CN114957285A - 一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物、制备方法和应用 - Google Patents

一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物、制备方法和应用 Download PDF

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胡炜彦
张荣平
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Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物、制备方法和应用。采用质谱，一维、二维核磁共振波谱技术，红外，紫外，CD光谱以及理化分析方法确定单萜吲哚类化合物的化学结构。经过体外抗菌活性试验表明：Rauvolsis A具有明显的抗枯草芽孢杆菌活性，为制备抗菌药物提供了新的先导化合物。

Description

一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物、制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，是从一种植物中提取分离得到的一个新的具有抗菌活性的稠合醚环单萜吲哚生物碱Rauvolsis A。
背景技术
当前，随着人类对抗生素及合成抗菌药物的滥用，越来越多的病原菌表现出多重耐药特性，使得现有可选择的抗微生物药物束手无策，人类正在面临无药可用的境地。
天然产物一直是临床使用的大多数创新药物最重要的源泉之一，上世纪八十年代至今上市的小分子药物有超过60％是直接或者间接来源于天然化合物，全球上市的386个小分子抗微生物药物，有35％来源于天然产物。大部分天然产物对微生物细胞具有多效性和复杂的作用，并且通常具有一个以上的分子靶点，这种作用限制了微生物突变引起的自发性耐药的频率。
云南萝芙木(Rauvolfia yunnanensis Tsiang)为夹竹桃科(Apocynaceae)萝芙木属(Rauvolfia)植物。其味苦、微辛，性凉，具有清风热、降肝火、消肿解毒的作用。药理学研究发现，其醇提浸膏具有良好的抗菌活性，但是关于其单体化合物的抗菌活性报道较少。
目前未见到有关于稠合醚环单萜吲哚生物碱Rauvolsis A的提取方法及药物用途的报道，该化合物为新颖骨架化合物，属于首次分离得到；该化合物的新的药物用途属于首次发现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物、制备方法和应用，首要目的在于提供一种新颖的稠合醚环单萜吲哚生物碱。
另一目的是提供上述一种单萜吲哚生物碱化合物的制备方法。
再一目的是提供上述一种新化合物的医药用途。
为实现所述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明涉及的一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物结构如下：
Figure BDA0003743895600000021
其化学名称为：是从云南萝芙木植物中首次分离得到的新颖骨架类化合物，命名为Rauvolsis A。白色粉末，易溶于甲醇，改良碘化铋钾试剂显橘红色。HR-ESI-MS:m/z401.2071[M+H]+，给出分子式为C22H28N2O5。室温条件下测定化合物的比旋光度为[α]D 20-28.62°(c 0.19,CH3OH)。
经体外抗菌活性试验，化合物能显著抑制枯草芽孢杆菌的扩增。因此，可用于制备新的抗菌药物。
本发明化合物的制备发明如下：
总生物碱的制备：
S1：取云南萝芙木干燥根粉碎，过100目筛；用80％甲醇回流提取5次，每次溶剂80L，回流3h，提取液减压回收溶剂，得到总浸膏，总浸膏用pH＝2～3的盐酸-水分散后过滤，滤液用氨水调pH＝9～10，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层，为总生物碱部分；
S2：组分段的提取：
将乙酸乙酯层浸膏经200～300目硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇(梯度为：1:0，10:1，9:1，8:1，7:1，5:1，0:1v/v)进行梯度洗脱，合并组分得5个流分：Fr.A～Fr.E；
S3：单体化合物的分离：
取流分为Fr.D经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇(20:1～10:1v/v)梯度洗脱，得5个流分：Fr.D1～D5；取Fr.D5以Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)洗脱，减压回收溶剂至干，得到含有权利要求1所述化合物粗品；
S4：将S3所述化合物粗品再经半制备型高效液相色谱(乙腈-水50/50)分离纯化，得到权利要求1所述化合物纯品。
还提出，稠合醚环单萜吲哚生物碱Rauvolsis A在制备抗菌药物中的应用
本发明的有益效果：
1、提供了1种新颖骨架的稠合醚环单萜吲哚类化合物；
2、运用体外抗菌活性筛选方法对化合物进行活性评价，结果表明，所述的化合物具有较好的抗菌作用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的分子式图；
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
如图1所示，本发明实施例提供了本发明涉及的一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物结构如下：
Figure BDA0003743895600000031
其化学名称为：是从云南萝芙木植物中首次分离得到的新颖骨架类化合物，命名为Rauvolsis A。
白色粉末，易溶于甲醇，改良碘化铋钾试剂显橘红色。HR-ESI-MS:m/z401.2071[M+H]+，给出分子式为C22H28N2O5。室温条件下测定化合物的比旋光度为[α]D 20-28.62°(c 0.19,CH3OH)。
经体外抗菌活性试验，化合物能显著抑制枯草芽孢杆菌的扩增。因此，可用于制备新的抗菌药物。
本发明化合物的制备发明如下：
总生物碱的制备：
云南萝芙木干燥根(13.0kg)粉碎，过100目筛。用80％甲醇回流提取5次(每次溶剂80L，回流3h)，提取液减压回收溶剂，得到总浸膏1.0kg，总浸膏用pH＝2～3的盐酸-水分散后过滤，滤液用氨水调pH＝9～10，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层(60.0g)，为总生物碱部分。
组分段的提取：
乙酸乙酯层浸膏(60.0g)经硅胶(200～300目)柱色谱分离，氯仿-甲醇(1:0，10:1，9:1，8:1，7:1，5:1，0:1v/v)梯度洗脱，合并组分得5个流分(Fr.A～Fr.E)。
单体化合物的分离：
Fr.D(3.2g)经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇(20:1～10:1v/v)梯度洗脱，得5个流分(Fr.D1～D5)。Fr.D5(400.0mg)以Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)洗脱，减压回收溶剂至干，得到含有权利要求1所述化合物粗品。再经半制备型高效液相色谱(乙腈-水50/50)分离纯化，得到权利要求1所述化合物纯品3.0mg。
D鉴定：采用高分辨质谱，红外，紫外分析及波谱学数据进行结构鉴定。RauvolsisA白色粉末，易溶于甲醇，改良碘化铋钾试剂显橘红色。HR-ESI-MS:m/z401.2071[M+H]+，给出分子式为C22H28N2O5。室温条件下测定化合物的比旋光度为[α]D 20-28.62°(c 0.19,CH3OH)。IR(film)Vmax:苯环吸收(1627,1545和1519cm-1)紫外最大吸收波长在λmax 321，268，和195nm。1H和13C核磁数据见表1。
Figure BDA0003743895600000051
Figure BDA0003743895600000061
表1化合物的1H-NMR、13C-NMR数据归属信息(表头要放在表格的最前面)
综上分析，鉴定化合物为一个稠合的多醚环单萜吲哚生物碱类化合物。经SciFinder检索化合物结构未见文献报道，确定为一新颖化合物，命名为Rauvolsis A。
体外抗菌试验
一、试验用菌株
1.实验用细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；
2.实验用真菌：白色念球菌(Candida albicans)。
二、实验用药
1.阳性对照药：小檗碱(Berberine)，氟康唑(Fluconazole)；
2.阴性对照品：二甲基亚砜(DMSO)
3.空白对照品：10％DMSO溶液+肉汤培养基
4.待测化合物：Rauvolsis A
三、最低抑菌浓度测定
1.菌悬液的制备:
取待测菌株大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，白色念球菌(C.albicans)接种到琼脂固体平板上，待菌落长出后挑取单个菌落转接到琼脂液体培养基中，置于37℃、180rpm条件下震荡培养至对数期。在紫外分光光度计下测定菌液在600nm波长处的吸光度值，并调整无菌生理溶液的光密度至0.10(0.5麦氏法兰标准)，最后用MHB肉汤培养基将菌液稀释到106CFU·mL-1。
2.待测样品的制备：
取待测化合物Rauvolsis A加入10％二甲基亚砜(DMSO)溶液，配制样品母液浓度分别为200μg/mL(细菌)和250μg/mL(真菌)，加入培养基和菌液作为实验组；10％DMSO溶液、培养基作为空白对照；取阳性对照药物小檗碱(细菌)，氟康唑(真菌)，加入10％二甲基亚砜(DMSO)溶液，配制其浓度分别为200μg/mL(细菌)和250μg/mL(氟康唑)，加入培养基和菌液作为阳性对照；10％DMSO溶液、菌液作为阴性对照。
3.最低抑菌浓度(MIC)的测定：
以微量肉汤稀释法对化合物Rauvolsis A的最低抑菌浓度(MIC)进行测定。选用高温灭菌的96微孔板，在每孔中各加入100μL肉汤培养基，然后往第一排的孔中加入100μL已调配好的测试样品，准备进行串行双重稀释，随后加入100μL稀释后的菌液，用移液枪混合均匀，使测试样品及阳性药物的最终浓度分别为0.78-100μg/mL(细菌)和0.48-250μg/mL(真菌)。混匀后将96微孔板加盖后置于37℃条件下培养24h，白色念球菌置于28℃条件下培养48h。经过恒温培养后，用酶标仪测定菌液在600nm波长处的吸光度值，同时观察96孔板的浑浊度，待测样品组的数值小于或者等于空白对照组的数值或者未出现明显浑浊的样品孔对应的化合物浓度即为待测样品的MIC值，如果待测样品的MIC值>100μg/mL(细菌)、250μg/mL(真菌)则视该样品没有抗菌活性，每个实验平行三次，结果见表2。
表2.Rauvolsis A的最小抑菌浓度(μg/mL)
Figure BDA0003743895600000071
由表2可知，Rauvolsis A对枯草芽孢杆菌具有显著的抑制活性，与临床抗菌药物小檗碱的抗菌活性相当。因此，本发明化合物Rauvolsis A可用于制备抗菌药物。
本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：
(1)提供了1种新颖骨架的单萜吲哚类化合物；
(2)运用体外抗菌活性筛选方法对化合物进行活性评价，结果表明，所述的化合物具有较好的抗菌作用。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (6)

1.一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物， 其特征在于： 所述化合物结构式为：
Figure FDA0003743895590000011
其化学名称为： Rauvolsis A。
2.一种稠合醚环单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：总生物碱的制备：取云南萝芙木干燥根粉碎，过100目筛；用80％甲醇回流提取5次，提取液减压回收溶剂，得到总浸膏，总浸膏用pH＝2～3的盐酸-水分散后过滤，滤液用氨水调pH ＝ 9～10， 乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层，为总生物碱部分；
S2：组分段的提取：
将乙酸乙酯层浸膏经200～300目硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇进行梯度洗脱，合并组分得5个流分： Fr.A～Fr.E；
S3：单体化合物的分离：
取流分为Fr.D经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱，得5个流分：Fr.D1～D5；取Fr.D5以Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)洗脱，减压回收溶剂至干，得到含有权利要求1所述化合物粗品；
S4：将S3所述化合物粗品再经半制备型高效液相色谱(乙腈-水50/50 v/v)分离纯化，得到权利要求1所述化合物纯品。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1中甲醇回流提取满足：每次溶剂80 L， 回流3 h。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2中的氯仿-甲醇梯度为： 1:0，10:1，9:1，8:1，7:1，5:1，0:1 (v/v)。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S3中的氯仿-甲醇梯度为：20:1～10:1 (v/v)。
6.一种权利要求1所述的稠合醚环单萜吲哚生物碱Rauvolsis A在制备抗菌药物中的应用。
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