CN114989450A - 一种提高木质素抗氧化活性的方法 - Google Patents

一种提高木质素抗氧化活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高木质素抗氧化活性的方法，将工业木质素溶于N,N‑二甲基甲酰胺，得到木质素溶液；向获得的木质素溶液中加入碘代环己烷，在温和条件下反应；反应完成后，经洗涤去除杂质，获得纯化的木质素产品。本发明以硫酸盐木质素为原料，通过脱甲基和分子碎片化获得具有高酚羟基含量、低分子量和均一的邻苯二酚型木质素，抗氧化活性提升显著，且优于商业抗氧化剂。采用“一步法”反应，制备工艺简单，反应条件温和，可实施性强。

Description

一种提高木质素抗氧化活性的方法
技术领域
本发明属于木质素制备领域，涉及制浆或生物炼制副产物木质素高值化利用，特别是一种提高木质素抗氧化活性的方法。
背景技术
抗氧化剂是可以捕获或清除自由基以保护材料或生物组织免受外来伤害的一类物质，目前已广泛应用于食品、医药等领域。然而，传统的抗氧化剂主要通过化学合成或从医用植物中提取获得，工艺复杂、成本高、能耗高、产品收率低，且部分抗氧化剂甚至有毒，生物相容性差。此外，常见的抗氧化剂通常稳定性差，导致其在长时间内对材料或生物组织的保护效果不佳。因此，迫切需要开发一种具有良好生物相容性、含量丰富、成本低廉、结构稳定的绿色替代品。
木质素是自然界中储量最大的可再生芳香族生物质资源，其大分子主要是由愈创木基、紫丁香基和对羟基苯基通过醚键和碳-碳键连接聚合而成，具有可生物降解、环境友好、价格低廉等优点。木质素结构中含有丰富的酚羟基、甲氧基、羧基等官能团。其中酚羟基可通过提供氢原子使氧化增长反应终止，缓解材料的自氧化。因此，木质素是一种天然的抗氧化剂，在食品、化妆品、生物医药等领域表现出巨大潜力。然而，常见的工业木质素，如硫酸盐木质素、碱木质素、有机溶剂木质素等，其抗氧化活性远未达到商业抗氧化剂的要求。而目前提高木质素抗氧化活性的方法如漆酶生物处理、离子液体、酚化等常面临木质素抗氧化活性提升不明显或制备工艺复杂、成本高、生产过程易引入有毒物质等问题，极大地限制了木质素的进一步应用。因此，开发一种简单高效的方法来显著提高木质素的抗氧化活性以替代商业抗氧化剂仍然面临许多挑战。
提升木质素抗氧化活性的关键在于增加木质素酚羟基含量，降低木质素分子量和多分散性。通过简单、高效的木质素改性技术将显著提升木质素在食品、化妆品、生物医药等领域的应用，达到商业抗氧化剂的要求。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以显著提升木质素的抗氧化活性的方法，使木质素达到商业抗氧化剂的要求，促进木质素在食品、化妆品、生物医药等领域的应用。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种提高木质素抗氧化活性的方法，包括如下步骤：
(1)将工业木质素溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到木质素溶液；
(2)向步骤(1)获得的木质素溶液中加入碘代环己烷，在温和条件下反应；
(3)反应完成后，经洗涤去除杂质，获得纯化的木质素产品。
具体地，步骤(1)中，所述工业木质素为硫酸盐制浆厂产生的针叶材硫酸盐木质素。
优选地，步骤(1)中，得到的木质素溶液中木质素浓度为40～50mg/mL。
优选地，步骤(2)中，碘代环己烷添加量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:3～1:5；木质素通过碘代环己烷温和的脱甲基作用和分子碎片化反应获得酚羟基含量高、分子量低且均一的邻苯二酚型木质素。木质素的部分甲氧基转变为酚羟基；木质素大分子连接键断裂，分子量减小，均一性提高。同时保留残余甲氧基在木质素抗氧化活性中的积极作用。
优选地，步骤(2)中，反应条件为在常压、温度100℃～120℃下，反应2～12h。
优选地，骤(3)中，洗涤采用依次经正己烷、饱和焦亚硫酸钠和去离子水洗涤；洗涤过程脱除反应过程中产生的小分子物质和杂质，获得分子量均一的木质素产品。
进一步地，步骤(3)中，获得的木质素产品为邻苯二酚型木质素，具有更高的自由基清除能力，且优于常见的商业抗氧化剂，其自由基清除指数(EC50值的倒数)高达2000mL/mg，且远远优于常见的商业抗氧化剂(<500mL/mg)，有望作为一种绿色新型的抗氧化剂。
有益效果：
(1)本发明以硫酸盐木质素为原料，通过脱甲基和分子碎片化获得具有高酚羟基含量、低分子量和均一的邻苯二酚型木质素，抗氧化活性提升显著，且优于商业抗氧化剂。
(2)本发明采用“一步法”反应，制备工艺简单，反应条件温和，可实施性强。
(3)木质素源于绿色植物，原料来源丰富，成本低廉，可生物降解，无毒无害，生物相容性好，有益于环境保护，且在生物医药等领域具有潜在应用价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为实施例1硫酸盐木质素和最优条件下邻苯二酚型木质素的甲氧基含量。
图2为实施例1中硫酸盐木质素和最优条件下制备的邻苯二酚型木质素分子量和多分散性。
图3为实施例2制备的不同浓度的硫酸盐木质素(KL)的自由基清除能力。
图4为实施例3制备的不同浓度的邻苯二酚型木质素(DKL)的自由基清除能力。
图5为实施例3制备的不同邻苯二酚型木质素在相同浓度下(0.003mg/mL)的自由基清除能力。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
实施例1
(1)木质素同步脱甲基化和分子碎片化
将500mg硫酸盐木质素溶于约12mL N,N-二甲基甲酰胺，用3mL碘代环己烷与其进行反应，反应时间分别为2、5、8、10、12h，温度为100℃，反应完成后，用正己烷、饱和偏重亚硫酸钠溶液进行洗涤，最后用去离子水洗涤呈中性即可。
(2)31P NMR表征木质素酚羟基、脂肪族羟基和羧基含量
将干燥的木质素样品(约40mg)充分溶解在500μL的无水吡啶/氘代氯仿溶液(1.6:1，v/v)中。然后，加入200μL n-羟基-5-降冰片烯-2,3-二酰亚胺(e-NHI，9.23mg/mL)和50μL乙酰丙酮铬溶液(弛缓剂，5.6mg/mL)。使用无水吡啶/氘代氯仿溶液制备上述内标溶液和弛豫剂。最后混合液中加入100μL的磷化试剂(2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环)，随后混合均匀转移到核磁共振管，然后进行31P NMR分析。
(3)1H NMR表征木质素甲氧基
分别称取约100mg硫酸盐木质素和最优条件下反应获得的邻苯二酚型木质素，加入1–2mL乙酸酐和吡啶(1:1,V/V)，放置一夜。再加入25mL乙醇，30min后旋蒸，反复用乙醇旋蒸洗涤5–10次。然后加入1-2mL三氯甲烷溶解木质素，把溶出的木质素逐滴滴加到100mL乙醚中，离心分离获得乙酰化木质素。称取20mg乙酰化木质素溶解于0.5mL DMSO-d6，用于1HNMR检测。甲氧基含量采用以下公式计算：
-OCH3(％)＝28.28436-19.750047X
其中，X为氢谱中芳香区域氢信号(6.4–7.1ppm)的积分值与甲氧基区域(3.5–4.1ppm)积分值的比值。
(4)木质素的分子量和多分散性
凝胶渗透色谱法(GPC)测定：木质素样品浓度按照2.5mg/5mL配置，其中标样和木质素样品都加稀释后的对甲酚溶液一滴(稀释比例为半滴对甲酚加到10mL四氢呋喃)。将标样置于流动相中，室温下静置12～24h。流动相使用色谱级溶剂和超纯水来配制，经0.45um滤膜过滤后，超声脱气。后采用LC solution程序进行操作。
(5)木质素的自由基清除指数
自由基清除指数为清除50％自由基时的最大效应浓度(EC50)的倒数，具体测定步骤如下：
(1)将邻苯二酚型木质素溶解于1,4-二氧六环/水(9:1(v/v))中，木质素浓度为1.0～5.0μg/mL；
(2)将步骤(1)中获得的木质素溶液和2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH·)的无水乙醇溶液(其在波长为517nm处的吸光度值为0.7±0.02)混合，充分反应后用紫外分光光度仪测定吸光度值，木质素与DPPH·反应时间为30min，紫外分光光度计测定波长为517nm，计算DPPH·清除能力；
自由基清除能力用以下公式计算：
自由基清除能力(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100
其中，Ai是测试样品的吸光度；Aj是通过无水乙醇替代DPPH·的样品的吸光度；A0是通过无水乙醇替代木质素溶液的空白样品的吸光度值。
(3)获得的浓度和DPPH·清除率曲线计算EC50值，进一步获得自由基清除指数，见表2。
表1为实施例1在不同条件下所制备的邻苯二酚型木质素的羟基含量变化。从表中可以看出，随反应时间的延长，木质素酚羟基含量显著提升，羧基含量先增加后减小，脂肪族羟基在反应12h后的含量急剧减小。
表1
Figure BDA0003692843080000051
表2为实施例1中最优条件下邻苯二酚型木质素与商用抗氧化剂的自由基清除能力的对比。
表2
Figure BDA0003692843080000052
图1为实施例1硫酸盐木质素(KL)和最优条件下邻苯二酚型木质素(DKL)的甲氧基含量。从图中可以看出，甲氧基含量明显减少。
图2为实施例1中硫酸盐木质素(KL)和最优条件下制备的邻苯二酚型木质素(DKL)分子量和多分散性。从图中可以看出，木质素分子结构碎片化导致木质素重均分子量和数均分子量下降，且多分散性明显减小，说明木质素结构更为均一。
实施例2
(1)配置不同浓度的硫酸盐木质素(KL)
取90mL 1,4-二氧六环溶液和10ml的去离子水配置90％的1,4-二氧六环/水(v/v)溶剂，将木质素溶于上述溶剂中，浓度分别为：0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL。
(2)DPPH·自由基清除试验
将DPPH·溶解在无水乙醇中，调整溶液浓度使其在波长为517nm处的吸收值为0.70±0.02。然后将不同浓度的木质素溶液与DPPH·的无水乙醇溶液混合，30min后，使用紫外分光光度计测量样品的吸光度来计算DPPH·清除能力。
自由基清除能力用以下公式计算：
自由基清除能力(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100
其中，Ai是测试样品的吸光度；Aj是通过无水乙醇替代DPPH·的样品的吸光度；A0是通过无水乙醇替代木质素溶液的空白样品的吸光度值。
图3为实施例2不同浓度的硫酸盐木质素的自由基清除能力。由图可知，木质素的自由基清除能力随着浓度的升高而升高，在0.005mg/mL的浓度下，自由基的清除能力可达约70％。
实施例3
(1)木质素同步脱甲基化和分子碎片化
将500mg硫酸盐木质素溶于约12ml N,N-二甲基甲酰胺，用3mL碘代环己烷与其进行反应，反应时间分别为2、5、8、10、12h，温度为100℃，反应完成后，用正己烷、饱和偏重亚硫酸钠溶液进行洗涤，最后用去离子水洗涤呈中性即可。
(2)DPPH·自由基清除试验
将DPPH·溶解在无水乙醇中，调整溶液浓度使其在波长为517nm处的吸收值为0.70±0.02。然后将不同浓度的木质素溶液与DPPH·的无水乙醇溶液混合，30min后，使用紫外分光光度计测量样品的吸光度来计算DPPH·清除能力。
自由基清除能力用以下公式计算：
自由基清除能力(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100
其中，Ai是测试样品的吸光度；Aj是通过无水乙醇替代DPPH·的样品的吸光度；A0是通过无水乙醇替代木质素溶液的空白样品的吸光度值。
图4为实施例3制备的最佳条件下制备的邻苯二酚型木质素自由基清除能力随浓度的变化。从图可知，木质素的自由基清除能力随浓度的升高而增大。
图5为实施例3制备的不同邻苯二酚型木质素在相同浓度下(0.003mg/mL)的自由基清除能力。从图可知，随着脱甲基化和分子碎片化反应延长，木质素的抗氧化活性显著提升。
本发明提供了一种提高木质素抗氧化活性的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (7)

1.一种提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将工业木质素溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到木质素溶液；
(2)向步骤(1)获得的木质素溶液中加入碘代环己烷，在温和条件下反应；
(3)反应完成后，经洗涤去除杂质，获得纯化的木质素产品。
2.根据权利要求1所述的提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述工业木质素为硫酸盐制浆厂产生的针叶材硫酸盐木质素。
3.根据权利要求1所述的提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，得到的木质素溶液中木质素浓度为40～50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，碘代环己烷添加量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:3～1:5。
5.根据权利要求1所述的提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应条件为在常压、温度100℃～120℃下，反应2～12h。
6.根据权利要求1所述的提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，步骤(3)中，洗涤采用依次经正己烷、饱和焦亚硫酸钠和去离子水洗涤。
7.根据权利要求1所述的提高木质素抗氧化活性的方法，其特征在于，步骤(3)中，获得的木质素产品为邻苯二酚型木质素。
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