CN114967089B - 一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，属于显微成像领域，该系统利用保偏光纤将抑制光分为两个非相干且相互垂直的偏振分量，利用基于超表面的复合相位调控器件，分别对抑制光波长下的两个圆偏振分量进行位相编码，同时不影响激发光光束的位相分布。该系统可以仅利用单片超薄器件实现三维的超分辨显微成像系统，简化系统结构，增加系统稳定性，与已有方法相比，本发明所公开的系统可以方便地实现三维超分辨成像。

Description

一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统

技术领域

本发明设计显微成像领域，具体地说，设计一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统。

背景技术

光学显微镜特别是荧光显微镜，具有无损、非接触、高特异性、高灵敏度、三维成像等突出优点，在生物学和医学研究中发挥着不可代替的作用，但是，长期以来，受限于光学衍射极限，可见光区百纳米分辨率的信息获取面临巨大挑战。为了突破光学显微镜的衍射极限，科学家不断寻找新的方法来提高显微镜的分辨率。目前常见的技术包括有目标开关与读取显微成像技术(RESOLFT、STED、GSD)、单分子成像定位技术(PALM、STROM)、饱和结构光照明(SIM)、荧光振荡(SOFI)、样品膨胀(ExM)等。

在上述方法中，受激发射损耗显微成像技术(STED)衍生于共聚焦显微成像技术，因其功能可扩展性好，不需要图像后处理等优势受到越来越多研究人员的关注。与提出时相比，现有的STED显微成像技术已经取得较大进展，在特定非生物样品中的最高分辨率可以达到2.4nm，在生物样品中也可以达到接近50nm。同时，STED系统在功能上变得更为丰富，包括多色成像，寿命成像以及荧光相干谱的测量等。但是，STED显微成像系统过于复杂的问题直接影响了系统长期工作的稳定性，其中关键在于实现STED需要针对不同激发光和抑制光采用不同的位相编码，并且实现三维STED还需要将抑制光分束为两个不相干分量，再进行不同的位相编码，一方面，这种“先分束编码，再合束共焦”的设计对于光束准直而言是巨大的挑战，另一方面，将抑制光光束分为两束非相干分量则进一步增加了整个系统的复杂度。共路自准直的设计是解决系统复杂度难题的有效方法。StefanHell课题组曾提出了多种基于分块波片的设计方案，包括提出easy STED(《Birefringent device converts astandard scanning microscope into a STED microscope that also maps molecularorientation》，Optics Express 18，1049-1058，2010))以及楔形玻璃(《A STEDmicroscope aligned by design》.Optics Express,17(18):16100-16110，2009)等，但由于波片材料本身选择特性十分有限，无法对抑制光的多个分量同时进行不同的位相调制，因此无法实现光束自准直的三维超分辨成像。相较于普通波片而言，超表面器件作为一种基于亚波长结构的新型功能器件，能够在平面化的亚波长结构内产生异常的相位突变，对特定波长的光束进行精确位相振幅和偏振操控，精确控制光场，为实现光束自准直的三维STED超分辨成像系统提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的为提供一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，利用超薄平面器件代替传统系统中相位编码过程所需要的分束、合束以及各种位相编码器件，使损耗光的不同偏振分量以及激发光光束同时编码，从而降低系统复杂度，提高系统长期工作的稳定性，使系统更为紧凑。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，包括照明单元以及探测单元，照明单元包括激发光光源和抑制光光源，抑制光光源发出的抑制光依次经过线偏振片、第一透镜、长保偏光纤、第二透镜以及四分之一波片后，和激发光光源经过第一滤光片后发出的激发光经合束元件第一二色镜合成为一束混合光，混合光的光路依次经过基于超表面的复合型相位调控器件、第一望远组件、第二二色镜、消色差显微物镜、直至样品台。

所述探测单元主要包括扫描组件以及成像组件，所述的成像组件包括第二二色镜、第二滤光片、第三透镜和设置在第二二色镜反射光路上的光子计数器，经过编码后的混合光束经过消色差显微物镜后聚焦在样品上，激发产生荧光信号，并沿原路返回至所述的第二二色镜后反射，经过第二滤光片和第三透镜，到达所述光子计数器，所述光子计数器将光信号转换为电信号并传送至计算机，计算机对其进行读取并重构荧光图像，光路中放置在消色差显微物镜前的扫描组件改变混合光束在消色差显微物镜入瞳处的偏转角，使混合光束焦点在消色差显微物镜焦平面上实现二维高速扫描。

作为进一步地改进，本发明所述的抑制光源出射的光经过线偏振片变为线偏光，然后经过第一透镜耦合进长保偏光纤，利用长保偏光纤破坏抑制光束水平和垂直偏振分量相干性，再经过四分之一波片后成为非相干的左旋圆偏振光以及右旋圆偏振光。

作为进一步地改进，本发明所述的基于超表面的复合型相位调控器件用于对抑制光的两个非相干分量进行特殊相位调制，使得抑制光经过消色差显微物镜聚焦后形成围绕焦点中空分布的光斑；同时，基于超表面的复合型相位调控器件对激发光不做特殊的相位调制。

作为进一步地改进，本发明所述的基于超表面的复合型相位调控器件包括二氧化硅衬底和垂直设置、并分布于衬底表面上的纳米柱，纳米柱为硅纳米柱、二氧化钛纳米柱、氮化硅纳米柱中的任意一种。

作为进一步地改进，本发明所述的纳米柱的高度为500nm-800nm，各相邻纳米柱的周期间隔取值范围为400nm-600nm。

作为进一步地改进，本发明所述的基于超表面的复合型相位调控器件，不同位置的纳米柱具有不同的旋转角度以及长宽尺寸，旋转角度根据所需的位相要求在0到360度之间，长宽尺寸取值范围则根据周期间隔限定在50nm-560nm之间，最大值不超过相邻纳米柱的周期间隔大小。目的是得到不同的位相响应，满足位相要求。

作为进一步地改进，本发明所述的纳米柱截面形状为长方形或椭圆形或多边形或菱形。满足几何相位的调控条件。

作为进一步地改进，本发明所述的望远组件，包含两个凸面向背设置且共焦的凸透镜，用于扩束准直并维持相位调制组件与消色差显微物镜后焦平面的共轭关系。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)相较于传统系统的“先分束编码，再合束共焦”方式，本发明可以使得激发光和损耗光不需要分束编码，实现光束自准直功能，减少了传统光路中各种分束、合束、位相编码器件的数量，从而降低整个系统的复杂度，提高系统的稳定性，使得系统更为紧凑。

(2)相较于传统系统实现三维超分辨显微成像的方式，本发明通过长保偏光纤将抑制光转换为两束非相干光，利用器件的偏振敏感性相位编码，经过物镜聚焦后实现三维的中空聚焦光斑，相较于传统系统将光束分束后利用相位延迟板去相干性的方式，简化了系统装置，降低了系统调试的难度。

(3)本发明所使用的超表面相位编码器件为超薄平面器件，相较于空间光调制器和常规的相位板，器件体积更小，并且能够实现多维度的调控，从而实现光束自准直的紧凑型超分辨显微成像系统，提升系统工作的稳定性。基于超表面的复合型相位调控器件是最关键器件，用于复用型相位调制，对抑制光波长下的不同圆偏振入射光分别进行不同的相位编码，并且对激发光波长下的入射光不做特殊的相位编码。

(4)纳米柱选为硅纳米柱、二氧化钛纳米柱、氮化硅纳米柱中的任意一种，选用用高折射率的介质材料可以降低损耗，提高器件的透射效率。

(5)为了满足器件的位相补偿要求以及工作效率要求，器件中纳米柱的高度取值范围为500nm-800nm；同时为了避免衍射以及满足奈奎斯特采样定律，相邻纳米柱的周期间隔取值范围为400nm-600nm。

附图说明

图1为本发明实例中具有自动光束准直的三维超分辨率显微成像系统的结构示意图；

图2为本发明实例中基于超表面的复合型相位调控器件的表面结构示意图；

图3为本发明实例中基于超表面的复合型相位调控器件的单元纳米块结构示意图；

图4为本发明实例中设计的特定位相编码图案以及对应的点扩散函数PSF示意图；

图中，抑制光光源1，线偏振片2，第一透镜3，长保偏光纤4，第二透镜5，四分之一波片6，第一二色镜7，第一滤光片8，激发光光源9，基于超表面的复合型相位调控器件10，望远组件11，第二二色镜12，消色差显微物镜13，样品台14，第三透镜15，光子计数器16，扫描组件17，第二滤光片18。

具体实施方式

本发明公开了一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，照明单元包括抑制光光源1和激发光光源9，抑制光光源1发出的抑制光光束经过45度放置的线偏振片2，使得光束偏振方向与水平光轴方向夹角为45度，经过透镜耦合进入长保偏光纤4，利用长保偏光纤4破坏入射光束相互垂直的两个偏振分量的相干性；经过光纤后出射的光束经过第二透镜6扩束准直后，再经过四分之一波片6，成为两束非相干的左旋圆偏振光和右旋圆偏振光；光束经过四分之一波片6输出后，到达合束器件，与激发光光源9经过第一滤光片8后发出的激发光光束合并为混合光束，入射到基于超表面的复用型相位调制器件10。

基于超表面的复用型相位调制器件10为具有偏振敏感性的相位编码器件。该器件是一种基于超表面的复用型相位编码器件，具有波长和偏振选择性相位编码功能。该器件由二氧化硅衬底以及不同亚波长尺寸的介质材料单元组成，为长方体，介质亚波长结构的长为L，宽为W，高度为H，每个单元的周期为P。通过调节介质材料单元的尺寸，可以得到不同电动力学相位响应，也称为传播相位；同时每个纳米块还具有不同的旋转角度，带来两倍于旋转角度的几何相位。对于传播相位，它具有波长选择特性，同一尺寸不同波长下得到的传播相位不同，但没有偏振选择特性；而几何相位则是具有偏振选择特性，并且左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的几何相位延迟量恰好相反；因此，通过结合两者的选择特性，将不同尺寸的亚波长尺寸纳米结构，在空间上以特定的旋转角度进行排布，可以实现在抑制光波长下，左旋圆偏光分量和右旋圆偏光分量携带不同的相位分布，同时在激发光波长下，仍然保持等相位分布。激发光和抑制光不需要像传统方式，需要多个分束合束以及相位编码器件，混合光束直接通过复合相位型超表面器件，经过显微物镜聚焦后，激发光聚焦为实心光斑，抑制光的聚焦光斑内光强则围绕焦点呈中空分布，即实现传统3D STED所需的点扩散函数(PSF)分布，分别在轴向和横向上对激发光的PSF进行压缩，并且由于抑制光与激发光同时经过编码器件，因此抑制光和激发光自动实现准直的效果。

混合光聚焦到样品后产生的反射荧光信号由荧光成像组件收集。荧光成像组件包括半反半透的第二二色镜12，第二滤光片18、第三透镜15以及光子计数器16。其中，第二二色镜12用于将荧光信号反射到第三透镜15，第三透镜15用于将收集的荧光信号聚焦到光子计数器上，光子计数器再根据收集到的荧光光子数将荧光信号线性转换为电信号进行输出。

45度线偏振片2的作用是改变抑制光的偏振方向，以便于后续得到非相干光束。

长保偏光纤4的作用是破坏入射光束的水平和竖直偏振分量的相干性，保证后续抑制光的非相干叠加。

四分之一波片6是用于将两束非相干线偏光转换为左旋圆偏光和右旋圆偏光，波片的光轴方向与水平方向成45度夹角。

第一二色镜7的作用是合束，将抑制光和激发光合并为混合光束，该二色镜对激发光束波长反射，对抑制光束波长透射。

基于超表面的复用型相位编码超表面器件10对于抑制光的不同偏振分量具有不同的相位编码，抑制光通过超表面相位编码器件后，出射光的左旋圆偏振光以及右旋圆偏振光会携带不同的相位分布，经过物镜后能够形成三维中空聚焦光斑，而激发光通过超表面相位编码器件后，仍然为平面波前，与调制后的损耗光形成混合光束聚焦在样品上，抑制光分别在横向以及轴向上对激发光的点扩散函数(PSF)进行压缩，提高成像分辨率，而不需要像传统系统一样需要合束器件以及复杂的系统调节进行合束再照明，从而实现相位调制后光束自动准直的功能。

望远组件11包含两个凸面向背设置且共焦的凸透镜。用于扩束准直维持相位调制组件与消色差显微物镜后焦平面的共轭关系。

样品台14用于承载样品，并提供三维移动能力，同时消色差显微物镜13前的扫描组件17为三振镜系统，通过改变混合光束在显微物镜入瞳处的偏转角，使混合光束焦点在物镜焦平面上实现二维高速扫描，结合样品台14以及扫描组件17，实现三维快速扫描。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

图1为本发明实例中具有自动光束准直的三维超分辨率显微成像系统的结构示意图，本实施例的自动光束准直的三维超分辨显微成像系统依次包括：抑制光光源1，线偏振片2，第一透镜3，长保偏光纤4，第二透镜5，四分之一波片6，第一二色镜7，第一滤光片8，激发光光源9，基于超表面的复合型相位调控器件10，望远组件11，第二二色镜12，消色差显微物镜13，样品台14，第三透镜15，光子计数器16，扫描组件17，第二滤光片18，所有光学元件和荧光样品均位于同轴光路上。

来自抑制光光源1的抑制光束经过线偏振片2后，由第一透镜3耦合进入长保偏光纤4中。经过长保偏光纤4出射后的抑制光束经过第二透镜5重新扩束准直。经过扩束准直后的抑制光光束经过四分之一波片6后，到达合束器件第一二色镜7。来自激发光光源9的激发光光束通过第一滤光片8后，到达合束元件第一二色镜7。激发光光束和抑制光光束通过第一二色镜7合并为混合光束，混合光束再经过基于超表面的复合型相位调控器件10。经过位相调控器件后的混合光束经过望远组件11，扩束准直并维持与消色差显微物镜后焦平面的共轭关系。混合光束经过望远组件11后，到达第二二色镜12，然后再入射到消色差显微物镜13，被聚焦到放置在样品台14上的样品。来自样品的荧光被消色差显微物镜反向收集后，通过第二二色镜12反射进入成像单元，经过第二滤光片18、第二透镜15聚焦到光子计数器16，最后通过计算机处理后得到观察图像。

抑制光光源1为显微镜系统提供抑制光束，光束波长相对激发光束的波长应更长，波长范围为700-775nm；抑制光光源1的平均功率大于3W/nm；抑制光束为纯度高于10000:1的线偏振光。

激发光光源9为显微镜系统提供激发光束，可选白光激光器或是由单个固体激光器。本实施例为白光激光器，波长范围为450nm-700nm，激发光光源9的平均功率不小于0.5mW/nm，激发光束为纯度高于1000：1的线偏振光。

激发光光源1和抑制光光源2可以是连续光激光器，也可以是脉冲激光器。本实施例中，当二者是脉冲激光器时，激光器脉冲频率在20～200MHz之间并且保持同步，优选为80MHz，其中，激光发光源脉冲宽度应该小于100ps，抑制光光源2的脉冲宽度应该在500～1000ps之间。

第一滤光片8用于选择需要的激发光光束波长，并且调制对应波长的透射光强，本实施例为声光可调协滤光片，所需要激发光波长由样品中所用荧光染料确定，优选波长包括485nm、590nm和650nm。

长保偏光纤4用于对输入抑制光的两个垂直偏振分量产生足够大的位相延迟，以破坏两个分量间的相干性。

经过长保偏光纤出射的抑制光光束经过第二透镜5重新扩束准直后，再经过四分之一波片6，形成由非相干的左旋圆偏光以及右旋圆偏光组成的混合光束。

出射的抑制光光束与经过第一滤光片8出射后的激发光光束被合束器件第一二色镜7合并为混合光束。第一二色镜7选择对激发光光束波长反射，同时对抑制光光束波长透射的二色镜。

基于超表面的复合型相位调控器件10用于对抑制光光束的不同偏振分量进行特殊的位相编码，同时对激发光光束不作特殊编码作用。该器件是由一定数量的硅纳米柱进行排布，图2为本发明实例中基于超表面的复合型相位调控器件的表面结构示意图，超表面器件由二氧化硅衬底和设置于其上的一定数量的纳米柱组成；纳米柱截面为长方形，同时也可以选择为椭圆形或其他具有各向异性特点的几何形状如八边形、菱形等。材料方面，除硅外，还可考虑如二氧化钛、氮化镓等在可见光及近红外具有较大透明窗口的高折射率材料。图3为本发明实例中基于超表面的复合型相位调控器件的单元纳米块结构示意图；纳米柱单元结构如图3所示，不同位置的纳米柱尺寸和旋向随着要求的相位值发生变化。通过特殊的设计和排布，即在不同位置上的纳米块具有不同的旋转角度以及尺寸大小，能够实现在抑制光波长下具有较高的偏振转换效率。纳米柱的旋向决定了几何相位的大小，并且对于不同旋向的圆偏振光入射，其带来的几何相位恰好相反，同时，改变纳米柱的尺寸决定了出射光的传播相位值，并且该相位不具有偏振敏感特性，因此通过结合具有偏振敏感特性的几何相位以及偏振不敏感特性的传播相位，能够实现对不同偏振态进行特殊位相编码的功能。图4为本发明实例中设计的特定位相编码图案以及对应的点扩散函数PSF示意图，不同偏振态的出射损耗光的相位编码以及对应的PSF，抑制光入射后，出射的右旋圆偏振光分量相位分布为“0/π”相位分布，左旋圆偏振光分量相位分布为“0-2π”的涡旋相位分布，经过调制后的抑制光被消色差显微物镜聚焦后，聚焦光斑内光强分布围绕焦点呈中空分布；同时不同的纳米块尺寸在不同波长下具有不同的响应，使得激发光光束经过位相编码器件后仍为等相位分布。

望远组件11包括两个凸面向背设置且共焦的凸透镜，用于将经过编码后的混合光束准直扩束，并维持系统中位相调制器件于消色差显微物镜的后焦面的共轭关系。

消色差显微物镜13用于将混合光束聚焦在样品上照明，并反向收集来及样品的荧光信号；为保持分辨率，选择数值孔径大于1.05、放大倍率60-100倍的平场消色差显微物镜。

样品台14用于承载样品，并提供三维移动能力；

在混合光束照明下，样品产生荧光，并被消色差显微物镜13反向收集，荧光经过第二二色镜12反射进入成像光路，经过第二滤光片18、第三透镜15将收集的荧光信号聚焦到光子计数器16上，光子计数器16再根据收集到的荧光光子数将荧光信号线性转换为电信号进行输出。本实施例的光子计数器16选择雪崩式发光二极管或光电倍增管，第二滤光片18用于滤除不属于探测通道光谱外的杂散光信号，可选择中心波长为685nm，带宽为50nm的滤光片。由单光子计数器产生的电信号，最终由计算机读取，并将其还原成荧光信号。

上述对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，包括照明单元以及探测单元，其特征在于：所述照明单元包括激发光光源(9)和抑制光光源(1)，所述抑制光光源(1)发出的抑制光依次经过线偏振片(2)、第一透镜(3)、长保偏光纤(4)、第二透镜(5)以及四分之一波片(6)后，和激发光光源(9)经过第一滤光片(8)后发出的激发光经合束元件第一二色镜(7)合成为一束混合光，所述的混合光的光路依次经过基于超表面的复合型相位调控器件(10)、第一望远组件(11)、第二二色镜(12)、消色差显微物镜(13)、直至样品台(14)；

所述探测单元主要包括扫描组件(17)以及成像组件，所述的成像组件包括第二二色镜(12)、第三透镜(15)、第二滤光片(18)和设置在第二二色镜(12)反射光路上的光子计数器(16)，经过编码后的混合光束经过消色差显微物镜(13)后聚焦在样品上，激发产生荧光信号，并沿原路返回至所述的第二二色镜(12)后反射，经过第二滤光片(18)和第三透镜(15)，到达所述光子计数器(16)，所述光子计数器(16)将光信号转换为电信号并传送至计算机，计算机对其进行读取并重构荧光图像，光路中放置在消色差显微物镜(13)前的扫描组件(17)改变混合光束在消色差显微物镜(13)入瞳处的偏转角，使混合光束焦点在消色差显微物镜(13)焦平面上实现二维高速扫描；

所述的基于超表面的复用型相位编码超表面器件(10)对于抑制光的不同偏振分量具有不同的相位编码，抑制光通过超表面相位编码器件后，出射光的左旋圆偏振光以及右旋圆偏振光会携带不同的相位分布，经过物镜后能够形成三维中空聚焦光斑，而激发光通过超表面相位编码器件后，仍然为平面波前，与调制后的损耗光形成混合光束聚焦在样品上，抑制光分别在横向以及轴向上对激发光的点扩散函数(PSF)进行压缩，提高成像分辨率，而不需要像传统系统一样需要合束器件以及复杂的系统调节进行合束再照明，从而实现相位调制后光束自动准直的功能。

2.根据权利要求1所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：抑制光源出射的光经过线偏振片(2)变为线偏光，然后经过第一透镜(3)耦合进长保偏光纤(4)，利用长保偏光纤(4)破坏抑制光束水平和垂直偏振分量相干性，再经过四分之一波片(6)后成为非相干的左旋圆偏振光以及右旋圆偏振光。

3.根据权利要求1所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：所述的基于超表面的复合型相位调控器件(10)用于对抑制光的两个非相干分量进行特殊相位调制，使得抑制光经过消色差显微物镜(13)聚焦后形成围绕焦点中空分布的光斑；同时，所述的基于超表面的复合型相位调控器件(10)对激发光不做特殊的相位调制。

4.根据权利要求3所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：所述的基于超表面的复合型相位调控器件(10)包括二氧化硅衬底和垂直设置、并分布于衬底表面上的纳米柱，所述的纳米柱为硅纳米柱、二氧化钛纳米柱、氮化硅纳米柱中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：所述的纳米柱的高度为500nm-800nm，各相邻纳米柱的周期间隔取值范围为400nm-600nm。

6.根据权利要求4所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：基于超表面的复合型相位调控器件(10)，不同位置的纳米柱具有不同的旋转角度以及长宽尺寸，旋转角度根据所需的位相要求在0到360度之间，长宽尺寸取值范围则根据周期间隔限定在50nm-560nm之间，最大值不超过相邻纳米柱的周期间隔大小。

7.根据权利要求4所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：所述的纳米柱截面形状为长方形或椭圆形或多边形或菱形。

8.根据权利要求1所述的具有自动光束准直的三维超分辨显微成像系统，其特征在于：所述的望远组件，包含两个凸面向背设置且共焦的凸透镜，用于扩束准直并维持相位调制组件与消色差显微物镜(13)后焦平面的共轭关系。

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