。该范围大小的间距，可以控制调节物质的扩散梯度。所述骨培养层中，相邻第二横向通孔层7和第二纵向通孔层6的间距为500～2000微米，该范围大小的间距，可以控制调节物质的扩散梯度。
优选的，本体由生物相容性可降解多孔材料制成，例如：聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸(PLA)或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。本体的孔隙率为60～95％，孔隙的孔径为0.1～100微米。这可以保持介质渗透性以及提供细胞培养的表面粗糙度。在35～40℃温度范围内，本体降解周期为4～8周。在35～40℃温度范围内培养细胞。本体形成的支架结构，在早期提供种子细胞生长和工程组织形成所需的3D环境，最终需被构建的工程组织替代。
上述的多层骨-软骨复合组织培养装置的制作方法，包括:
步骤10)将NN-2甲基吡咯烷酮溶解在聚碳酸酯中，配制成质量浓度为15～25％混合溶液；在混合溶液中加入可溶于水的矿物盐，制成浆料。所述的矿物盐的颗粒粒径不超过20μm，矿物盐在浆料中的体积比为5～20％。优选的，矿物盐采用氯化钠或氯化钾等。
步骤20)将所述浆料加热至60～65℃，然后在光滑的平面上均匀平铺一层所述浆料，等待所述浆料冷却之后，形成一均匀的隔离层。
优选的，所述步骤20)中，隔离层的厚度为800～1200μm；横向明胶条的直径为200～500μm，横向明胶条的水平间距为200～800μm。
步骤30)在所述隔离层上利用3D打印设备按照预设的几何结构，将明胶打印生成互相平行排列的横向明胶条，利用所述浆料填补所述横向明胶条之间的孔隙。
旋转隔离层90度，利用3D打印设备按照预设的几何结构，将明胶打印生成互相平行排列的纵向明胶条，用所述浆料填补所述纵向明胶条之间的孔隙。
纵向明胶条的直径为200～500μm，纵向明胶条的水平间距为200～800μm。
步骤40)重复步骤30)，直至按照预设的几何结构，完成培养装置的坯体制作。在第一横向通孔和第二横向通孔的两端，使用PLA进行打印，制备用于连接管道的管道接口5，制成培养装置的坯体。这样，坯体中，呈层布设的横向明胶条和呈层布设的纵向明胶条交替间隔布设。
上述步骤，采用分层配置材料。
步骤50)将所述坯体置于37～40℃的质量浓度为50～55％乙醇水溶液中，并保温。优选的，保温时间为6小时以上。清除所述横向明胶条、纵向明胶条和所述矿物盐，取出干燥后，制得培养装置。清除所述横向明胶条、纵向明胶条和所述矿物盐可采用常规的溶解法进行。
上述制备方法采用生物相容性材料，通过3D打印技术制备细胞培养支架结构和复层细胞培养支架。将明胶和NN-2甲基吡咯烷酮溶解在聚碳酸酯(PC)中，在加入可溶于水的矿物盐，制备出带有细小液体流道的多孔生物相容材料。利用可溶矿物盐洗脱后，产生的微小孔洞制备生物相容的多孔材料，作为细胞培养过程中诱导液的扩散通路。由于多孔材料的孔隙尺寸为微米级别，因此诱导液在多孔材料中渗透的过程中会形成浓度梯度。利用此浓度梯度，可以诱导细胞分化的过程中产生混合型交界面，实现骨-软骨高整合程度的分界面。将明胶打印占位液体传输通路，洗脱后的通路模拟血管以及作为细胞培养表面。
将明胶打印在预设的通孔位置，其余细胞培养装置结构由聚碳酸酯组成。当培养装置成型之后，再加热使明胶成为液态，然后通过清洗的方式将明胶及矿物盐从培养支架中移除，剩下的孔洞即为预设的通孔，即第一纵向通孔、第二纵向通孔、第一横向通孔、第二横向通孔。
上述多层骨-软骨复合组织培养装置的培养方法，包括：
步骤10)将第一横向通孔层2连接上层泵，用于注入第一诱导液。将第二横向通孔层7连接下层泵，用于注入第二诱导液。
将向第一纵向通孔层1和第二纵向通孔层6注入的含有培养细胞的混合溶液置于细胞培养箱内静置。优选的，培养细胞为间充质干细胞；混合溶液为重悬间充质干细胞所用的液体，如DMEM/F12。所述步骤10)中，静置时间为2～4小时。
步骤20)向第一纵向通孔层1和第二纵向通孔6分别注入静置后的含有培养细胞的混合溶液。
其中，可采用针管一次性向第一纵向通孔层1和第二纵向通孔6中分别注入静置后的含有培养细胞的混合溶液。
步骤30)开启上层泵，将第一诱导液通过上层诱导液管道3通入第一横向通孔层2中；开启下层泵，将第二诱导液通过下层诱导液管道4通入第二横向通孔层7中。
在步骤30)中，第一诱导液通过上层诱导液管道3通入第一横向通孔层2中，之后第一诱导液通过多孔材料的孔隙渗透进入第一纵向通孔层1中的第一纵向通孔中。含有培养细胞的混合溶液在第一诱导液作用下生长及分化。
第二诱导液通过下层诱导液管道4通入第二横向通孔层7中，之后第二诱导液通过多孔材料的孔隙渗透进入第二纵向通孔层6中的第二纵向通孔中。含有培养细胞的混合溶液在第二诱导液作用下生长及分化。
步骤40)当上层泵和/或下层泵连续运行1～5分钟后，待第一诱导液稳定渗透后，关闭上层泵；待第二诱导液稳定渗透后，关闭下层泵。
第一诱导液稳定渗透是指第一诱导液从上向下流动，形成稳定浓度梯度，并在单根孔洞中均匀分布。第二诱导液稳定渗透是指第二诱导液从下向上流动，形成稳定浓度梯度，并在单根孔洞中均匀分布。
步骤50)间隔1～5小时，返回步骤30)，直至2～4周后停止运行上层泵和下层泵，允许细胞在无诱导液情况下增殖2～4周，获得多层骨-软骨复合组织。
步骤50)中，多次返回步骤30)，直至2～4周后停止运行上层泵和下层泵。在诱导液逐渐被消耗或者稀释后，再次注入诱导液，保持浓度梯度稳定。软骨培养层中的含有培养细胞的混合溶液在第一诱导液的作用下生长分化。骨培养层中的含有培养细胞的混合溶液在第二诱导液的作用下生长分化。当停止运行上层泵和下层泵后，细胞在无诱导液情况下增殖2～4周，获得多层骨-软骨复合组织。
优选的，上述培养方法还包括：调控上层泵和/或下层泵的流速。诱导液在多孔材料中渗透，其渗透速度同泵送的流速相关，流速越大，渗透速度越大，占据多孔材料孔隙的概率越大。由于液体的不可压缩性，渗透速度较高的诱导液会优先占据多孔材料的孔隙，从而在局部形成更高的浓度。通过调节所述上层泵或下层泵的流速，可以调节所述诱导液在所述多孔材料中的浓度分布。流速较高侧的诱导液在其流动的横向通孔中的浓度较高，流速较低侧的诱导液在其流动的横向通孔中的浓度较低。在所述第一纵向通孔和第二纵向通孔之间的多孔材料内部，第一诱导液或第二诱导液的浓度分布呈梯度变化。
优选的，所述第一诱导液为成软骨诱导液；所述第二诱导液为成骨诱导液。成软骨诱导液可以市购，例如，采用赛业生物科技有限公司(cyagen)生产的成人骨髓间质干细胞成软骨诱导分化培养基HUXMX-90041，也可以自行制作。例如，将以下物质混合后，制成成软骨诱导液，制成成软骨诱导液后，各物质的参数为：10ng/mL的TGF-β1、100ng/mL的IGF-1、50μg/mL的抗坏血酸2-磷酸、40μg/mL的L-脯氨酸、I TS(胰岛素6.25μg/mL、转铁蛋白6.25μg/mL、硒酸6.25ng/mL)、质量浓度为10％的FBS、100μg/mL的丙酮酸、300μg/mL的L-谷氨酰胺。
成骨诱导液可以市购，例如，采用赛业生物科技有限公司(cyagen)生产的成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基HUXMX-90021，也可以自行制作。例如，将以下物质混合后，制成成骨诱导液，制成成骨诱导液后，各物质的参数为：0.1*10-6mo l/L的地塞米松、10*10-3mo l/L的β-甘油磷酸、50*10-6mo l/L的抗坏血酸2-磷酸、质量浓度为10％的胎牛血清、质量浓度为1％的青霉素或链霉素。
通过外部管路控制横向通孔中的流体介质。在同一培养装置上可以同时注入两种不同诱导介质，实现培养装置内部两种介质的梯度性浓度变化。
第一纵向通孔内的软骨细胞受到邻近多孔材料孔隙内的诱导液影响，产生不同的细胞分化，其分化方向和分化速度受到所述第一诱导液和第二诱导液两种诱导液的共同作用，且同诱导液的浓度有关。同样，第二纵向通孔内的骨细胞受到邻近多孔材料孔隙内的诱导液影响，产生不同的细胞分化，其分化方向和分化速度受到所述第一诱导液和第二诱导液两种诱导液的共同作用，且同诱导液的浓度有关。
本发明的装置及其培养方法，能够在有效负载多能干细胞的同时，允许在同一培养装置的不同层次结构中分别流通两种不同成分的诱导培养液，进而实现同时对多能干细胞进行成骨和成软骨方向的诱导分化。在科研过程中，应用该设计的培养装置能够在体外模拟人体内部不同微环境对干细胞生长及分化的影响，进行类器官构建，有效拓展针对骨及软骨组织发育、组织工程构建等方面的科研方法。
本申请中，第一诱导液从上向下渗透，第一诱导液不仅存在于位于本体上部的软骨培养层，还存在于位于本体下部的骨培养层中。在本体中，第一诱导液的浓度从上向下，逐渐减小。第二诱导液从下向上渗透，第二诱导液不仅存在于位于本体下部的骨培养层，还存在于位于本体上部的软骨培养层中。在本体中，第二诱导液的浓度从下向上，逐渐减小。在骨培养层和软骨培养层交界面处，形成浓度均匀变化的梯度，对不同层之间的干细胞分化进行不同程度的干预和诱导，从而实现了骨-软骨复合组织的交界面整合程度高。本申请采用浓度梯度变化，诱导干细胞按照浓度梯度分化，形成更厚的过度界面，提高界面整合度。
本申请本体由多孔材料材料制成，通过利用多孔材料的渗透性以及均匀分布的横向通孔，来解决种子细胞的空间分布不均，内部物质交换困难的难题。第一横向通孔层、第二横向通孔层、第一纵向通孔层、第二纵向通孔层均匀分布在本体中，且第一横向通孔层和第一纵向通孔层交替布设，第二横向通孔层和第二纵向通孔层交替布设，向第一横向通孔和第二横向通孔注入诱导液，向第一纵向通孔和第二纵向通孔注入含有培养细胞的混合溶液。这样，种子细胞不仅分布在本体的边缘，还分布在本体的内部，且可实现均匀分布。诱导液通过渗透进入第一纵向通孔和第二纵向通孔中，实现物质交换。
本申请采用多孔材料渗透性形成浓度梯度实现不同特性的细胞或组织共培养。本申请中，同时向第一横向通孔层、第二横向通孔层中注入不同的诱导液。本体(相当于培养支架)由多孔材料制成，诱导液通过渗透进入本体的上下两层结构中，从而实现不同特性的细胞或组织的共同培养。本实施例中，位于本体上部的软骨培养层中，实现软骨细胞或组织的培养；位于本体下部的骨培养层中，实现骨细胞或组织的培养。
Claims (3)
1.一种多层骨-软骨复合组织培养装置的培养方法，其特征在于：该方法包括：
步骤10：将第一横向通孔层（2）连接上层泵，用于注入第一诱导液；将第二横向通孔层（7）连接下层泵，用于注入第二诱导液 ；
将向第一纵向通孔层（1）注入的含有培养细胞的混合溶液置于细胞培养箱内静置；
步骤20：向第一纵向通孔层（1）和第二纵向通孔层（6）分别注入静置后的含有培养细胞的混合溶液；
步骤30：开启上层泵，将第一诱导液通过上层诱导液管道（3）通入第一横向通孔层（2）中；
开启下层泵，将第二诱导液通过下层诱导液管道（4）通入第二横向通孔层（7）中；
步骤40：当上层泵和/或下层泵连续运行1～5分钟后，待第一诱导液均匀渗透后，关闭上层泵；待第二诱导液均匀渗透后，关闭下层泵；
步骤50：间隔1～5小时，返回步骤30，直至2～4周后，停止运行上层泵和下层泵，允许细胞在无诱导液情况下增殖2～4周，获得多层骨-软骨复合组织；
所述第一诱导液为成软骨诱导液；所述第二诱导液为成骨诱导液；
所述多层骨-软骨复合组织培养装置包括本体，所述本体中设有位于上部的软骨培养层和位于下部的骨培养层；所述软骨培养层包括第一纵向通孔层（1）、第一横向通孔层（2）、上层诱导液管道（3），所述第一横向通孔层（2）和第一纵向通孔层（1）上下布设；所述骨培养层包括第二纵向通孔层（6）、第二横向通孔层（7）、下层诱导液管道（4），所述第二横向通孔层（7）和第二纵向通孔层（6）上下布设；所述上层诱导液管道（3）与第一横向通孔层（2）的两端连通，下层诱导液管道（4）与第二横向通孔层（7）的两端连通。
2.根据权利要求1所述的多层骨-软骨复合组织培养装置的培养方法，其特征在于：还包括：调控上层泵和/或下层泵的流速。
3.根据权利要求1所述的多层骨-软骨复合组织培养装置的培养方法，其特征在于：所述步骤10中，静置时间为2～4小时。
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2022
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