CN114958918B - 猪nlrp6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，属于基因工程技术领域，将NLRP6基因启动子连接到pGL3‑Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体；所述NLRP6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明明确了NLRP6基因启动子在NLRP6基因中的具体位置，将NLRP6基因启动子连接到pGL3‑Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体具有转录活性。

Description

猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体。
背景技术
病毒入侵宿主细胞后，首先被宿主模式识别受体(PRRs)所识别。宿主的模式识别受体常见的有Toll样受体家族(TLRs)、NOD样受体家族(NLRs)、RIG-I样受体家族(RLRs)和DNA识别受体等。其中NOD样受体主要参与炎症因子的诱导表达等过程，是重要的模式识别受体，与其他几类受体共同参与调节机体的免疫应答。NLRP6不同于其它NLRs，其呈现组织和细胞特异性表达，在肠道中高表达，在维持肠道微生物稳态和抗细菌免疫方面发挥重要作用。最近研究者用脑心肌炎病毒(EMCV)和鼠诺如病毒(MNV-1)感染模型对其展开研究，发现NLRP6在控制肠道病毒感染方面发挥重要作用。
近年来研究发现NLRP6在黏膜免疫方面发挥重要作用：首先，NLRP6对组织修复至关重要，在野生型小鼠中，肠道损伤可在6天后恢复，但是缺失NLRP6的小鼠肠道损伤难以修复。其次，NLRP6在抗微生物防御方面发挥重要作用。在正常情况下，NLRP6炎性小体调节IL-1β和IL-18的分泌，IL-18维持肠道上皮细胞增殖、抵御微生物感染、通过诱导抗微生物肽和防御素的分泌维持非致病性肠道微生物群，从而维持健康的肠道环境。此外，NLRP6的表达还有助于粘液释放到肠腔中。因此，在NLRP6缺失的小鼠中，组织修复、肠上皮细胞增殖和抗微生物防御都是受损的，缺乏NLRP6也会影响粘液的产生，进而导致细菌附着增加，并导致更严重的炎症发生。但是现有技术中还未确定NLRP6基因启动子具体位置。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，本发明能够明确NLRP6基因启动子在NLRP6基因中的具体位置。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种基于猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，将NLRP6基因启动子连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体；
所述NLRP6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
优选的，所述双荧光素酶为萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。
本发明还提供了上述技术方案所述的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以猪小肠上皮细胞IPEC-J2全基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到NLRP6基因启动子；
2)将所述步骤1)得到的NLRP6基因启动子经T4连接酶连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体。
优选的，所述步骤1)PCR扩增使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQID No.4所示；
使用的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
优选的，所述PCR扩增的体系每50μL含有2×KOD Fx buffer 25μL、2mM dNTP 10μL、10μM上游引物1.5μL、10μM下游引物1.5μL、KOD Fx DNA聚合酶1μL、20ng/μL模板3μL和双蒸水8μL。
优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火30s；68℃延伸50s，30个循环；68℃终延伸10min。
优选的，所述步骤2)NLRP6基因启动子和pGL3-Basic质粒在连接前分别使用KpnI和Hind III双酶切处理。
优选的，所述连接的体系每10μL含有双酶切NLRP6基因启动子7μL、双酶切pGL3-Basic质粒1μL、T4连接酶buffer 1μL和T4连接酶1μL；
所述连接的条件包括：25℃1h。
本发明还提供了上述技术方案所述的双荧光素酶报告基因载体在转录猪NLRP6基因中的应用。
优选的，所述双荧光素酶报告基因载体经细菌脂多糖和腺嘌呤核苷三磷酸处理；
所述细菌脂多糖、腺嘌呤核苷三磷酸的终浓度分别为1.0μg/mL和2.5μmol/L。
本发明明确了NLRP6基因启动子在NLRP6基因中的具体位置，将NLRP6基因启动子连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体具有转录活性。
附图说明
图1为PCR扩增NLRP6基因的启动子片段，其中，M：DNA标准参照物；1，2：NLRP6及基因扩增产物；
图2为重组质粒pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)的鉴定，其中M：DNA标准参照物；1，2：重组质粒pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)双酶切产物；
图3为萤火虫荧光素酶报告实验检测pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)重组质粒的活性；
图4为LPS/ATP对pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)启动子活性的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种基于猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，将NLRP6基因启动子连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体；所述NLRP6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述NLRP6基因序列的登录号:100519245。在本发明中，所述NLRP6基因启动子为NLRP6 mRNA转录起始位点上游-888到下游+2的位置，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
AAAGGTCACTGAGCAGAGCTCTTAAAAGCTGGCTATATGCTCGTGCCACAGCACCTGAGTTTGGGAGCTCGGTGACCATCGGTGACTGTCGGAAGGACATCTGAGTGTTGGCTGAGCTAGAACACCTGGGTCTGGGGCATG GACGGAGCGGGACAATCCCCTAGGACTTGACTCCAGTTAGCCTGGGGAGAATCACCTCTCTGATCCCCACCTCTGCCCCTGAGTGCTAGACCCAGGGGCCAGACTCTGTGGACCAGCCAGAGGCCTCTTGCTCCAGGTGAGTGCTGGCTTTCAGGGGAGTCACTTGGGAATCGGCTGGTCTCAGCCCCCAGGTCCTCTGCCTCACCCTGCTGACCCCATGGGCCTTCACACCCCTTAGACACAGCCCTCCCCCGTGGCCCTCAGGCTCAGGCTTCTAGGGACTCCATGCTCTCGGAGGGATCTGTGCAGCCTCGGGCCCTCAGACTGACCCCACTCAAGGGTGCAATGTGCATGGGTGTCCTGGGGAATCCAGGAACTCAGTCTGGGCCAGGGAATGAGTGCAGCTCCCTGCTGAGGCCAGCTCTGCTCCAGGCTCCTGGGGAAGAGAAAGGGGGGAAGGAAAGGAAAGGGAGGAAAGGGGAGCCTTTACGAGACTCTTTTGGACATCTTACCTGGGAGGCTTGACTTGGAACGAGGAGGGAGGTGCGGAGCAGGATGGCGCCCCCTAGCGCTTAAGTCACCGGCGGCCAGTGCCCGCCCGGGAGTGGCCCCACTTCACCACCAAACCGCGATGCAGCCAGCGCCAAAGCCTTGGAACGCCGCGGAGCAAAGCCCCCGATCGGGGTCCTGGAGGGGAAGACGACCCTCCCCGTAGAGCGCTACCCAGCTTTGGCCTGGAGCCACCTGAT。
在本发明中，所述NLRP6基因启动子为NLRP6 mRNA转录起始位点上游-472到下游+2的位置，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
TAGGGACTCCATGCTCTCGGAGGGATCTGTGCAGCCTCGGGCCCTCAGACTGACCCCACTCAAGGGTGCAATGTGCATGGGTGTCCTGGGGAATCCAGGAACTCAGTCTGGGCCAGGGAATGAGTGCAGCTCCCTGCTGAGGCCAGCTCTGCTCCAGGCTCCTGGGGAAGAGAAAGGGGGGAAGGAAAGGAAAGGGAGGAAAGGGGAGCCTTTACGAGACTCTTTTGGACATCTTACCTGGGAGGCTTGACTTGGAACGAGGAGGGAGGTGCGGAGCAGGATGGCGCCCCCTAGCGCTTAAGTCACCGGCGGCCAGTGCCCGCCCGGGAGTGGCCCCACTTCACCACCAAACCGCGATGCAGCCAGCGCCAAAGCCTTGGAACGCCGCGGAGCAAAGCCCCCGATCGGGGTCCTGGAGGGGAAGACGACCCTCCCCGTAGAGCGCTACCCAGCTTTGGCCTGGAGCCACCTGAT。
在本发明中，所述双荧光素酶优选为萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。
本发明还提供了上述技术方案所述的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以猪小肠上皮细胞IPEC-J2全基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到NLRP6基因启动子；
2)将所述步骤1)得到的NLRP6基因启动子经T4连接酶连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体。
本发明以猪小肠上皮细胞IPEC-J2全基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到NLRP6基因启动子。
本发明对提取猪小肠上皮细胞IPEC-J2全基因组DNA的提取方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规提取方法提取即可。
在本发明中，所述PCR扩增使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示，具体如下：
SEQ ID No.3：5'-CGGGGTACCTCAGGCTTCTAGGGACTCCATGC-3'；
SEQ ID No.4：CGGGGTACCAAAGGTCACTGAGCAGAGCTCTT-3'；
下划线部分为保护性碱基，斜体部分为KpnI限制性核酸内切酶识别序列。
在本发明中，使用的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：
5'-CCCAAGCTTCCAAAGCTGGGTAGCGCTCTA-3'，下划线部分为保护性碱基，斜体部分为Hind III限制性核酸内切酶识别序列。
在本发明中，所述SEQ ID No.3和SEQ ID No.5扩增SEQ ID No.2；所述SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5扩增SEQ ID No.1。
在本发明中，所述PCR扩增的体系每50μL优选含有2×KOD Fx buffer25μL、2mMdNTP 10μL、10μM上游引物1.5μL、10μM下游引物1.5μL、KOD Fx DNA聚合酶1μL、模板(20ng/μL)3μL和双蒸水8μL。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为：94℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火30s；68℃延伸50s，30个循环；68℃终延伸10min。
本发明将得到的NLRP6基因启动子经T4连接酶连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体。
在本发明中，所述NLRP6基因启动子和pGL3-Basic质粒在连接前分别使用KpnI和Hind III双酶切处理。在本发明中，所述NLRP6基因启动子用Kpn I和Hind III经37℃2h双酶切，体系为：双蒸水26μL、KpnI 2μL、Hind III 2μL、NLRP6基因启动子(20ng/μL)30μL，总共60μL。将pGL3-Basic质粒用Kpn I和Hind III经37℃2h双酶切，体系为：双蒸水46μL、KpnI2μL、Hind III 2μL、质粒3μg(10μL)，总共60μL。
在本发明中，所述连接的体系每10μL优选含有双酶切NLRP6基因启动子(20ng/μL)7μL、双酶切pGL3-Basic质粒(20ng/μL)1μL、T4连接酶buffer 1μL和T4连接酶1μL。在本发明中，所述连接的条件优选包括：25℃1h。
本发明还提供了上述技术方案所述的双荧光素酶报告基因载体在转录猪NLRP6基因中的应用。在本发明中，所述双荧光素酶报告基因载体经细菌脂多糖和腺嘌呤核苷三磷酸处理；所述细菌脂多糖、腺嘌呤核苷三磷酸的终浓度分别为1.0μg/mL和2.5μmol/L。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与方法
1.1质粒和细胞
pGL3-Basic和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK购自Promega公司。本实施例所使用的细胞包括人胚肾上皮细胞(293T细胞))和猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)，分别培养在含有10％血清(美国Gibco公司)的DMEM(美国Gibco公司)中；培养基中含10μg/m L链霉素和100U/m L青霉素，所有细胞均培养在37℃、5％CO2条件下的恒温培养箱中。
1.2试剂
本实施例所用的PCR引物由吉林库美生物科技有限公司合成；PCR高保真酶(KODplus)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；细胞总RNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；质粒小提试剂盒及凝胶纯化试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒及感受态大肠埃希菌DH5α购自北京天根生化科技有限公司；LPS和ATP购自Sigma；限制性内切酶Hind III和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；T4 DNA连接酶(美国纽英伦生物技术公司)；质粒转染试剂LipofectamineTM 2000(美国Invitrogen公司)；Dual-Glo LuciferaseAssay System(美国Promega公司)。
1.3方法
1.3.1全基因组DNA的提取
提取猪小肠上皮细胞IPEC-J2的全基因组DNA作为猪NLRP6
启动子区域序列PCR扩增的模板。首先，选取汇合度为80％的IPEC-J2细胞，经胰酶消化后，用含有10％血清的完全DMEM终止消化，室温800×g离心5min，弃上清液；PBS重悬后再次离心弃上清液，根据血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书提取IPEC-J2基因组DNA。
1.3.2 PCR扩增猪NLRP6启动子序列
通过在NCBI Genbank数据库中查询猪NLRP6基因序列(登录号:100519245)和真核生物启动子数据库(Eukaryotic Promoter Database，EPD)，获得包含可能的启动子及转录调节区域的猪NLRP6基因序列(-888～+2bp)。利用oligo 6.24软件设计PCR扩增引物扩增启动子的两个不同长度片段。
上游引物：
-472F：5'-CGGGGTACCTCAGGCTTCTAGGGACTCCATGC-3'；
-888F：5'-CGGGGTACCAAAGGTCACTGAGCAGAGCTCTT-3'(下划线部分为保护性碱基，斜体部分为KpnI限制性核酸内切酶识别序列)；
下游引物5'-CCCAAGCTTCCAAAGCTGGGTAGCGCTCTA-3'(下划线部分为保护性碱基，斜体部分为Hind III限制性核酸内切酶识别序列)。
以提取的IPEC-J2全基因组DNA为模版，PCR扩增猪NLRP6启动子序列，扩增体系为：2ⅹKOD Fx buffer 25μL,2mM dNTP 10μL,10μM上游引物1.5μL，10μM下游引物1.5μL，KODFx DNA聚合酶1μL(ToYoBo Co.),DNA模板(20ng/μL)3μL，双蒸水8μL，总共50μL体系。扩增程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火30s；68℃延伸50s，30个循环；68℃终延伸10min。通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物条带在正确的位置后，进行切胶回收纯化。
1.3.3pGL3-NLRP6-promoter质粒的构建及鉴定
将上述切胶回收产物用Kpn I和Hind III经37℃2h双酶切，体系为：水26μL、KpnI2μL、Hind III 2μL、切胶回收产物(20ng/μL)30μL，总共60μL；将pGL3-Basic质粒用Kpn I和Hind III经37℃2h双酶切，体系为：水46μL、KpnI 2μL、Hind III 2μL、质粒3μg(10μL)，总共60μL。酶切后的产物和pGL3-Basic质粒用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(Axygen)。取纯化后的产物和质粒进行连接：双酶切胶回收产物7μL，双酶切pGL3-Basic质粒1μL，T4连接酶buffer 1μL，T4连接酶1μL，连接体系为10μL。连接条件为25℃1h。将连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，涂布于具有氨苄西林抗性的LB平板，37℃培养过夜。次日，随机挑选单克隆菌落于LB培养基中振荡培养、大量扩增并提取质粒。将提取的重组质粒进行Kpn I和HindIII双酶切鉴定，同时测定核酸序列，并利用DNAstar软件比对测序结果。
1.3.4萤火虫荧光素酶报告实验检测细菌脂多糖LPS和腺嘌呤核苷三磷酸(LPS/ATP)对NLRP6启动子活性的影响
将IPEC-J2细胞接种在48孔板中，待细胞密度达到80-90％时，使用LipofectamineTM 2000将pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)重组质粒各1μg、p GL3-Basic空载体1μg分别与内参pRL-TK质粒50ng共转入IPEC-J2细胞，2h后加入终浓度为1.0μg/mL的LPS和2.5μmol/L的ATP。24h后，收取细胞，根据Dual-GloLuciferaseAssay System试剂盒(Promega)说明书检测相应组别的荧光素酶活性，每组相对荧光素酶活性的值等于每组中每个独立实验的萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶检测值比值的平均值。
1.3.5与猪NLRP6启动子结合的转录因子的预测
将NLRP6启动子序列输入在线软件PROMO
(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB＝TF_8.3)中，根据网站提示进行操作，输出可以与NLRP6启动子序列结合的转录因子的预测结果。
1.4统计学方法
使用Graphpad 8.0对数据进行统计分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1pGL3-NLRP6-promoter重组质粒的构建及鉴定
通过查询NCBI数据库以及相关资料，获得NLRP6启动子的范围，为NLRP6 mRNA转录起始位点上游-888到下游+2的位置。根据该序列设计扩增引物分别扩增-888/+2以及-472/+2的片段，以IPEC-J2全基因组DNA为模版进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增片段分别为890bp和474bp，与目标DNA长度一致(图1)。
对pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)重组质粒进行KpnⅠ和Hind III双酶切鉴定，结果可见2条特异性片段，分别约为4817bp(载体片段)和890bp以及4817bp和474bp(图2)。重组质粒测序比对结果显示，插入的NLRP6启动子序列与理论序列一致，表明pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)重组质粒构建成功。
2.2pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)重组质粒活性的验证
为验证克隆得到的猪NLRP6基因启动子区是否具有转录活性，将报告质粒pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)、pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)和pGL3-Basic空载体分别与pRL-TK海肾荧光素酶报告质粒(内参)共转染293T细胞。荧光素酶活性检测结果显示，表达pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)细胞中的荧光素酶活性，较无启动子活性的pGL3-Basic阴性对照增加约4倍(P＜0.05)，而表达pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)细胞中的荧光素酶活性，较无启动子活性的pGL3-Basic阴性对照增加约7倍(P＜0.01)，表明猪NLRP6基因启动子位于-888～+2bp区域，并且pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)的转录活性显著高于pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)。
2.3LPS/ATP对NLRP6启动子活性的影响
萤火虫荧光素酶报告实验结果显示，与对照组相比，LPS/ATP处理组pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)和pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)的萤火虫荧光素酶活性明显高于对照组，表明LPS/ATP能够激活NLRP6启动子转录活性。并且转染pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)的萤火虫荧光素酶活性显著高于pGL3-NLRP6-promoter(-888/+2)，表明pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)具有更高的转录活性(图4)。
2.4与NLRP6启动子结合的转录因子的预测
运用在线软件PROMO对NLRP6启动子区域(-888/+2)区域进行分析，预测出339个可能与NLRP6启动子序列结合的转录因子，其中278个位于-472/+2的位置，如NF-κB、IRF1、IRF2、IRF3、STAT4和ATF3等与炎症反应和抗病毒天然免疫相关，这也与pGL3-NLRP6-promoter(-472/+2)具有更高的转录活性相一致。这些转录因子的预测为进一步探索调控NLRP6表达的分子机制奠定了基础。
表1NLRP6启动子转录因子结合位点的部分预测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 一种基于猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体
<141> 2022-06-10
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 890
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aaaggtcact gagcagagct cttaaaagct ggctatatgc tcgtgccaca gcacctgagt 60
ttgggagctc ggtgaccatc ggtgactgtc ggaaggacat ctgagtgttg gctgagctag 120
aacacctggg tctggggcat ggacggagcg ggacaatccc ctaggacttg actccagtta 180
gcctggggag aatcacctct ctgatcccca cctctgcccc tgagtgctag acccaggggc 240
cagactctgt ggaccagcca gaggcctctt gctccaggtg agtgctggct ttcaggggag 300
tcacttggga atcggctggt ctcagccccc aggtcctctg cctcaccctg ctgaccccat 360
gggccttcac accccttaga cacagccctc ccccgtggcc ctcaggctca ggcttctagg 420
gactccatgc tctcggaggg atctgtgcag cctcgggccc tcagactgac cccactcaag 480
ggtgcaatgt gcatgggtgt cctggggaat ccaggaactc agtctgggcc agggaatgag 540
tgcagctccc tgctgaggcc agctctgctc caggctcctg gggaagagaa aggggggaag 600
gaaaggaaag ggaggaaagg ggagccttta cgagactctt ttggacatct tacctgggag 660
gcttgacttg gaacgaggag ggaggtgcgg agcaggatgg cgccccctag cgcttaagtc 720
accggcggcc agtgcccgcc cgggagtggc cccacttcac caccaaaccg cgatgcagcc 780
agcgccaaag ccttggaacg ccgcggagca aagcccccga tcggggtcct ggaggggaag 840
acgaccctcc ccgtagagcg ctacccagct ttggcctgga gccacctgat 890
<210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tagggactcc atgctctcgg agggatctgt gcagcctcgg gccctcagac tgaccccact 60
caagggtgca atgtgcatgg gtgtcctggg gaatccagga actcagtctg ggccagggaa 120
tgagtgcagc tccctgctga ggccagctct gctccaggct cctggggaag agaaaggggg 180
gaaggaaagg aaagggagga aaggggagcc tttacgagac tcttttggac atcttacctg 240
ggaggcttga cttggaacga ggagggaggt gcggagcagg atggcgcccc ctagcgctta 300
agtcaccggc ggccagtgcc cgcccgggag tggccccact tcaccaccaa accgcgatgc 360
agccagcgcc aaagccttgg aacgccgcgg agcaaagccc ccgatcgggg tcctggaggg 420
gaagacgacc ctccccgtag agcgctaccc agctttggcc tggagccacc tgat 474
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cggggtacct caggcttcta gggactccat gc 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cggggtacca aaggtcactg agcagagctc tt 32
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cccaagcttc caaagctggg tagcgctcta 30

Claims (10)

1.一种基于猪NLRP6基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，将NLRP6基因启动子连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体；
所述NLRP6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，所述双荧光素酶为萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。
3.权利要求1或2所述的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以猪小肠上皮细胞IPEC-J2全基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到NLRP6基因启动子；
2)将所述步骤1)得到的NLRP6基因启动子经T4连接酶连接到pGL3-Basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
使用的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系每50μL含有2×KODFxbuffer25μL、2mMdNTP10μL、10μM上游引物1.5μL、10μM下游引物1.5μL、KODFxDNA聚合酶1μL、20ng/μL模板3μL和双蒸水8μL。
6.根据权利要求3～5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火30s；68℃延伸50s，30个循环；68℃终延伸10min。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)NLRP6基因启动子和pGL3-Basic质粒在连接前分别使用KpnI和HindIII双酶切处理。
8.根据权利要求3或7所述的构建方法，其特征在于，所述连接的体系每10μL含有双酶切NLRP6基因启动子7μL、双酶切pGL3-Basic质粒1μL、T4连接酶buffer1μL和T4连接酶1μL；
所述连接的条件包括：25℃1h。
9.权利要求1或2所述的双荧光素酶报告基因载体在转录猪NLRP6基因中的应用，所述应用为非治疗和诊断目的的。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述双荧光素酶报告基因载体经细菌脂多糖和腺嘌呤核苷三磷酸处理；
所述细菌脂多糖、腺嘌呤核苷三磷酸的终浓度分别为1.0μg/mL和2.5μmol/L。
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