CN114983976A

CN114983976A - 一种紫杉醇纳米制剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN114983976A
Application number: CN202210727659.1A
Authority: CN
Inventors: 燕云峰; 叶文博; 帅棋
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-23
Also published as: CN114983976B

Abstract

本发明公开了一种紫杉醇纳米制剂及其制备方法和应用，所述紫杉醇纳米制剂的制备方法为，将紫杉醇、玉米醇溶蛋白和PEG‑b‑PLA两亲性嵌段共聚物溶解于有机溶剂混合形成的混合溶液作为1号流股，去离子无菌水作为2号流股，将1号和2号两个流股同时注入到两通道限域对冲混合器中进行快速混合，收集得到制备的纳米粒子悬浮液，即制得含紫杉醇纳米制剂的混合物。本发明利用疏水性玉米醇溶蛋白与紫杉醇的相容性，结合玉米醇溶蛋白的自组装特性以及嵌段共聚物PEG‑b‑PLA作为稳定剂外衣，制备药物封装效率、稳定性提高的、药物释放性能优良的紫杉醇纳米粒子，该方法简便快捷且易于控制，制备出的纳米粒子粒径分布均匀。

Description

一种紫杉醇纳米制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种紫杉醇纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术

高分子纳米载体是随着药物学研究、生物材料学和临床医学的发展而新兴的给药技术，引起了广泛的关注和研究。

紫杉醇(PTX)作为最广泛使用的抗癌药物，已被证明对多种癌症具有显著的抗肿瘤活性。但紫杉醇水溶性很差，在水相环境中难以均匀分散，造成生物利用度低，因此需要将其制成合适的药物剂型。为了增加紫杉醇药物的溶解度、稳定性，降低毒性，消除现有紫杉醇药物剂型的不良反应，国内外研究人员展开了广泛的紫杉醇药物新剂型的研究，包括微球、胶束、脂质体等。这些剂型仍存在包封率低、不稳定、易泄露等缺陷，限制了其产业化发展和临床应用。

近年来，使用聚合物材料制备纳米粒子作为递送载体受到广泛关注，玉米醇溶蛋白(zein)由于其独特的性质，成为制备纳米粒子的理想材料。玉米醇溶蛋白已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为公认安全(GRAS)赋形剂，由于其独特的疏水性和自组装特性，以及优异的生物降解性和生物相容性，在制造用于递送疏水性药物的纳米粒子载体方面显示出巨大潜力。

聚乙二醇聚乳酸两亲性嵌段共聚物(PEG-b-PLA)由于具有生物相容性、生物可降解性和无毒特性，是少数获得美国食品和药物管理局(FDA)批准的聚合物载体之一。PEG-b-PLA胶束能够包载紫杉醇等疏水性小分子药物，改善其水溶性和增加体内血液循环，可以缓慢释放药物，降低药物毒性，促进药物在肿瘤部位的吸收。通过调节PEG和PLA的比例及分子量，可以获得具有不同性质的胶束。

为了进一步提高纳米胶束药物封装效率、稳定性、改善缓控释性能、提高药物递送效率和治疗效果，基于疏水性玉米醇溶蛋白和紫杉醇之间的相容性，考虑将玉米醇溶蛋白和PTX共包封到PEG-b-PLA胶束中形成稳定的纳米粒子，有望成为独特的解决方案。

利用新型、改进的制备方法和技术，是获得性能优良纳米粒子的重要环节。应用瞬时纳米沉淀技术(Flash Nanoprecipitation，FNP)是用作构建药物递送纳米粒子载体的有效方法，具有可控、连续且可扩展的优点。瞬时纳米沉淀技术使物质能够在受限的腔室内以高能量密度湍流共混，促进分子迅速扩散并为粒子成核提供局部过饱和条件，两相界面处的疏水化合物因为溶解度的迅速下降，相互无序聚集形成分子团簇。随着有机溶剂的进一步扩散，分子团簇间进一步聚集，直至团簇的聚集体表面出现了足够多的高分子亲水段，团簇的进一步聚集被终止。纳米粒子可以快速而又可控地形成，可用于制备尺寸小、粒径窄分布的纳米粒子。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，提高药物载体的稳定性和药物封装效率，改善药物缓控释性能，提高药物递送效率和治疗效果，本发明的目的在于提供一种紫杉醇纳米制剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种可连续生产包载紫杉醇的玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备方法，通过对嵌段共聚物的结构、分子量、投料量以及与玉米醇溶蛋白的投料比、流股流速的调节实现对纳米粒子性质的调控，无需化学交联即可实现紫杉醇的有效封装。该方法具有操作简单、过程时间短且参数可调控、可连续以及易于工业放大等优点，具有良好的工业化、规模化的应用前景。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将紫杉醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)，得到第一溶液；

2)将玉米醇溶蛋白溶解于二甲基亚砜(DMSO)，得到第二溶液；

3)将PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物溶解于二甲基亚砜(DMSO)，得到第三溶液；

4)将第一溶液、第二溶液和第三溶液混合，获取混合溶液，作为1号流股；去离子无菌水作为2号流股；

5)将1号和2号两个流股同时注入到两通道限域对冲混合器中进行快速混合，收集得到制备的纳米粒子悬浮液，即制得含紫杉醇纳米制剂的混合物。

进一步地，PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物中，PEG嵌段分子量为1-5kDa，PLA嵌段分子量为2-16kDa。例如，将分子量单位kDa简写为k，PEG-PLA分子量分别为1k-2k，1k-3k，2k-2k，2k-4k，4k-8k，5k-16k等。

进一步地，所述紫杉醇、玉米醇溶蛋白和PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物，它们溶于有机溶剂中的配置浓度均不高于100mg/mL。

进一步的，所述调节物料比例是通过调节嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白在二甲基亚砜溶液中的浓度比。所述1号流股中，紫杉醇的终浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL；PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物的终浓度为5～15mg/mL，优选为10mg/mL；玉米醇溶蛋白的终浓度为1～50mg/mL，优选为10mg/mL。所述二甲基亚砜可通过透析、超滤等手段除去。

进一步地，所述1号流股中，PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白的质量浓度比为1～10:1。

进一步地，所述1号、2号两个流股分别通过注射泵同时注入两通道限域对冲混合器混合腔体。

进一步地，调节注射泵注射流股1流速为4～8mL/min，优选为6mL/min，流股2流速为50～60mL/min，优选为54mL/min。

本发明的创新点在于采用了一种新的制备方法，获得了一种新的纳米粒子组合物，改变需要复杂化学交联方式提高紫杉醇封装效率和递送效率，利用疏水性玉米醇溶蛋白与紫杉醇的相容性，结合玉米醇溶蛋白的自组装特性以及嵌段共聚物PEG-b-PLA作为稳定剂外衣，制备药物封装效率、稳定性提高的、药物释放性能优良的紫杉醇纳米粒子，该方法简便快捷且易于控制，制备出的纳米粒子粒径分布非常均匀。玉米醇溶蛋白作为生物质高分子聚合物，廉价易得，可再生，具有优异的生物降解性和生物相容性，嵌段共聚物外衣生物安全性好，纳米粒子在体内稳定性好，可延长血液循环，起到很好的缓释效果，肿瘤细胞抑制效果好，具有很高的应用价值和非常广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施方案中不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、不同制备方式所获得的纳米粒子的稳定性热图(FNP：瞬时纳米沉淀技术；Drop：滴加方式)；

图2是实施方案中不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、不同制备方式所获得的纳米粒子悬浮液的数码照片；

图3是实施方案中不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、不同制备方式所获得的纳米粒子的平均粒径、粒径分布、散射光强；

图4是实施方案中所获得的纳米粒子的储存稳定性；

图5是实施方案中不同结构的嵌段共聚物(a)、不同玉米醇溶蛋白投料量(b)对纳米粒子的紫杉醇封装效率(EE)的影响；

图6是实施方案中的纳米粒子、载药胶束在缓冲液(PBS，pH5.5)中的稳定性(a，4k-8k系列；b，5k-16k系列)；

图7是实施方案中的纳米粒子、载药胶束在缓冲液(PBS，pH5.5)中的药物缓释曲线(a，4k-8k系列；b，5k-16k系列)；

图8实施方案中所获得的纳米粒子的毒性(a)、紫杉醇纳米粒子的毒性(b)以及人HeLa细胞对纳米粒子的摄取情况(c)；

图9是实施例5的纳米粒子、载药胶束、商品化紫杉醇制剂Taxol对人HeLa细胞移植荷瘤裸小鼠的肿瘤抑制情况(a，肿瘤体积变化曲线；b，小鼠体重变化曲线；c，肿瘤重量；d，肿瘤体积)；

图10是实施例5的纳米粒子、载药胶束、商品化紫杉醇制剂Taxol处理的人HeLa细胞移植荷瘤裸小鼠的肿瘤凋亡情况；

图11实施例5的纳米粒子、载药胶束、商品化紫杉醇制剂Taxol处理的人HeLa细胞移植荷瘤裸小鼠的主要器官组织切片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明以下实施例中，将分子量单位kDa简写为k，PEG-PLA分子量分别为1k-2k，1k-3k，2k-2k，2k-4k，4k-8k，5k-16k等。例如：

嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)，表示PEG分子量是4kDa，PLA分子量是8kDa。

本发明中均是应用开环聚合反应(ring-opening polymerization)制备具有不同亲疏水链段长度的PEG-b-PLA嵌段共聚物，嵌段共聚物的制备方法属于现有常规技术，所有用于反应的玻璃装置在使用前都经过干燥处理。以mPEG_2k-b-PLA_2K(1:1)(2k-2k)为例：选择100mL的圆底烧瓶，加入mPEG_2K(1g,0.5mmol)，D,L-丙交酯(0.54g,3.75mmol)以及无水甲苯25mL。反应温度为150℃，在氮气保护下利用甲苯与水共沸原理通过分水器装置除掉混合液中残留的水分后，加入Sn(Oct)₂催化剂6-7滴，反应48小时。反应结束后，加入200mL二氯甲烷及2-3滴0.1M盐酸溶液淬灭反应。淬灭的反应液经多次水洗，直到水相变为中性。有机相经无水硫酸钠干燥、过滤以及旋转蒸发仪浓缩得到棕黄色油状粗产物。用少量二氯甲烷溶解粗产物，于搅拌下缓慢加入正己烷析出沉淀(二氯甲烷:正己烷＝1:10，v/v)。长时间静置直到上清液澄清后，弃掉上清液。沉淀步骤重复三次后，将产物置于真空干燥箱中，40℃干燥过夜得到最终产物mPEG_2K-b-PLA_2K(收率78％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3,δ):5.28-4.99(m,14H),4.36-4.23(m,3H),4.18-4.04(m,14H),3.82-3.41(m,182H),3.35(s,3H),2.69-2.38(m,21H),2.00(s,7H),1.81-1.63(m,28H),1.57-1.41(m,42H).GPC(THF,RI):Mn＝3600Da,PDI＝1.33。

实施例1

取嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)10mg，玉米醇溶蛋白10mg，紫杉醇1mg溶解于1mL二甲基亚砜，即嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白浓度均为10mg/mL，投料质量比1∶1，紫杉醇浓度为1mg/mL，作为流股1。取9mL去离子水，作为流股2。采用瞬时纳米沉淀技术(简称为FNP)，将流股1和流股2分别装入气密性注射器中，同时将流股1和流股2注射到两通道限域对冲混合器中进行混合，控制注射时长为10s(即注射流股1流速为6mL/min，流股2流速为54mL/min，下列实施例等同)，在混合器出口收集所制备的纳米粒子悬浮液，纳米粒子标记为PTX-4k-8k-1Z。

实施例1标记的纳米粒子PTX-4k-8k-1Z中，4k-8k表示使用的原料是嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)，Z是表示玉米醇溶蛋白的终浓度的值，1Z表示玉米醇溶蛋白的投料质量是10mg，纳米粒子悬浮液体积为10mL，玉米醇溶蛋白的终浓度为1mg/mL。

综上，按照实施例1的生产方式，不添加紫杉醇时即可得到没有载药的纳米粒子4k-8k-1Z(FNP制备方式)。不添加紫杉醇且改变嵌段共聚物的结构时，最终可得到没有载药的其他结构的纳米粒子，例如选用PEG-b-PLA分子量分别为1k-2k的嵌段共聚物PEG-b-PLA，则最终得到没有载药的纳米粒子1k-2k-1Z(FNP制备方式)，以此类推。

而按照实施例1的生产方式，选用PEG-b-PLA分子量分别为1k-2k，1k-3k，2k-2k，2k-4k，4k-2k，4k-4k，4k-6k，4k-8k，5k-5k，5k-8k，5k-16k不同结构的嵌段共聚物对嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)进行替换时，即能够得到不同结构嵌段共聚物的采用瞬时纳米沉淀技术制备的纳米粒子。

而按照实施例1的生产方式，将玉米醇溶蛋白的投料质量替换为10mg、5mg或1mg，即能够得到不同玉米醇溶蛋白投料量下采用瞬时纳米沉淀技术制备的纳米粒子。

实施例2

取嵌段共聚物PEG-b-PLA(5k-5k)10mg，玉米醇溶蛋白10mg，紫杉醇1mg溶解于1mL二甲基亚砜，即嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白浓度均为10mg/mL，投料质量比1∶1，紫杉醇浓度为1mg/mL，作为流股1；取9mL去离子水，作为流股2。采用瞬时纳米沉淀技术(简称为FNP)，将流股1和流股2分别装入气密性注射器中，同时将流股1和流股2注射到两通道限域对冲混合器中进行混合，控制注射时长为10s，在混合器出口收集所制备的纳米粒子悬浮液，纳米粒子标记为PTX-5k-5k-1Z。

实施例3

取嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)10mg，玉米醇溶蛋白5mg，紫杉醇1mg溶解于1mL二甲基亚砜，即嵌段共聚物浓度为10mg/mL，玉米醇溶蛋白浓度为5mg/mL，投料质量比2∶1，紫杉醇浓度为1mg/mL，作为流股1。取9mL去离子水，作为流股2。采用瞬时纳米沉淀技术(简称为FNP)，将流股1和流股2分别装入气密性注射器中，同时将流股1和流股2注射到两通道限域对冲混合器中进行混合，控制注射时长为10s，在混合器出口收集所制备的纳米粒子悬浮液，纳米粒子标记为PTX-4k-8k-0.5Z。

实施例4

取嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)10mg，玉米醇溶蛋白1mg，紫杉醇1mg溶解于1mL二甲基亚砜，即嵌段共聚物浓度为10mg/mL，玉米醇溶蛋白浓度为1mg/mL，投料质量比10∶1，紫杉醇浓度为1mg/mL，作为流股1。取9mL去离子水，作为流股2。采用瞬时纳米沉淀技术(简称为FNP)，将流股1和流股2分别装入气密性注射器中，同时将流股1和流股2注射到两通道限域对冲混合器中进行混合，控制注射时长为10s，在混合器出口收集所制备的纳米粒子悬浮液，纳米粒子标记为PTX-4k-8k-0.1Z。

实施例5

取嵌段共聚物PEG-b-PLA(5k-16k)10mg，玉米醇溶蛋白10mg，紫杉醇1mg溶解于1mL二甲基亚砜，即嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白浓度均为10mg/mL，投料质量比1∶1，紫杉醇浓度为1mg/mL，作为流股1。取9mL去离子水，作为流股2。采用瞬时纳米沉淀技术(简称为FNP)，将流股1和流股2分别装入气密性注射器中，同时将流股1和流股2注射到两通道限域对冲混合器中进行混合，控制注射时长为10s，在混合器出口收集所制备的纳米粒子悬浮液，纳米粒子标记为PTX-5k-16k-1Z。

对照例1

取嵌段共聚物PEG-b-PLA(4k-8k)10mg，玉米醇溶蛋白10mg，紫杉醇1mg溶解于1mL二甲基亚砜，即嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白浓度均为10mg/mL，投料质量比1∶1，紫杉醇浓度为1mg/mL，作为流股1。取9mL去离子水，作为流股2。采用常规滴加混合技术(简称为Drop)，即是改变制备方式，以传统的滴加方式(Dropwise)作为实施例1的对照，将流股1缓慢滴加到流股2中，同时应用磁力搅拌方式剧烈搅拌，即为滴加方式制备获得的纳米粒子悬浮液。

实施例6

不同制备方式(FNP：瞬时纳米沉淀技术；Drop：滴加方式)得到的纳米粒子，纳米粒子悬浮液是含有纳米粒子和10％DMSO的水溶液，分别进行性能测试：

1)不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、不同制备方式所获得的纳米粒子的稳定性热图(FNP：瞬时纳米沉淀技术；Drop：滴加方式)如图1所示，以纳米粒子制备过程中玉米醇溶蛋白投料量10mg、5mg或1mg计，相应的进行性能测试时纳米粒子悬浮液的分散浓度分别设计为2mg/mL、1.5mg/mL或1.1mg/mL，以下图2，图3和图4等同；

2)不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、不同制备方式所获得的纳米粒子悬浮液的拍摄照片如图2所示，图2的(a)中对应瞬时纳米沉淀技术制备方法的测试结果，图2的(b)中对应常规滴加混合技术制备方法的测试结果；

3)静置纳米粒子悬浮液观察其稳定性，在特定时间点使用激光动态散射仪(DLS)检测粒径、粒径分布和散射光强。应用高效液相色谱(HPLC)测定纳米粒子包封的PTX含量，计算包封率。

不同结构的嵌段共聚物原料，以及采用不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、常规滴加混合技术(Dropwise)的制备方式得到的纳米粒子悬浮液，其粒径测试结果，汇总于图3的(a)中。

采用不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、瞬时纳米沉淀技术(FNP)的制备方式得到的纳米粒子悬浮液，其粒径、粒径分布、散射光强的测试结果，汇总于图3的(b)中。

图1和图2显示了不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、不同制备方式所获得的纳米粒子的稳定性。图3显示的是纳米粒子的平均粒径结果。与Dropwise制备方式相比，通过FNP制备方式获得的纳米粒子的储存稳定性更佳、粒径更小。

4)测试获得的纳米粒子的储存稳定性：

采用不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、瞬时纳米沉淀技术(FNP)的制备方式得到的新鲜纳米粒子悬浮液(Fresh)，其粒径、粒径分布的测试结果，分别见图4的(a)-(b)中；上述新鲜纳米粒子悬浮液(Fresh)在室温下静置7天后，其粒径、粒径分布的测试结果，分别见图4的(a)-(b)中。

5)采用不同结构嵌段共聚物、不同玉米醇溶蛋白投料量、瞬时纳米沉淀技术(FNP)的制备方式得到的纳米粒子悬浮液，对所得纳米粒子的紫杉醇封装效率(EE)进行测试。根据以下方法和公式计算：

用滤膜(0.22μm孔径，MerckMillipore)过滤纳米粒子悬浮液并冻干，然后用乙腈溶解，用于高效液相色谱法(HPLC)测量。根据以下公式计算封装效率：

EE＝(m₁/m₀)×100％ (1)

其中m₀是投料中紫杉醇的总质量，m₁是纳米粒子封装紫杉醇的质量。

将不同结构的嵌段共聚物对纳米粒子的紫杉醇封装效率(EE)的影响结果汇总于图5的(a)中，将不同玉米醇溶蛋白投料量对纳米粒子的紫杉醇封装效率(EE)的影响汇总于图5的(b)中。其中图5的(b)中，每种嵌段共聚物的纳米粒子对应的4个柱形图颜色由浅至深，代表玉米醇溶蛋白投料量由少至多。由图5可知，在具有相同玉米醇溶蛋白含量和相同长度的PEG嵌段的纳米粒子中，随着PLA嵌段的分子量的增加，EE略有增加。同时，对于含有4k-8k或者5k-16k和不同玉米醇溶蛋白含量的纳米粒子，随着玉米醇溶蛋白的含量从0增加到1mg/mL，EE显著增加，意味着疏水性玉米醇溶蛋白的加入有利于将紫杉醇封装在基于PEG-b-PLA的纳米粒子中。

实施例7含紫杉醇药物纳米粒子的体外药物释放实验：

纳米粒子PTX-4k-8k的制备方法重复实施例1，不同之处仅在于“不添加玉米醇溶蛋白”，依次类推，纳米粒子PTX-5k-16k的制备方法重复实施例5，不同之处仅在于“不添加玉米醇溶蛋白”。

为模拟肿瘤微环境和体液微环境的酸性和中性条件，在含有0.1％Tween-80的缓冲液(0.1MPBS，pH5.5)中评估纳米粒子的PTX缓释行为。将2mL纳米粒子悬浮液置于透析袋(MWCO：3.5kDa)中，浸入40mL缓冲液置于37℃下搅拌释放96h。在预定时间点，取出4mL透析缓冲液并补加4mL新鲜缓冲液以保持透析缓冲液的总体积恒定，取出的缓冲液使用HPLC测量PTX浓度，以计算PTX的累积释放。根据以下公式计算累积释放率(Rr)：

Rr＝(释放的PTX累积量/纳米粒子中的PTX总量)×100％。 (2)

将不同纳米粒子分散在缓冲液(PBS，pH5.5)中(2mg/mL)，通过在不同时间点(新鲜制备和放置5天)测定其粒径和粒径分布来评估纳米粒子的稳定性。不同纳米粒子、载药胶束在缓冲液(PBS，pH5.5)中的稳定性(a，4k-8k系列；b，5k-16k系列)如图6所示。由图6可知，与不含有玉米醇溶蛋白的紫杉醇纳米粒子相比，含有玉米醇溶蛋白的紫杉醇纳米粒子的储存稳定性更佳。

纳米粒子、载药胶束在缓冲液(PBS，pH5.5)中的药物缓释曲线(a，4k-8k系列；b，5k-16k系列)如图7所示，纵坐标为紫杉醇累积释放率(Rr)。由图7可知，对于含有4k-8k或者5k-16k和不同玉米醇溶蛋白含量的纳米粒子，随着玉米醇溶蛋白的含量的增加，紫杉醇的缓释速率越慢，意味着疏水性玉米醇溶蛋白的加入有利于紫杉醇的持久释放。

实施例8

纳米粒子的体外细胞毒性实验。使用MTT法研究玉米醇溶蛋白纳米粒子对HeLa肿瘤细胞的细胞相容性和载药玉米醇溶蛋白纳米粒子对HeLa细胞的体外杀伤功效。所用HeLa细胞在含有10％FBS和双抗(1％青霉素-链霉素)的DMEM培养基(37℃，5％CO₂)中培养。将HeLa细胞接种到96孔板(10,000个细胞/孔)中，待细胞贴壁生长后，将培养基替换为新鲜的DMEM培养基，并将空载的纳米粒子、负载紫杉醇的纳米粒子分别添加到培养基中进行孵育培养。待24小时后，加入20μL5mg/mL的MTT，在37℃下继续孵育4h，然后490nm下检测吸收光。根据吸光度分析HeLa细胞的活力，用于评估纳米粒子递送载体的细胞相容性和PTX递送效率，并测试游离PTX和商品Taxol的细胞毒性作为对照。不同浓度空载的纳米粒子、负载紫杉醇的纳米粒子对HeLa细胞的细胞毒性效果分别见图8的(a)和(b)中。图8的(a)和(b)中对应的柱形图颜色由浅至深，代表浓度由少至多。

纳米粒子的细胞摄取实验。为了追踪纳米粒子的细胞摄取和细胞内定位，将HeLa细胞以每孔40,000个细胞的密度接种在24孔板中，待细胞贴壁生长后，将培养基替换为新鲜的DMEM培养基，并将香豆素6标记的纳米粒子添加到培养基中进行孵育培养。用激光共聚焦显微镜研究孵育2小时和4小时纳米粒子的细胞摄取和细胞内分布，测试结果见图8的(c)中。由图8的(c)可知，在2小时内纳米粒子即被HeLa细胞摄取，绿色荧光强度(香豆素6)随着孵育时间的增加而增加，这表明培养4小时后更多的纳米粒子被细胞摄取，但是细胞摄取纳米粒子和胶束并没有选择性差异。

实施例9

紫杉醇纳米粒子的抗肿瘤动物实验。通过在BALB/c小鼠(14-16g，雌性)皮下注射HeLa肿瘤细胞，建立异种移植肿瘤模型。将肿瘤体积达到约60mm³(接种后约4天)的小鼠随机分组，每组5只动物，在肿瘤模型建立后的第0、2、4、6、8、10天，将负载紫杉醇的纳米粒子通过尾静脉分别注射到荷瘤小鼠体内(施药量为10mg/kg小鼠，即每kg小鼠实施包含有10mgPTX的纳米粒子)，并记录小鼠的体重和皮下肿瘤的体积。应用PBS、载药胶束、商品化紫杉醇制剂Taxol作为对照。在PBS对照组小鼠的肿瘤体积达到约2000mm³(约第12天)时处死小鼠，收集肿瘤和主要器官，测量肿瘤重量，并进行H&E和TUNEL染色、荧光拍照分析肿瘤细胞凋亡情况(绿色荧光为标记凋亡细胞)，将主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)进行H&E染色分析生物安全性。

按照上述过程，PBS、纳米粒子PTX-5k-16k、载药胶束PTX-5k-16k-1Z、商品化紫杉醇制剂Taxol处理的人HeLa细胞移植荷瘤裸小鼠的肿瘤凋亡情况如图10所示，处理的人HeLa细胞移植荷瘤裸小鼠的主要器官组织切片情况如图11所示。

图10显示紫杉醇纳米粒子处理的实验组小鼠肿瘤中凋亡细胞最多，商品化紫杉醇制剂Taxol、载药胶束处理的实验组小鼠肿瘤次之，PBS处理的实验组小鼠肿瘤中几乎没有凋亡细胞，说明紫杉醇纳米粒子的抗肿瘤效果最优。图11显示小鼠主要器官切片中细胞形态完整、健康，从而验证了生物安全性。

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims

1.一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将紫杉醇溶解于有机溶剂，得到第一溶液；

2）将玉米醇溶蛋白溶解于有机溶剂，得到第二溶液；

3）将PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物溶解于有机溶剂，得到第三溶液；

4）将第一溶液、第二溶液和第三溶液混合，获取混合溶液，作为1号流股；去离子无菌水作为2号流股；

5）将1号和2号两个流股同时注入到两通道限域对冲混合器中进行快速混合，收集得到制备的纳米粒子悬浮液，即制得含紫杉醇纳米制剂的混合物。

2.如权利要求1所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，配制第一溶液、第二溶液和第三溶液的有机溶剂均为二甲基亚砜DMSO。

3.如权利要求1所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物中，PEG嵌段分子量为1−5 kDa，优选为4 -5 kDa， PLA嵌段分子量为2−16kDa，优选为8-16 kDa。

4.如权利要求1所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述紫杉醇、玉米醇溶蛋白和PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物，它们溶于有机溶剂中的配置浓度均不高于100mg/mL。

5.如权利要求1所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述1号流股中，紫杉醇的终浓度为0.5~2 mg/mL，优选为1 mg/mL；PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物的终浓度为5~15mg/mL，优选为10 mg/mL；玉米醇溶蛋白的终浓度为1~50 mg/mL，优选为10 mg/mL。

6.如权利要求5所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述1号流股中，PEG-b-PLA两亲性嵌段共聚物与玉米醇溶蛋白的质量浓度比为1~10:1。

7.如权利要求1所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述1号、2号两个流股分别通过注射泵同时注入两通道限域对冲混合器混合腔体。

8.如权利要求7所述的一种紫杉醇纳米制剂的制备方法，其特征在于，调节注射泵注射流股1流速为4~8mL/min，优选为6 mL/min，流股2流速为50~60mL/min，优选为54 mL/min。

9.如权利要求1~8任一所述方法制备的紫杉醇纳米制剂，其特征在于所述紫杉醇纳米制剂为装载紫杉醇的玉米醇溶蛋白/PEG-b-PLA纳米粒子。

10.如权利要求9所述的紫杉醇纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。