CN114958954A

CN114958954A - 幽门螺杆菌药敏检测试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN114958954A
Application number: CN202210376848.9A
Authority: CN
Inventors: 王洪涛; 马伟民; 张永顶; 刘谦
Original assignee: Shenzhen Blot Biotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Blot Biotech Co ltd
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2022-08-30
Also published as: CN108486211A

Abstract

本发明提供了用于幽门螺杆菌药敏试验的培养基和判读方法，该培养基配方独特，能够高效稳定地促进幽门螺杆菌的生长，保证药敏试验检测结果中的抑菌圈及其大小只同抗生素种类和抗生素浓度相关，从而可以根据抑菌圈的出现与否以及抑菌圈的大小，依据设定的判读方法和标准科学确定不同幽门螺杆菌分离株对不同抗生素的敏感性，具有快速、准确、直观、便捷的特点和优势。是针对各种病原菌独特、可靠的新型药敏检测方法。同标准药敏试验相比较，其检测准确性可以达到100％。

Description

幽门螺杆菌药敏检测试剂盒和检测方法

本申请是申请日为2018.04.18、发明名称为“幽门螺杆菌药敏检测培养基及试剂盒”、申请号为201810350533.0的发明的分案申请。

技术领域

本发明涉及药敏检测领域，尤其涉及幽门螺杆菌药敏检测培养基及试剂盒。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)是一种革兰氏阴性菌，可定植于胃粘膜，世界范围内约有高达50％～70％的感染率。流行病学分析显示，慢性活动性胃炎HP检出率为92.43％，十二指肠溃疡中检出率为89.47％，胃溃疡检出率为83.35％，胃癌中检出率为58.99％。可见，幽门螺杆菌感染是慢性胃炎的主要原因。同时长期的HP感染还会引发严重的萎缩性胃炎、伴随性肠上皮化生，甚至可以极大地提高胃癌风险。

目前，幽门螺杆菌的感染主要靠以抗生素为主的三联或四联疗法进行治疗，但是目前幽门螺杆菌的清除率和相关疾病的治愈率在逐年下降，其中非常重要的原因是患者感染幽门螺杆菌的耐药性越来越严重而且普遍，目前对HP的治疗方案几乎全凭临床经验制订，药物组成和配方单一，没有针对不同感染者施行个体化精准治疗，因此往往导致治疗失败，需要多次除菌治疗，不仅导致病人的经济负担，同时也导致药物治疗的副作用高发。

对不同患者体内幽门螺杆菌菌株进行药物敏感性检测，是制定个体化、精准治疗方案的有效方法。纸片扩散法是应用最广泛的药敏测试方法，该法是将含有特定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的培养基表面上，纸片中的药物在培养基中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度逐渐降低，从而在药敏片周围形成浓度梯度，药敏片周围细菌依据对药物的不同敏感性而在药敏片周围形成不同大小的抑菌圈，高敏感的药敏片周围会形成较大的抑菌圈，耐药药敏片周围则形成较小抑菌圈或无抑菌圈，所以可以根据抑菌圈的大小来判断是药物的敏感、中度敏感、耐药。通过药敏试验，筛选针对于特定微生物的敏感药物，从而对临床治疗提供指导。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的“抗微生物药物敏感性试验执行标准”，为临床试验和相关医疗问题提供指南，受到全世界的公认和采用。

但通常纸片法药敏检测结果首先需要用尺子测量抑菌圈直径，再查找标准数据进行比对，才能得到正确的结果。这样的不仅操作麻烦、测量不准、耗时，更重要的是，目前还缺少能够用于幽门螺杆菌药敏检测的标准培养基。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于幽门螺杆菌药敏检测培养基及试剂盒，本发明所述的培养基能够很好保证幽门螺杆菌的生长，同时保证药敏试验检测结果中的抑菌圈及其大小只同抗生素种类和抗生素浓度相关。

本发明提供的培养基由绵羊血和营养液组成；所述营养液由水和如下组分组成：

一些实施例中，所述营养液由水和如下组分组成：

另一些实施例中，所述营养液由水和如下组分组成：

另一些实施例中，所述营养液由水和如下组分组成：

本发明采用的绵羊血为无菌脱纤维绵羊血，购自南京茂捷微生物科技有限公司。本发明所述绵羊血与营养液的体积比为1∶(8～10)。

一些实施例中，所述绵羊血与营养液的体积比为1∶9。

本发明提供的培养基的pH值为7.2±0.1。

本发明所述培养基的制备方法为，将牛心浸出物、牛脑浸出物、半胱氨酸、Na₂HPO₄、蛋白胨、NaCl与水混合，加入琼脂粉后，经灭菌制得营养液；所述营养液与绵羊血混合，制得培养基。

各组分与水混合后，经滤纸过滤和灭菌的步骤；所述灭菌的条件为：121℃灭菌20min。

混合后的溶液可灭菌后于4℃保存备用，使用时取出加入琼脂粉共同灭菌制备营养液。或者混合后的直接加入琼脂粉，经灭菌制得营养液。所述灭菌的条件为：121℃灭菌20min。

将灭菌后的营养液与绵羊血混合，充分混匀后，制备平板。

本发明所述的培养基在幽门螺杆菌药敏检测中的应用。

本发明还提供了一种幽门螺杆菌药敏判读工具，其在基底表面设置指示环；所述指示环由2个同心圆及其圆心组成，所述同心圆的直径分别为1.5cm、2.4cm。

本发明实施例中，所述基底为培养皿底部或卡片。

所述卡片为圆形，直径为10cm。所述指示环的个数为4个。

所述培养皿的直径为10cm，所述指示环的个数为4个。

本发明还提供了一种幽门螺杆菌药敏检测试剂盒，包括本发明提供的培养基及本发明所述的指示工具。

本发明还提供了一种幽门螺杆菌药敏检测方法，将待测幽门螺杆菌菌株涂布至本发明培养基上，在培养基表面放置含有待测药物的药敏片，然后转入85vol％N₂、5vol％O₂和10vol％CO₂环境内37℃培养4天，以本发明所述的指示工具判断药敏情况。

本发明中，药敏片放置在指示环的圆心对应位置。

所述待测菌株由分离培养菌株以生理盐水重悬后进行涂布；所述重悬至菌株密度为0.8×10⁵CFU/mL～1.2×10⁵CFU/mL。

所述待测菌株的分离培养采用的培养基为含有抗生素的本发明所述培养基。

具体的，分离培养基中含有本发明所述培养基和万古霉素9mg/L～12mg/L；甲氧苄氨嘧啶3mg/L～6mg/L；两性霉素3mg/L～6mg/L；多粘菌素3mg/L～6mg/L。

本发明中，所述判断具体为：抑菌圈超出外部同心圆为敏感；抑菌圈位于外部同心圆与内部同心圆之间为中度敏感，抑菌圈小于内部同心圆为耐药。

所述待测菌株的分离培养采用幽门螺杆菌选择分离培养基。

所述药敏片的直径为0.6cm。

所述待测药物分别为甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、利福平、红霉素、四环素；所述待测药物在药敏片上的含量依次为5μg、10μg、15μg、5μg、5μg、5μg、15μg、5μg。

本发明提供了用于幽门螺杆菌药敏检测的培养基和指示工具，该培养基配方合理，能够很好的控制幽门螺杆菌的生长，使其在检测过程中产生的抑菌圈大小合理，能够配合本发明提供的检测工具使用。根据抗生素药敏片针对特定药物的测试结果，确定不同敏感微生物抑菌圈大小范围，并将这些范围利用肉眼可以明确观察的标志环进行标记。根据抑菌圈同上述指示环的比对，确认相关微生物对特定药敏片荷载药物的敏感程度，比如敏感、中度敏感和耐药。培养皿上有明确的不同药敏片定位标志，本发明操作简便快速、成本低、稳定性好，直观可靠，准确性可达100％。

附图说明

图1实施例1的耐药检测卡。

具体实施方式

本发明提供了幽门螺杆菌药敏检测培养基及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1耐药检测卡

检测卡的基底为圆形卡片，卡片表面设置指示环；

卡片直径10cm，设置4个指示环，4个指示环不相互重叠。

每个指示环由2个同心圆及其圆心组成，同心圆的直径分别为1.5cm、2.4cm。

同心圆中的小圆记为M圈，大圆记为S圈。

实施例2耐药检测培养皿

检测工具的基底为圆形培养皿底部，表面设置指示环；

培养皿直径10cm，设置4个指示环，4个指示环不相互重叠。

同心圆中的小圆记为M圈，大圆记为S圈。

实施例3培养基

按照表1配方配制培养基：

表1培养基配方

	组1	组2	组3
				牛心浸出物	250mL/L；	250mL/L；	250mL/L；
牛脑浸出物	200mL/L；	200mL/L；	200mL/L；
				半胱氨酸	1g/L；	5g/L；	2g/L；
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	12g/L；	10g/L；	10g/L；
				蛋白胨	4g/L；	8g/L；	5g/L；
NaCl	3g/L；	0.5g/L；	1g/L；
				琼脂粉	20g/L。	30g/L。	25g/L。

按配方将牛心浸出物、牛脑浸出物、半胱氨酸、Na₂HPO₄、蛋白胨、NaCl、加蒸馏水至1000mL混合之后，加热溶解，然后用滤纸过滤，调整pH值到7.2±0.1，分装800mL/瓶，于高压蒸汽灭菌锅内高压灭菌，121℃灭菌20min，冷却至室温后密封，4℃保存备用。

取一定量以上4℃保存的营养液，按每1L加入25g琼脂粉的量加入琼脂粉，然后121℃，高压灭菌20min；按每1L培养基加100mL新鲜绵羊血的量加入新鲜绵羊血；充分混匀之后倒平板；(每个平板需要30mL培养基，注意避免产生气泡，倒好之后将平板水平放置，动作迅速，以免液体培养基凝固无法倒平板。)待平板冷却凝固之后，装入无菌密封袋，密封，4℃存放。

本实施例采用的平板为实施例2所述的培养皿，若采用普通市售平板，则以实施例1所述的检测卡作为检测的指示标志。

药敏检测

随机选取10株幽门螺杆菌，现有技术鉴定其耐药情况。

1、涂布菌液制备：

用灭菌的生理盐水分别将上述菌样从HP分离培养基稀释至浓度为1×10⁵CFU/mL，涂布1ml样本至实施例1中组1制备的药敏检测培养基。

2.待样本涂布均匀后，用无菌镊子按上下左右的顺序依次放入四种药敏片(药敏片上)，药敏片放置的位置对应检测工具上的圆心，轻压，使药敏片紧贴培养基，待测药物为甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左旋诺氟沙星；其药敏片上的含量依次为5μg、10μg、15μg、5μg。

3.培养基放入装有85％N2、5％O₂和10％CO₂混合气体的密封罐里，37℃培养4天。

四天后，根据抑菌圈大小，判断耐药性。

所述判断具体为：抑菌圈大于S圈为敏感；抑菌圈小于S圈而大于M圈为中度敏感，抑菌圈小于M圈为耐药。

对10株菌的检测结果如表2：

表2药敏检测结果

备注：表格中S为敏感；M为中度敏感；R为耐药。

检测结果表明，在组1培养基与检测卡的配合下，对药物敏感性的检测准确性可达100％，完全符合预期。

同时对实施例1中组2和组3培养基的准确性进行检测，其中，组2培养的准确性为90％，组3培养基的准确性为80％。分析认为导致准确性降低的原因可能与营养成分不当，菌株自身生长不佳有关。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种幽门螺杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于，包括培养基和判读工具；

所述培养基的pH值为7.2±0.1，其由绵羊血和营养液组成；所述绵羊血与营养液的体积比为1∶(8～10)；所述营养液由水和如下组分组成：

所述判读工具在基底表面设置指示环；所述指示环由2个同心圆及其圆心组成，所述同心圆的直径分别为1.5cm、2.4cm；所述基底为培养皿底部或卡片；所述卡片为圆形，直径为10cm；所述指示环的个数为4个；所述培养皿的直径为10cm，所述指示环的个数为4个。

2.一种幽门螺杆菌药敏判读方法，其特征在于，将待测幽门螺杆菌菌株接种至权利要求1中所述的培养基上，在培养基表面放置含有待测药物的药敏片，然后转入85vol％N₂、5vol％O₂和10vol％CO₂环境内37℃培养5天，以权利要求1中所述的判读工具判断药敏情况；药敏片放置在指示环的圆心对应位置。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测菌株由分离培养菌株以生理盐水重悬后进行涂布；所述重悬至菌株密度为0.8×10⁵CFU/mL～1.2×10⁵CFU/mL。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述所述待测菌株的分离培养采用的培养基为含有抗生素的培养基；所述培养基为权利要求1中所述的培养基。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，分离培养基中含有权利要求1所述的培养基和万古霉素9mg/L～12mg/L；甲氧苄氨嘧啶3mg/L～6mg/L；两性霉素3mg/L～6mg/L；多粘菌素3mg/L～6mg/L。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述药敏片的直径为0.6cm。

7.根据权利要求2～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述判断具体为：抑菌圈超出外部同心圆为敏感；抑菌圈位于外部同心圆与内部同心圆之间为中度敏感，抑菌圈小于内部同心圆为耐药。