CN114958866A

CN114958866A - 调控大豆分枝数的基因及其用途

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Publication number: CN114958866A
Application number: CN202210497737.3A
Authority: CN
Inventors: 田志喜; 梁前进; 刘书林; 张敏; 周国安; 潘毅; 路兴通
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-05-09
Also published as: CN114958866B

Abstract

本发明提供分离的调控大豆分枝数的基因及启动子，以对大豆的分枝数进行调控，从而提高大豆的产量。本发明对于大豆高产育种及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。

Description

调控大豆分枝数的基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及调控大豆分枝数的基因及其用途。

背景技术

大豆是起源于我国的一种重要的粮油作物。大豆富含蛋白质，是优质的植物蛋白来源，也是动物重要的饲料来源，在国民经济生活各方面均发挥着不可替代的作用。近几十年以来，我国大豆生产一直徘徊不前，但消费需求增长迅猛，提高大豆产量，对确保我们国家的粮食安全，把中国人的饭碗牢牢地把握在自己手里具有重大的意义。

大豆株型是影响其产量形成的关键因素，合理的空间构型对大豆光合作用效率有着很大影响，通过改良大豆的叶部、分枝以及节间等株型相关性状，可以直接影响大豆冠层的通风透光能力，进而会提高大豆中上部叶片的光截获率和光能利用率，最终会提高大豆的生物产量(高洁等，2017)。大豆分枝数是株型的一个主要性状。过多的分枝容易过度消耗植株的营养，影响后期的结荚，而分枝过少会导致整株的花荚减少，降低产量。植物分枝在受遗传因子决定的同时，也易受环境条件的影响，因此了解分枝发育过程和产生机理，解析其形成的分子调控机制，对后续基因的克隆和功能研究具有重要理论和应用价值(巩鹏涛等，2005)。

MADS-box转录因子家族基因在植物的生长发育中扮演着重要角色，在拟南芥中主要参与早期花序分生组织发育的过程，是花器官形成的特征基因(Becker et al.,2003)。然而在大豆中MADS-box家族基因很少被鉴定 (Zheng et al.,2013)，或者鉴定出其功能主要和茎生长习性以及开花相关 (Ping et al.,2014；Liu et al.,2016；Zeng et al.,2018；Zhang et al.,2019)，但是否影响分枝数尚未被报道。

因此，探索研究大豆中MADS-box家族成员对大豆分枝发育的调控机制具有重要意义，对改善提高大豆的产量和品质具有十分重要的意义。

发明内容

为进一步改善提高大豆的产量和品质，本发明通过关联分析法在全基因组水平上对大豆分枝数等复杂产量性状的遗传调控位点进行解析，通过整合单倍型、基因表达谱、同源基因功能注释和以往大豆分枝数相关QTL 信息，运用分子生物学和比较基因组学的手段，克隆到了调控大豆分枝数及产量的相关基因SoyZH13_18G242900(Dt2)，为后续分子辅助育种和分子设计育种提供理论基础和基因资源。

具体来说，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供分离的调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的基因，其特征在于，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示。

另一方面，本发明提供调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6 所示。

另一方面，本发明提供分离的调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的基因的启动子，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本发明提供表达载体，其特征在于，所述表达载体包含针对上述的基因设计的sgRNA靶点序列

在一些实施方案中，所述表达载体具有抗生素标记或抗化学试剂标记。

另一方面，本发明提供植物细胞，其导入了上述的表达载体。

另一方面，本发明提供调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的基因在调控大豆分枝数或提高大豆产量中的应用，其中所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

另一方面，本发明提供提高豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆产量或调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的方法，其特征在于，所述方法包括对上述基因的功能进行失活的步骤，优选地，通过基因敲除使所述基因功能失活。

另一方面，本发明提供提高豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆产量或调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的方法，其特征在于，所述方法包括：

a.针对上述基因设计sgRNA序列，将sgRNA靶点序列导入表达载体；

b.将所述表达载体导入农杆菌；和

c.用所述农杆菌转染豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆或豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆组织。

在一些实施方案中，所述sgRNA的靶点序列如SEQ IN NO:9和SEQ ID NO:10所示。

在一些实施方案，所述表达载体选自PMDC123和PTF101。

在一些实施方案中，所述农杆菌选自EHA105、EHA101和GV3101。

在一些实施方案中，所述转染方法选自子叶节转化方法和胚尖外植体转化方法。

定义

BLUP数据：最优线性无偏估计(best linear unbiased prediction-简称 BLUP)，属于混合线性模型的应用。主要通过最小二乘法原理，使其获得的估计值为其误差方差的最小的无偏估计，该模型可以把多次记录的、多性状、多环境下的因素合并到一起进行综合的估计，最大限度的减少环境和人为误差对表型数据的干扰，从而更好的反应表型和基因型之间的关系。

QQ图：分位数-分位数图(Quantile-Quantile Plot)是通过比较两个概率分布的分位数对这两个概率分布进行比较的概率图方法，主要反应实际的样本点是否符合一种概率分布。

启动子：通常是指位于转录起点上游的一段DNA序列，其含有能够与RNA聚合酶结合并负责调控基因的转录的区域。启动子序列是图2中所示的DNA分子，即位于Dt2起始密码子上游3500-bp的序列，包括两种类型的序列。本发明的启动子序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，其在瞬转启动子活性实验中有功能，表现为SEQ ID NO:2具有更强的启动子活性。瞬转启动子活性实验是利用双荧光素酶报告系统，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列分别连接到报告载体并转化到农杆菌GV3101 中，通过侵染烟草叶片后，用荧光素检测仪器来检测不同报告载体的荧光素强度，从而来比较不同序列对报告基因的启动子活性。

CDS(Coding sequence)：编码区，能够编码蛋白质的一段DNA序列，含有起始密码子和终止密码子。本发明的CDS序列含有一个MADS-box 结构域和K-box结构域。

负调控：能够抑制或减弱基因转录水平的调控。通常是阻遏蛋白与操作基因结合使RNA聚合酶不能够与启动子结合而抑制转录。本发明通过基因过表达证实本发明所获得的基因为负调控基因，其表达导致植株的分枝数变少，株高降低，单株产量及小区产量均显著减少。

sgRNA靶点序列：sgRNA(small guide RNA)是小向导RNA(guide RNA，gRNA)，在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体中，属于一种小型非编码RNA，可与pre-mRNA配对。向导RNA编辑的 RNA分子，长度大约是60～80个核苷酸，是由单独的基因转录的，具有 3'寡聚U的尾巴，中间有一段与被编辑mRNA精确互补的序列，5'端是一个锚定序列，它同非编辑的mRNA序列互补。

CRISPR-Cas9：CRISPR-Cas9技术包含两种重要的组分，一种是行使 DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA (guide RNA)。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导 Cas9核酸酶对特异靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链或单链断裂，然后，细胞会利用自身具备的DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，从而引起碱基的错配或缺失，以达到对目的基因进行定向编辑的功能。随着近年来分子生物学的快速发展，已广泛应用于众多领域。不仅可用于表达调控和基因功能的研究、细胞动物模型的构建、癌基因和药物靶点的筛选，在基因治疗中更是具有巨大的发展前景，为多种疾病提供了新的治疗方法。

同源序列：特指直系同源(orthologous)内不同物种之间的同源性，例如蛋白质的同源性，DNA序列的同源性。

有益效果

本发明提供的大豆分枝数相关基因核苷酸及其编码蛋白均为申请人的首次发现，且经过转基因植株的表型分析验证说明本发明的大豆分枝数相关蛋白能够负调控大豆转基因植株分枝数。

本发明对于大豆高产育种及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。

附图说明

图1显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2或Dt2^HapI-2)基因的克隆。其中，A:大豆分枝数性状BLUP(育种值)数据的全基因组关联分析；B:分枝数性状的QQ(正态分布)点图； C:分枝数在18号染色体的关联分析展示；D:候选区间内所有基因的大小分布示意图(其中白色框为候选基因所在位置)及候选区间内所有SNPs 的连锁分析；E:连锁关联区域内基因的表达模式分析；F:Dt2的基因结构示意图；G:Dt2的三种主要单倍型结构(其中，HapI-1为多分枝的单倍型； HapI-2为中间型分枝的单倍型，HapII为少分枝的单倍型)。a、b表示邓肯氏复极差检验显著性排布。H:14份Dt2单倍型I材料(灰色圆圈)和6 份单倍型II型材料(黑色圆圈)的分枝数与Dt2表达量之间的相关关系。 I:Dt2单倍型I和单倍型II之间的启动子活性分析。其中**代表P<0.01。

图2显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2)基因起始密码子上游3500bp的两种启动子核苷酸序列示意图。其中，红色加深背景碱基为Dt2启动子突变碱基位置。

图3显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2)基因的两种单倍型CDS核苷酸序列示意图。其中，红色加深背景碱基为Dt2编码区CDS突变碱基位置。

图4显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2)基因的两种单倍型蛋白的氨基酸序列示意图。其中，红色加深背景碱基为Dt2氨基酸序列突变碱基位置。

图5显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2)基因的特异CRISPR-Cas9靶点设计示意图。其中，A：Dt2 特异性靶点设计，大写字母序列代表靶序列；B：靶序列sgRNA在 CRISPR/Cas9体系中的部分载体结构示意图。C-D：Dt2不同的编辑单株事件。其中C为Dt2敲除系1，缺失1个碱基；D为Dt2敲除系2，缺失 19个碱基。

图6显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2或Dt2^HapI-2)基因的敲除突变体与野生型WT(东农50)的表型统计比较。其中，A-B：DN50野生型和Dt2-敲除突变体的转基因植株的田间表型对比，比例尺为10cm；

图7显示了SoyZH13_18G242900(W82版本基因号：Glyma.18G273600，也称为Dt2或Dt2^HapI-2)基因转化载体35S::Dt2^HapI-2的图谱示意图。

图8显示了野生型(东农50)和转染35S::Dt2^HapI-2质粒获得的转基因植株Dt2过表达系的表型统计比较。其中，A：DN50野生型和Dt2过表达转基因植株的田间表型对比，比例尺为10cm；B：DN50野生型和Dt2过表达转基因植株的分枝能力对比，比例尺为10cm；C：不同Dt2的过表达家系的Dt2表达量分析。

图9显示了Dt2过表达系、Dt2敲除系与野生型东农50材料间的分枝数、株高、开花期、百粒重、单株粒重以及小区产量的统计。包括样本数量，数据范围，均值±标准差以及Dt2过表达系、Dt2敲除系与野生型东农 50的比值显著性，显著性检验采用双尾T检验。

图10显示了Dt2敲除系与野生型(东农50)在不同种植密度下小区产量统计比较。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

以下的实施例是为了便于更好地理解本发明，但并不用于限定本发明。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

在下述实施例中，转化受体为东农50(DN50)，DN50为黑龙江省审定品种(黑审豆2007022)，可以从市面购买得到。pTF101.1载体和农杆菌菌株EHA101、EHA105购自中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心 (Biovector Science Lab,Inc)。

酶切回收试剂盒等耗材购自New England Biolabs和天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1、Dt2基因及其编码蛋白以及启动子变异的分析

本发明人通过两年对分枝数进行表型鉴定，对结果进行BLUP处理后结合全基因组关联分析，在18号染色体上发现一个稳定的和分枝数紧密关联的信号。结合转录组数据在大量序列分析和功能验证的基础上，发现一个编码大豆分枝数基因的蛋白质，将其命名为Dt2蛋白(简称为Dt2)，将编码Dt2蛋白的基因命名为Dt2(或称为Dt2^HapI-2)基因。

进一步对该基因进行基因结构分析，发现在其ATG上游启动子区域 3259bp和2580bp处存在2个显著关联的主要变异，同时在编码区98bp 处发现了一个能改变氨基酸的非同义突变(图1F)。对该3种变异进行单倍型发现发现(图1G)，3种变异可以分为3种类型的单倍型：单倍型 HapI-1(Dt2^HapI-1)，单倍型HapI-2(Dt2^HapI-2)，单倍型HapII(Dt2^HapII)。考虑到只有单倍型HapII有显著差异，说明启动子区变异能显著影响分枝数的变化。所以我们按比例随机选取了单倍型HapI和单倍型HapII共计16份材料进行基因表达量和分枝数之间的相关关系分析，发现基因表达量与分枝数呈显著的负相关(图1H)。将单倍型I和单倍型II的启动子分别连接到报告载体上，在拟南芥原生质体中进行双元荧光素酶瞬时表达实验，发现单倍型II的启动子显著强于单倍型I，表明启动子区变异能够影响Dt2基因的表达量(图1I)。

本发明进一步提供了Dt2基因在大豆基因组中的SNP位点的核苷酸多态性，如图2和图3所示序列差异位点，其可用于检测大豆品种背景。

实施例2、Dt2蛋白的功能验证

一、重组质粒的构建

从野生型东农50(DN50)中提取RNA，并将其反转录成cDNA，将 Dt2^HapI-2基因cDNA进行PCR扩增，然后酶切连接到PTF101.1载体，获得重组质粒35S::Dt2^HapI-2。具体操作如下：

1、将大豆品种DN50的叶片从植株上分离下来，提取RNA，获得大豆品种DN50的叶片RNA。

2、将步骤1获得的总RNA利用反转录试剂盒(全式金)，将其反转录成cDNA。以cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(因为野生型东农50的基因型为Dt2^HapI-2，考虑到本源自身基因型的影响，所以选择了自身基因型Dt2^HapI-2进行了载体构建)。

F1：5’-ATGGGAAGGGGTAGGGTTC-3’(SEQ ID NO:7)；

R1：5’-CTAGTCAGACATGCAGCGCA-3’(SEQ ID NO:8)。

3、用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切PTF101.1载体(购自中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)，回收约9138bp的载体骨架。

4、将步骤2的PCR产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒 35S::Dt2^HapI-2(其图谱见图7)。

二、Dt2^HapI-2过表达转基因植物的获得

1、将重组质粒35S::Dt2^HapI-2导入农杆菌菌株EHA101(购自中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌采用子叶节转化方法(Margieet et al., 2004)转化受体植株DN50，收获T₀代种子。具体步骤如下：

(1)种子灭菌与萌发

挑选圆粒饱满、表面光洁无病斑的DN50(TL)大豆种子于120mm 的培养皿中。将培养皿放入带有烧杯的干燥器中，向烧杯中加入100ml 次氯酸钠溶液和4ml浓盐酸，立即盖好干燥器的盖子，利用氯气对大豆种子灭菌18h，灭菌后在超净台中开盖吹掉残余的氯气。

(2)种子萌发

将灭过菌的大豆种子种脐朝下均匀摆放于萌发培养基GM中，每皿 30-35粒种子。然后用保鲜袋包好，剪好透气口，放入暗培养箱中，萌发条件为22℃，萌发16小时以上。

(3)外植体制备

取萌发好的种子，沿着下胚轴将种子纵切为对称的两部分，在显微镜下轻轻刮去子叶节处的一对真叶，最后在子叶节处用手术刀轻轻点刺几下即为用于转化的外植体。

(4)农杆菌侵染制备

取冻存于-80℃的甘油保存的重组农杆菌35S::Dt2^HapI-2-EHA101置于冰上解冻后，在超净台中用灭菌枪头蘸取少量菌液画线培养于含有Kan(卡那霉素)和Spe(壮观霉素)的YEP固体培养基上，28℃活化培养2天，然后再用涂布器涂布于新的含有Kan与Spe的YEP固体培养基上，培养过夜，最后将培养过夜的农杆菌用侵染液重悬至OD₆₀₀值为0.6即可。该步骤中，YEP固体培养基组分为：1g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，5g/L牛肉膏，5g/L糖，15g/L琼脂，pH 5.7；侵染液组成为：0.31g/L B5(B5培养基基础盐，Phytotech(西美杰)，货号： HYY0768022E)，30g/L葡萄糖，3.9g/L MES(硫酸卡那霉素)，pH 5.5，1‰(w/v)B5维生素，0.25‰(w/v)赤霉素GA3，1.67‰(w/v)六苄基嘌呤 6-BA，1.8‰(w/v)二硫苏糖醇DTT，0.8‰(w/v)乙酰丁香酮AS。

(5)农杆菌侵染及外植体共培养

将前述制备好的用于转化的外植体放入重悬好的农杆菌菌液中，置于 22℃暗培养箱中侵染过夜，然后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液后，将子叶节平铺于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗侵染5天。其中固体培养基除了液体培养基成分外，另加9g/L琼脂。

(6)转基因苗获得

将共培养5天后的子叶节斜插入芽诱导培养基I中，25℃，16h光照 8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，恢复培养7天后转入含8mg/ml的 PPT(草铵膦)的芽诱导培养基II中，继续培养14-20天。将丛生芽从下胚轴切下移入含4mg/ml PPT的芽伸长培养基中，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，每10天继代培养一次，直至芽伸长至5cm 左右为止。将伸长至5cm左右的幼芽切下，直插入生根培养基，25℃， 16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，直至根伸长至3-4cm，准备移栽。

该步骤中，芽诱导培养基I的组成为3.1g/L B5盐(B5培养基基础盐)， 1‰(w/v)B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L硫酸卡那霉素MES，1.6mg/L 六苄基嘌呤6-BA，50mg/L头孢Cef，150mg/L特美矴Tim，4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；芽诱导培养基II的组成为3.1g/L B5盐 (1‰(w/v)B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，1.6mg/L 6-BA，50mg/L Cef，150mg/L Tim，8g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；芽伸长培养基的组成为4.33g/LMS盐(MS培养基基础盐，Phytotech(西美杰)，货号:HHY0524225A)，1‰(w/v)B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES， 0.5mg/L赤霉素GA3，1mg/L玉米素ZR，50mg/L L-Glu草铵膦，50mg/L 天门冬氨酸Asp，0.1mg/L生长素IAA，50mg/L头孢Cef，100mg/L Tim， 4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8；生根培养基的组成为2.165g/L MS盐(MS培养基基础盐)，1‰(w/v)B5维生素，20g/L蔗糖，0.6g/L MES， 50mg/L L-Glu，50mg/L天门冬氨酸Asp，1.5mg/L吲哚丁酸IBA，25mg/L Tim，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8。

(7)炼苗移栽及筛选

将准备移栽的组培苗去掉封口膜，加入少量无菌水，25℃，16h光照 8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，培养两天后移苗，将蛭石与草炭土等量混合均匀，放入加水的托盘中，然后将组培苗从生根培养基中拔出冲洗掉根部残余的培养基，移入充分吸饱水分的营养土中。用0.1％Basta除草剂涂抹大豆叶片，3天后无黄化反应的为转基因阳性植株。

后续T₁代及以后传代转基因株系均喷洒0.1％Basta除草剂(酷来搏， CB2471-100mL)筛选，均抗Basta后即获得成功转入重组质粒35S::Dt2^HapI-2的转基因植株(即过表达Dt2的植株)。其中，图8中的#1、#2指的是转基因株系名称，即共获得2个转基因株系(也叫转基因line)。对于Dt2过表达系是指用35S::Dt2^HapI-2质粒转染获得的转基因植株(图7、图8)，野生型是指DN50植株；并通过提取RNA，检测表达量水平来判断是否过表达成功，通过实时荧光定量PCR检测，发现Dt2的两个过表达株系表达量均显著提高(图8C)，表明转基因株系中Dt2的表达量升高了。

三、Dt2 CRISPR-Cas9敲除突变体植物的获得

1、将Dt2靶点构建到双元表达载体PMDC123质粒(购自中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)中。具体步骤如下：

(1)Dt2靶点连接到中间载体U6中

将靶点序列引物sgRNA1(两条sgRNA在Dt2^HapI-1和Dt2^HapI-2材料中无差异)(5'-tgtagccatacagcacttgc-3'，SEQ ID NO:9)、sgRNA2 (5'-aggaacaccagtggaagaaa-3'，SEQID NO:10)用灭菌水溶解成10μM母液，各取10μL加入80μL 0.5×TE(pH 8.0)里，终浓度为1μM。在PCR 仪中98℃加热3min。自然冷却至室温，并于室温放置2h以上。用BsaI 单酶切U6载体，并利用T₄连接酶将sgRNA与U6(购自中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)连接，转化至大肠杆菌，并涂布于Amp 抗性的LB固体培养基中，37℃过夜，挑取测序正确的菌落，即得到含有靶点的sgRNA1-U6和sgRNA2-U6。

(2)双靶点sgRNA-U6串联

用SpeI、NheΙ双酶切sgRNA2-U6，回收约750bp的产物作为插入片段；同时用SpeI单酶切sgRNA1-U6载体，回收约13,658bp的载体作为骨架载体。利用T₄连接酶将骨架载体与插入片段(sgRNA2-U6双酶切回收产物)连接，转化至大肠杆菌，并涂布于Amp抗性的LB固体培养基中， 37℃过夜，挑取测序正确的菌落，即得到含有双靶点(sgRNA1+sgRNA2，构建双靶点的目的是增大基因编辑的概率，提高基因的编辑效率)的 sgRNA-U6。

(3)双靶点sgRNA-U6无缝克隆到终载体PMDC123质粒

用HindⅢ和PstⅠ酶切终载体PMDC123质粒，回收片段作为骨架载体，同时用含有同源臂的引物扩增含有双靶点的sgRNA-U6，利用全式金的同源重组试剂盒(货号：CU101-01)进行无缝链接构建，转化至大肠杆菌，并涂布于Kan抗性的LB固体培养基中，37℃过夜，挑取测序正确的菌落，即得到含有双靶点带有U6启动子驱动的pro:U6-sgRNA-Cas9的 PMDC123质粒(图5B)。其中，带有同源臂的扩增引物序列(同源臂为终载体PMDC123上部分序列，扩增引物序列为双靶点sgRNA-U6上的部分序列，带下划线部分为同源臂)为：

PMDC123-HindIII-gRNA-F(SEQ ID NO:11)：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACGACTCACTATAGGGCGAATTG

PMDC123-pstI-gRNA-R(SEQ ID NO:12)：

GTGCTCCACCATGTTGACCTGCAGAACAAAAGCTGGAGCTCACTAGT

2、将构建正确的质粒通过电击法导入农杆菌菌株EHA105(购自中国质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心)，得到重组农杆菌。

具体步骤如下：

(1)将约150ng左右的质粒加入到农杆菌菌株EHA105感受态中，冰里放置30分钟；

(2)将电极杯放于超净台中吹至没有酒精味，然后放入冰中冷却待用；

(3)将混有质粒的EHA105感受态加入电极杯中，并用电击仪对其电击；

(4)将700ul左右的无抗生素的LB加入电击后的EHA105感受态中，放于30℃摇床，220rpm下活化1小时后涂布于Kan(卡那霉素)和Rif(利福平)抗性的培养基中，培养2-3天，菌落PCR鉴定正确的菌斑，重新活化即得到重组的待转农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌采用子叶节转化方法(具体操作方法参见过表达构建转化)。转化受体植株DN50，收获T₀代种子。并鉴定其编辑阳性纯合率，从而获得稳定表达的2种不同编辑类型的突变体，Dt2 敲除系1和2的阳性纯合率分别16.7％和8％，(图5)，其中Dt2敲除系 1为第1个靶点缺失1个碱基，造成蛋白序列在第107个氨基酸位置提前终止；Dt2敲除系2为第1个靶点缺失19个碱基，造成蛋白序列在第77 个氨基酸位置提前终止，这两种突变体均造成其蛋白功能丧失。

实施例3、Dt2的转基因表型统计

本实施例验证了在DN50背景下敲除Dt2之后所获得的敲除转基因植株的分枝数变多，平均分枝数百分比分别增加53.7％和50.3％，同时伴随着株高增加(株高增加百分比分别为131.4％和134.6％)，开花期滞后，百粒重增加(百粒重增加百分比分别为33.9％和31.8％)，单株产量(单株产量增加百分比分别为73.1％和74.7％)及小区产量(小区产量增加百分比分别为93.2％和76.2％)均显著增加(图6，图9)。

本实施例验证了在DN50成功转入重组质粒35S::Dt2^HapI-2之后，所获得的过表达转基因植株的分枝数变少，株高降低，开花期提前，百粒重没有变化，单株产量及小区产量均显著减少(图8，图9)。

另外，为了验证Dt2的敲除转基因株系对产量是否产生影响，我们分别在低种植密度(8800株/亩)和高种植密度(13340株/亩)下于北京昌平农场种植Dt2敲除基因株系和野生型(图10)。通过后期对小区产量进行鉴定，折合亩产对比发现：Dt2敲除系能够显著的增加产量，产量比对照增产平均达到70％以上，能够显著的影响产量，其中Dt2敲除系#1相对于野生型增产74.2％，Dt2敲除系#2相对于野生型增产76.4％。

以上结果说明了，Dt2基因是调控大豆分枝数的关键基因，在大豆植株中敲除Dt2基因可促进大豆百粒重的增加，从而提高大豆产量。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列

SEQ ID NO:1Dt2^HapI启动子序列

CCACTCCAAC AGGTATAAAA AGAAAGTTAA GCCAAAGAGA AAACACACCA CCCTGGAGACTCAGAGCTCT CTTATGAATA CATCCTGTCT GGGTGTCTCT AGTAGGGGAA ATCTTTCTTT TTCCATCCCTTCTCTTCCAT TAGTTTCTAA ACCCCTTTTC AAGTGTAAGG CTCCTTATGG CTATGAGAGA CTAAACCCTTAGTTAGGGTC TGACAGGTCT AAAAAGCCAA AAGATGTATT GTACACTTCA TATCTATCAA TGCAAACAAGTGTTTTCTTT CCTATTATCC TTTCTTATTT TAATTTCATG TATCATTCAT CCTTGCACCA TCTTCAGGGGTTAGGTGTTT GATAGAGGGT AATCCTTAAT AAAAATACAA GAAAGCTCTT ACATGCATCA GTTTTAAGGATTAGTCGCTC GACAGAGGAT AATTTCTAAT AGAACTAAAG GGAAGATGTA TCTTAATAAA ATCATTGCTAGACATAGAGT GATTGCATTA TGTCTATGCA TCAAAGCAAA CATCTAGAAT TAAAACTTCA TGCATCTTATCTATCGGGTC TTTGCAAAGA CATTTGGGAA ATAGATAGAT AGGTAAGTTA GGTTTGTCAT CGTGGGATATCATGGGCAAA GTATTCTAAT AGATGTGGGT AGGAAAAAAA ATCACTAAAT TGATAATGAA AAAAATCTAAAATAATACAT CTTAGACAAA TAAAGCAGGC TAAGTCCCGA CATTATCACA TCTTGAATTT ATCTTTCTTTATCTTCATCT TCATTTTTTA TTTTTCTTAT CTTTTACTTT TCTTATCTTA TCTTTTTTTA TCTTTATCATCTTTTAATTT AAATATTTTA TCTTTTATAT CTTATCTTTT CTTTTAAATT TTTATTTTAT CTTTTATCTTTCTGCATCTT TTATTTTAAA TTTCTTATCT ATTGCTTTTA ATTTGGGTTT GTATCAATCT AAATCCAAACAAATTCTGGG TGGATTCAAC ACTCAAACTT TCAAATACTT TACTACTTAT GGTAAATTTG ATGCACTTGATAACGAGTTA ACATTTGTCA CCATATCAAC TAGTCATATA TGAAAAATTT GTGCAATTAT ATATATATATATATATATAT ATATATATAT ATAATATTTT TAGTTTCTTA TATATTTATA AACTATTAAG TCGTGAAAAAATAAGGAACT AAAAATATAA ATTACAAAAA TTATAGACAT AAGTAAATGA TGTGTGAGTT CTTGTGTTTGTCAATGTAAT TATCATATCA TCAATTAGGG GTAATATAAT TAATAATAGA GACCAAAAAT TTGTTTAGGGATTTAAAACT ATACATGTTC AAACAAGATT ATGAAGACTA AAAAACATTT TTTTTTAAAA AAAGATTACACATAATTATT CTATTAGATA TTTGATAATA ACAAATTAAT GAATTGTCAA TATATTGTGT GATAGTTAACACTCTTAATT AACAAAAGGG ACTAAAAGTG GTAACTAATA AAAATTTAAT TTAGATTAGG ACTAAAAGCAAAAATTTTAA AATTTTAAGA AACAAAAAGA TAATAAATTC AAACAAATAA ATGCATGTTT AATTTGAAATTGAAATTATT ATATTCTGTG TACTAATGCA GATCCATCGT ATAAAAAAAT GAAAACAAAA ATAATGGTTATATATAATCC TTTTGCAAAA GTATTTTTAC CTCAAAGCTA TTTTTATTTG ATTTCAAACG TGATTTAACACACATGCAAT ATGCAATACA CAACTTATTT TTCCAAATAT TTTAAAAAAT AATAACACAA CTCAGGGGTTTTGAACATAA AGATTCAATT GACATGTGAA AAATGGACCT AGTCCCTTCC ATAGCATCTG ATTGACATGTGAAAAATGGA CCTAATCCCT TTCCATAGCA TCTGATTGAC ATAAGCCAAA CATGAATAGG AAATTAGACGAATTTAGTGA CGGAGCCACA AGCTAGCAAG AGGCCAAACA AAGTAACAAA AACAATATTA ACTTCATTTTTATAAATCAA GTTATTTATT ATTCGAAACA AATCCCGAAA ATCCAAACTA CTAATTATCC AAGACCTAAAATTCCCAATT ATAAACTAAA ATTCCCTTCT AGTTACAAAT GCTTTTTAAC AAGCATTTTC CCGAATAGGACGTGTGAACC AACAAAACAC ACGTTAATGT AATATTAACA TATTATTTTT TAAAAAAATA ATAACACATTCACACAAATA CATATACACA AAAAGTGAAA AATAAACTCC AAATGAAATA AAAATTAATA GGGTTTATCATCTTTTTGTT TCAATTTTTT ATAAAAAAGA AAAATTGTTT TTAGTCTCTT TAAAAAAATT GTTCCATTTTTGCTCCTATT TTGTGAGAGT AAAAACGGAA TGAAAGTGTT TTTGAGAGAA AAAAATGAAA CAGTTTTTTCAAGAACTAAA ATTAGTCACT AAAAAATTGA CAAGAGATTA AAAACAGAAA TTCACGATGA AGACAAAAGAGTTAATAACC CTAAAATAAT ACTATTGTTG ATATCCAGAA TTCTGCATAC ACCTCACAAA ATGACAACTGTTTTTTCTTC TTTTAATGTT CTCTTGATTT GTTGTTTGGT TTTTAATTAT AAGATATAAT TGATTAATTCTATTTATTAA AAAAGTTAAT TATTAGTATT ATGTTGGTTT ATAAATATAG TATTTTTTAA ATTTATTCTTAACTTTATTG AAAGTCTAAC AATGTAAGTT TTTTAATTTT CATAAGAGAA AAAGAAAATC AAGAAATTTTAATTAAAAAT AATTAATGTA TATGAAAAAT GAAATAAAGT CTTATAAGAT GTTGAAACAG AGAGTGTTTGGATAGAAATT AAAGAAAGGG CTAGGCTATA CTATAGGGAA AGAGAAATAG GGAAGTGTGA AGTGAGGGGGCGCCGTCAAC CAATGAGAGT GCCATAAACA CAACAAAAAC CCGTTTCCCG TTTCTCACTT ATTCATGGGACCCACATAAC CGTACGGAGC GTCTCCCAAC GTTACGCCCT GTCAACACGA GACATCAACA CTCTCATACTTGCTCAATTC TAGCTCGACA ACGCATTGTA CCTTAACCCT TCTACTAATC ACAACTCGAC AACGCATCGTACCTTAAATT CTCATTCCTT TCCCCAATTT TTATTCTTAT TCTTCTTTTT TCCTTCACAA TTCAAAAATAGAAAAAGGAA ATTCCCATGC TATCCTATTA TTAGACACCC TCCACTTCTT TTGCTTTCGC GTTCGTTTTCTCTTTCTCGG TCTTGCTTTG CTCAGGTGAA TACCACTCTC TCACTCTACT ACTTCCTCTC TAGCTAGGGTTTCCTTCTTT ATACAAAACA CAACCTAACA AGTAACAACC TTCTTTATAT GTACTTATTC CTTAACCCTCCTGTTACCCT TTTTAGCTAT TTCTATTTGT GCTGCTTTCA TAGAATTGCT AGTTACGTGG GACAATTAAGCACTAAGAAG

SEQ ID NO:2Dt2^HapII启动子序列

CCACTCCAAC AGGTATAAAA AGAAAGTTAA GCCAAAGAGA AAACACACCA CCCTGGAGACTCAGAGCTCT CTTATGAATA CATCCTGTCT GGGTGTCTCT AGTAGGGGAA ATCTTTCTTT TTCCATCCCTTCTCTTCCAT TAGTTTCTAA ACCCCTTTTC AAGTGTAAGG CTCCTTATGG CTATGAGAGA CTAAACCCTTAGTTAGGGTC TGACAGGTCT AAAAAGCCAA AAGATGTATT GCACACTTCA TATCTATCAA TGCAAACAAGTGTTTTCTTT CCTATTATCC TTTCTTATTT TAATTTCATG TATCATTCAT CCTTGCACCA TCTTCAGGGGTTAGGTGTTT GATAGAGGGT AATCCTTAAT AAAAATACAA GAAAGCTCTT ACATGCATCA GTTTTAAGGATTAGTCGCTC GACAGAGGAT AATTTCTAAT AGAACTAAAG GGAAGATGTA TCTTAATAAA ATCATTGCTAGACATAGAGT GATTGCATTA TGTCTATGCA TCAAAGCAAA CATCTAGAAT TAAAACTTCA TGCATCTTATCTATCGGGTC TTTGCAAAGA CATTTGGGAA ATAGATAGAT AGGTAAGTTA GGTTTGTCAT CGTGGGATATCATGGGCAAA GTATTCTAAT AGATGTGGGT AGGAAAAAAA ATCACTAAAT TGATAATGAA AAAAATCTAAAATAATACAT CTTAGACAAA TAAAGCAGGC TAAGTCCCGA CATTATCACA TCTTGAATTT ATCTTTCTTTATCTTCATCT TCATTTTTTA TTTTTCTTAT CTTTTACTTT TCTTATCTTA TCTTTTTTTA TCTTTATCATCTTTTAATTT AAATATTTTA TCTTTTATAT CTTATCTTTT CTTTTAAATT TTTATTTTAT CTTTTATCTTTCTGCATCTT TTATTTTAAA ATTCTTATCT ATTGCTTTTA ATTTGGGTTT GTATCAATCT AAATCCAAACAAATTCTGGG TGGATTCAAC ACTCAAACTT TCAAATACTT TACTACTTAT GGTAAATTTG ATGCACTTGATAACGAGTTA ACATTTGTCA CCATATCAAC TAGTCATATA TGAAAAATTT GTGCAATTAT ATATATATATATATATATAT ATATATATAT ATAATATTTT TAGTTTCTTA TATATTTATA AACTATTAAG TCGTGAAAAAATAAGGAACT AAAAATATAA ATTACAAAAA TTATAGACAT AAGTAAATGA TGTGTGAGTT CTTGTGTTTGTCAATGTAAT TATCATATCA TCAATTAGGG GTAATATAAT TAATAATAGA GACCAAAAAT TTGTTTAGGGATTTAAAACT ATACATGTTC AAACAAGATTATGAAGACTA AAAAACATTT TTTTTTAAAA AAAGATTACACATAATTATT CTATTAGATA TTTGATAATA ACAAATTAAT GAATTGTCAA TATATTGTGT GATAGTTAACACTCTTAATT AACAAAAGGG ACTAAAAGTG GTAACTAATA AAAATTTAAT TTAGATTAGG ACTAAAAGCAAAAATTTTAA AATTTTAAGA AACAAAAAGA TAATAAATTC AAACAAATAA ATGCATGTTT AATTTGAAATTGAAATTATT ATATTCTGTG TACTAATGCA GATCCATCGT ATAAAAAAAT GAAAACAAAA ATAATGGTTATATATAATCC TTTTGCAAAA GTATTTTTAC CTCAAAGCTA TTTTTATTTG ATTTCAAACG TGATTTAACACACATGCAAT ATGCAATACA CAACTTATTT TTCCAAATAT TTTAAAAAAT AATAACACAA CTCAGGGGTTTTGAACATAA AGATTCAATT GACATGTGAA AAATGGACCT AGTCCCTTCC ATAGCATCTG ATTGACATGTGAAAAATGGA CCTAATCCCT TTCCATAGCA TCTGATTGAC ATAAGCCAAA CATGAATAGG AAATTAGACGAATTTAGTGA CGGAGCCACA AGCTAGCAAG AGGCCAAACA AAGTAACAAA AACAATATTA ACTTCATTTTTATAAATCAA GTTATTTATT ATTCGAAACA AATCCCGAAA ATCCAAACTA CTAATTATCC AAGACCTAAAATTCCCAATT ATAAACTAAA ATTCCCTTCT AGTTACAAAT GCTTTTTAAC AAGCATTTTC CCGAATAGGACGTGTGAACC AACAAAACAC ACGTTAATGT AATATTAACA TATTATTTTT TAAAAAAATA ATAACACATTCACACAAATA CATATACACA AAAAGTGAAA AATAAACTCC AAATGAAATA AAAATTAATA GGGTTTATCATCTTTTTGTT TCAATTTTTT ATAAAAAAGA AAAATTGTTT TTAGTCTCTT TAAAAAAATT GTTCCATTTTTGCTCCTATT TTGTGAGAGT AAAAACGGAA TGAAAGTGTT TTTGAGAGAA AAAAATGAAA CAGTTTTTTCAAGAACTAAA ATTAGTCACT AAAAAATTGA CAAGAGATTA AAAACAGAAA TTCACGATGA AGACAAAAGAGTTAATAACC CTAAAATAAT ACTATTGTTG ATATCCAGAA TTCTGCATAC ACCTCACAAA ATGACAACTGTTTTTTCTTC TTTTAATGTT CTCTTGATTT GTTGTTTGGT TTTTAATTAT AAGATATAAT TGATTAATTCTATTTATTAA AAAAGTTAAT TATTAGTATT ATGTTGGTTT ATAAATATAG TATTTTTTAA ATTTATTCTTAACTTTATTG AAAGTCTAAC AATGTAAGTT TTTTAATTTT CATAAGAGAA AAAGAAAATC AAGAAATTTTAATTAAAAAT AATTAATGTA TATGAAAAAT GAAATAAAGT CTTATAAGAT GTTGAAACAG AGAGTGTTTGGATAGAAATT AAAGAAAGGG CTAGGCTATA CTATAGGGAA AGAGAAATAG GGAAGTGTGA AGTGAGGGGGCGCCGTCAAC CAATGAGAGT GCCATAAACA CAACAAAAAC CCGTTTCCCG TTTCTCACTT ATTCATGGGACCCACATAAC CGTACGGAGC GTCTCCCAAC GTTACGCCCT GTCAACACGA GACATCAACA CTCTCATACTTGCTCAATTC TAGCTCGACA ACGCATTGTA CCTTAACCCT TCTACTAATC ACAACTCGAC AACGCATCGTACCTTAAATT CTCATTCCTT TCCCCAATTT TTATTCTTAT TCTTCTTTTT TCCTTCACAA TTCAAAAATAGAAAAAGGAA ATTCCCATGC TATCCTATTA TTAGACACCC TCCACTTCTT TTGCTTTCGC GTTCGTTTTCTCTTTCTCGG TCTTGCTTTG CTCAGGTGAA TACCACTCTC TCACTCTACT ACTTCCTCTC TAGCTAGGGTTTCCTTCTTT ATACAAAACA CAACCTAACA AGTAACAACC TTCTTTATAT GTACTTATTC CTTAACCCTCCTGTTACCCT TTTTAGCTAT TTCTATTTGT GCTGCTTTCA TAGAATTGCT AGTTACGTGG GACAATTAAGCACTAAGAAG

SEQ ID NO:3 Dt2^HapI-1-CDS

ATGGGAAGGG GTAGGGTTCA GCTGAAGCGG ATCGAGAACA AAACAAGCCA GCAAGTGACGTTTTTCAAGC GTAGATCGGG ACTTCTCAAG AAAGCCAGCG AAATCTCTGT GCTATGTGAT GCTCAAGTTGCTTTGATTAT ATTTTCTACC AAAGGCAAAC TTTTTGAGTA TTCCTCTGAA CGCAGCATGG AAGACCTCCTTGAACGTTAC GAGAGATGTA GCCATACAGC ACTTGCTGGA GCTAACAATG TCGAATCACC GGGATTTTGGTCTTTCGAAC ATATCAAGCT CACCGCTAAA GTTGAAGTCT TGGAGAGGAA CATAATGAAT TTCTTTGGAAATGATCTGGA TCCCTTGAGT TTGAAAGAGC TTCACAGTTT GGAGCAGCAG ATTGAGACAT CTCTGAAGCGCATCCGAACT AGAAAGAATC AAGTTATGAA TCAATCCGTC TCAGACCTGC ATAAAAAGGC AAGGACATTACAAGTGCAAA ACAGATGGCT AGGAAAGATG AAGGAGAAAG CGAAGACAGT GACTGAAGGT CCACACAACGGCCCAGAAAC TCTAGGCTTT GATTCATCCA CACTCAACTT ATCTTCTCCA CAGCTACCAC CACCACCATCACCACAAAGA CTGGTTCCTT CTCTAACTCT CAGTGAGACA ATGCAAGGAG GAACACCAGT GGAAGAAACGGGTGAGGCTC AAACAGTCCC TAGTGGCAAT TCTCTCATCC CACCATGGAT GCTGCGCTGC ATGTCTGACTAG

SEQ ID NO:4 Dt2^HapI-2-CDS

ATGGGAAGGG GTAGGGTTCA GCTGAAGCGG ATCGAGAACA AAACAAGCCA GCAAGTGACGTTTTTCAAGC GTAGATCGGG ACTTCTCAAG AAAGCCAACG AAATCTCTGT GCTATGTGAT GCTCAAGTTGCTTTGATTAT ATTTTCTACC AAAGGCAAAC TTTTTGAGTA TTCCTCTGAA CGCAGCATGG AAGACCTCCTTGAACGTTAC GAGAGATGTA GCCATACAGC ACTTGCTGGA GCTAACAATG TCGAATCACC GGGATTTTGGTCTTTCGAAC ATATCAAGCT CACCGCTAAA GTTGAAGTCT TGGAGAGGAA CATAATGAAT TTCTTTGGAAATGATCTGGA TCCCTTGAGT TTGAAAGAGC TTCACAGTTT GGAGCAGCAG ATTGAGACAT CTCTGAAGCGCATCCGAACT AGAAAGAATC AAGTTATGAA TCAATCCGTC TCAGACCTGC ATAAAAAGGC AAGGACATTACAAGTGCAAA ACAGATGGCT AGGAAAGATG AAGGAGAAAG CGAAGACAGT GACTGAAGGT CCACACAACGGCCCAGAAAC TCTAGGCTTT GATTCATCCA CACTCAACTT ATCTTCTCCA CAGCTACCAC CACCACCATCACCACAAAGA CTGGTTCCTT CTCTAACTCT CAGTGAGACA ATGCAAGGAG GAACACCAGT GGAAGAAACGGGTGAGGCTC AAACAGTCCC TAGTGGCAAT TCTCTCATCC CACCATGGAT GCTGCGCTGC ATGTCTGACTAG

SEQ ID NO:5Dt2^HapI-1-蛋白质序列

MGRGRVQLKR IENKTSQQVT FFKRRSGLLK KANEISVLCD AQVALIIFST KGKLFEYSSERSMEDLLERY ERCSHTALAG ANNVESPGFW SFEHIKLTAK VEVLERNIMN FFGNDLDPLS LKELHSLEQQIETSLKRIRT RKNQVMNQSV SDLHKKARTL QVQNRWLGKM KEKAKTVTEG PHNGPETLGF DSSTLNLSSPQLPPPPSPQR LVPSLTLSET MQGGTPVEET GEAQTVPSGN SLIPPWMLRC MSD

SEQ ID NO:6Dt2^HapI-2-蛋白质序列

MGRGRVQLKR IENKTSQQVT FFKRRSGLLK KASEISVLCD AQVALIIFST KGKLFEYSSERSMEDLLERY ERCSHTALAG ANNVESPGFW SFEHIKLTAK VEVLERNIMN FFGNDLDPLS LKELHSLEQQIETSLKRIRT RKNQVMNQSV SDLHKKARTL QVQNRWLGKM KEKAKTVTEG PHNGPETLGF DSSTLNLSSPQLPPPPSPQR LVPSLTLSET MQGGTPVEET GEAQTVPSGN SLIPPWMLRC MSD

SEQ ID NO:7引物F1序列

ATGGGAAGGGGTAGGGTTC

SEQ ID NO:8引物R1序列

CTAGTCAGACATGCAGCGCA

SEQ ID NO:9靶点引物sgRNA1序列

tgtagccatacagcacttgc

SEQ ID NO:10靶点引物sgRNA2序列

aggaacaccagtggaagaaa

SEQ ID NO:11PMDC123-HindIII-gRNA-F

TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACGACTCACTATAGGGCGAATTG

SEQ ID NO:12PMDC123-pstI-gRNA-R

GTGCTCCACCATGTTGACCTGCAGAACAAAAGCTGGAGCTCACTAGT

SEQ ID NO:13图5C中DN50的序列

TGTAGCCATACAGCACTTGCTGGAGCTAA

SEQ ID NO:14图5C中Dt2^CR-1的序列

TGTAGCCATACAGCACTGCTGGAGCTAA

SEQ ID NO:15图5D中DN50的序列

TGTAGCCATACAGCACTTGCTGGAGCTAACAATGTCGAAT

SEQ ID NO:16图5D中Dt2^CR-2的序列

TGTAGCCATACAATGTCGAAT

参考文献

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巩鹏涛(2005).植物分枝发育的遗传控制[J].分子植物育种。

Claims

1.分离的调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的基因，其特征在于，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示或其同源序列。

2.调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQID NO:6所示或其同源序列。

3.分离的调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的基因的启动子，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

4.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含针对根据权利要求1所述的基因设计的sgRNA靶点序列。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有抗生素标记或抗化学试剂标记。

6.根据权利要求1所述的调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的基因或根据权利要求2所述的蛋白质或根据权利要求3所述的启动子在调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数或提高豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆产量中的应用。

7.提高豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆产量或调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的方法，其特征在于，所述方法包括对根据权利要求1所述的基因的功能进行失活的步骤，优选地，通过基因敲除使所述基因功能失活。

8.提高豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆产量或调控豆科植物，优选地大豆属、豌豆属、鹰嘴豆属植物，例如大豆、豌豆、绿豆、蚕豆、黑豆、鹰嘴豆分枝数的方法，其特征在于，所述方法包括：

a.针对根据权利要求1所述的基因设计sgRNA序列，将sgRNA靶点序列导入表达载体；

b.将所述表达载体导入农杆菌；和

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列为多个。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶点序列如SEQ IN NO:9和SEQ ID NO:10所示。