CN114949260A - 一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，所述试剂包括：质量分数为25％‑30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液；质量分数为15％‑20％的阴离子表面活性剂水溶液；紫外光固化胶。本发明实施例通过先后在颅骨表面滴加质量分数为25％‑30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液、质量分数为15％‑20％的阴离子表面活性剂水溶液和紫外光固化胶，进行单次处理即可获得长期透明的颅骨光透明窗，可用于光学显微成像系统进行成像，建立了无损、长期、非侵入的透明颅窗，实现了皮层血管网络的高分辨成像，操作简单，成像质量高，可用于长期观测。

Description

一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法
技术领域
本发明涉及生物成像技术领域，特别涉及一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法。
背景技术
对大脑皮层血管网络的活体观测对于脑科学的研究非常重要。先进的光学成像技术因其高分辨率和低侵入性等优势，为活体观测大脑皮层细微结构和功能提供了有力工具。
但是，皮层上方的浑浊颅骨严重制约了光学成像技术用于穿颅皮层成像时的成像质量和成像深度。在基础研究中，为了克服颅骨的影响，研究人员发明了多种颅窗技术，比如传统的开颅玻璃窗和磨薄颅骨窗等。但是，开颅手术不可避免地会改变颅内压，且容易引起炎症反应；磨薄颅骨创的成像次数有限，且在磨薄颅骨的过程中会产生极大的热量，不仅如此，把颅骨打磨至20μm的操作难度极大。
近些年发展的颅骨光透明窗能够在不对颅骨进行外科手术的情况下，通过试剂在颅骨表面的涂抹、浸泡，降低颅骨的散射，使得颅骨变得“透明”，从而用于光学皮层成像。该方法高效、方便、安全，为活体皮层高分辨成像提供了重要支撑。但是，现有的颅骨光透明窗并不能实现对颅骨的长期透明。目前的光透明试剂均为液体，且只有在试剂液体覆盖在颅骨表面时才能保持颅骨的透明，当试剂被去除以后，颅骨就会恢复到浑浊的状态。因此，当实验动物从麻醉状态回复到清醒状态、并正常活动以后，无法保证液态的颅骨光透明试剂持续覆盖在其颅骨表面。所以，目前基于颅骨光透明窗实现重复成像的模式是，每次成像前都需要重新对实验动物进行光透明处理，十分麻烦。
因此，如何开发一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，解决现有技术中存在的颅骨光透明窗并不能实现对颅骨的长期透明的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，实现大脑皮层血管的长期重复观测，操作简单、成像质量高。
为了实现上述目的，本发明实施例提供了一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，包括：
质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液；
质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液；
紫外光固化胶。
进一步地，所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液的质量分数为27％-28％。
进一步地，所述阴离子表面活性剂水溶液的质量分数为17％-18％。
进一步地，所述酰胺类有机化合物及其衍生物为碳酰胺或丙二酰脲。
进一步地，所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液中的醇溶液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的浓度为73％-77％。
进一步地，所述阴离子表面活性剂包括磺酸盐型阴离子表面活性剂和硫酸酯类阴离子表面活性剂中的一种。
本发明实施例还提供了一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法，所述方法包括：
固定颅骨；
向所述颅骨表面滴加质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液，后擦净，获得第一预处理颅骨；
向所述第一预处理颅骨表面滴加质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液，后擦净，获得第二预处理颅骨；
向所述第二预处理颅骨表面滴加紫外光固化胶，后固化，获得颅骨光透明窗。
进一步地，所述向所述第二预处理颅骨滴加紫外光固化胶，后固化，获得颅骨光透明窗，包括：
向所述第二预处理颅骨滴加紫外光固化胶，后在所述外光固化胶上放置盖玻片，再固化以使玻片与颅骨胶合，获得颅骨光透明窗。
进一步地，所述固定颅骨包括：采用带孔固定片固定颅骨。
进一步地，质量分数为25％-30％的所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液、质量分数为15％-20％的所述阴离子表面活性剂水溶液和所述紫外光固化胶的使用体积比为(2-4.5)：(1-2.5)：(0.5-1.5)。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，所述试剂包括：质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液；质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液；紫外光固化胶。本申请人经试验发现将紫外光固化胶与质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液、质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液配合使用，进行单次处理即可获得长期透明的颅骨光透明窗，建立了无损、长期、非侵入的透明颅窗，实现了皮层血管网络的高分辨成像，操作简单，成像质量高，可用于长期观测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1提供的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法的流程图；
图2为本发明实施例1提供的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法中固定小鼠的图片；
图3为本发明实施例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明前后的效果图；其中，图3a为本发明实施例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明前的效果图；图3b为本发明实施例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明化当天的效果图；3c为本发明实施例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明第二天的效果图；图3d为本发明实施例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明一周后的效果图；
图4为对比例1中对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明的效果图；图4a为颅骨原始状态；图4b为质量分数为25g/mL碳酰胺的乙醇溶液和质量分数为20％十二烷基苯磺酸钠溶液后的状态；图4c为液体试剂去除后的状态；
图5为对比例2中对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明的效果图；图5a为颅骨原始状态；图5b为只滴加紫外光固化胶的状态。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供了一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，总体思路如下：
根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供了一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，包括：
质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液；
质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液；
紫外光固化胶。
该实施方式中，
质量分数25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液，用于疏松致密的骨组织，洗脱部分高折射率的无机钙盐，并使颅骨组织表面胶原解离，最终使颅骨折射率降低；若质量分数低于25％，不利于最终的透明效果；若低于25％，不利于最终的透明效果；由于30％是酰胺类有机化合物及其衍生物在醇溶液中的饱和浓度，所以质量分数也不能高于30％。
质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液，用于消除颅骨中的脂类物质，进一步使得颅骨内部折射率匹配，降低颅骨散射；主要用于光学元件的胶合，透光率很高。若质量分数低于15％，不利于最终的透明效果；由于20％是阴离子表面活性剂在水中的饱和浓度，所以质量分数也不能高于20％；
紫外光固化胶，用于与颅骨进行折射率匹配，且固化后能保持颅骨长期处于低散射状态。
本发明实施例将紫外光固化胶与质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液、质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液进行协同配合使用，进行单次处理即可获得长期透明的颅骨光透明窗，实现小鼠大脑皮层血管的长期重复观测，操作简单、成像质量高；
作为一种可选的实施方式，所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液的质量分数为27％-28％。该浓度范围可更好地与阴离子表面活性剂水溶液和紫外光固化胶进行配合，光透明效果更好。
作为一种可选的实施方式，所述阴离子表面活性剂水溶液的质量分数为17％-18％。该浓度范围可更好地与酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液和紫外光固化胶进行配合，光透明效果更好。
作为一种可选的实施方式，所述酰胺类有机化合物及其衍生物为碳酰胺或丙二酰脲。
作为一种可选的实施方式，所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液中的醇溶液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的浓度为73％-77％。醇溶液选用乙醇溶液的原因：乙醇易于获取，且对生物的毒副作用小；所述乙醇溶液的浓度优选为75％，因为75％的酒精常被作消杀使用，能有效抑制细菌生长，能降低开窗后发炎的概率；
作为一种可选的实施方式，所述阴离子表面活性剂包括磺酸盐型阴离子表面活性剂和硫酸酯类阴离子表面活性剂中的一种。优选十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠中的一种。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法，如图1-图2所示，所述方法包括：
S1、固定颅骨；
作为一种可选的实施方式，所述固定颅骨包括：采用带孔固定片固定颅骨。将带孔固定片固定在经吹干的颅骨表面，用于固定小鼠颅骨的位置；固定片可长期固定在小鼠颅骨表面，因此可在清醒状态下对小鼠皮层进行成像。
S2、向所述颅骨表面滴加质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液，后擦净，获得第一预处理颅骨；
作为一种可选的实施方式，向固定在颅骨表面的所述固定片的孔中滴加25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液，10-15min后擦除；
S3、向所述第一预处理颅骨表面滴加质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液，后擦净，获得第二预处理颅骨；
作为一种可选的实施方式，向所述固定片的孔中滴加质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液，5-8min后擦除；
S4、向所述第二预处理颅骨表面滴加紫外光固化胶，后固化，获得颅骨光透明窗。
作为一种可选的实施方式，向所述第二预处理颅骨滴加紫外光固化胶，后在所述外光固化胶上放置盖玻片，再固化以使玻片与颅骨胶合，获得颅骨光透明窗。其中盖玻片的作用是进一步将颅骨与外界环境隔绝，且在每次成像时方便清理表面杂质。
具体地，向所述固定片中的孔中滴加紫外光固化胶，待液面平整后在紫外光固化胶上方放置盖玻片，用紫外灯在盖玻片上方照射2-5min，使得紫外光固化胶固化，玻片与颅骨胶合，即实现颅骨组织的长期光透明化，可用于光学显微成像系统进行成像；
作为一种可选的实施方式，所述步骤S2-S4中，质量分数为25％-30％的所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液、质量分数为15％-20％的所述阴离子表面活性剂水溶液和所述紫外光固化胶的使用体积比为(2-4.5)：(1-2.5)：(0.5-1.5)；优选为4：2：1。质量分数为25％-30％的所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液滴加过少会影响最终的透明效果，滴加过多容易形成浪费；
质量分数为15％-20％的所述阴离子表面活性剂水溶液滴加过少会影响最终的透明效果，滴加过多容易形成浪费；
紫外光固化胶滴加过少，容易使得覆盖不均匀，导致后期容易脱胶；滴加过多会使得颅骨上方的胶层过厚，容易影响成像质量；
该颅骨光透明窗建立完成后，即可实现为期数周的颅骨光透明化，可供长期持续观测皮层血管结构。固定片可长期固定在小鼠颅骨表面，因此可在清醒状态下对小鼠皮层进行成像。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法进行详细说明。
实施例1
步骤1、将两月龄雌性Balb/c小鼠麻醉后，用刀片刮除小鼠头部毛发，用眼科剪从双眼到双耳之间剪开一个两厘米长开口，再用湿润的棉球轻轻擦除颅骨表面的黏膜后，用压缩空气将颅骨表面吹干；
步骤2、将一个铝制带孔固定片用502胶水固定在小鼠单侧颅骨表面，等待5-8min胶水凝固后将小鼠移放于小鼠定位器上并对其头部进行固定；
步骤3、在颅骨表面滴加3mL质量分数为25g/mL碳酰胺的乙醇溶液，反应15min后用棉球擦除，该过程中用脱脂棉球不断摩擦颅骨表面以加速透明化过程；其中，所述碳酰胺的乙醇溶液由质量-体积比为25g:75mL的碳酰胺与浓度为75％乙醇溶液混合而成；
步骤4、在颅骨表面滴加1.5mL的质量分数为20％十二烷基苯磺酸钠溶液，静置反应5min后用棉球擦除，该过程将进一步使得颅骨透明化；
步骤5、在颅骨表面滴加1mL紫外光固化胶，并在紫外光固化胶表面放置盖玻片，然后用紫外灯在盖玻片上方照射2min，使第三试剂固化，将颅骨与盖玻片胶合。至此，长期颅骨光透明窗建立完成。本发明实施例中的紫外光固化胶为市场购买。
实施例1所得的颅骨光透明窗采用光学显微成像系统进行成像，后将小鼠从定位器上取下，放回鼠笼即可，不需要讲固定片从颅骨上取下。下次成像时，再次将固定片固定在定位器上即可，小鼠既可以处在麻醉状态，也可以处在清醒状态(图1)。实施例1所得的颅骨光透明窗的实验结果如图2和图3所示，透明效果好，成像质量高，且一次操作后可长期重复观测。
实施例2
步骤1、将两月龄雌性Balb/c小鼠麻醉后，用刀片刮除小鼠头部毛发，用眼科剪从双眼到双耳之间剪开一个两厘米长开口，再用湿润的棉球轻轻擦除颅骨表面的黏膜后，用压缩空气将颅骨表面吹干；
步骤2、将一个铝制带孔固定片用502胶水固定在小鼠单侧颅骨表面，等待5-8min胶水凝固后将小鼠移放于小鼠定位器上并对其头部进行固定；
步骤3、在颅骨表面滴加2mL质量分数为30g/mL碳酰胺的乙醇溶液，反应15min后用棉球擦除，该过程中用脱脂棉球不断摩擦颅骨表面以加速透明化过程；其中，所述碳酰胺的乙醇溶液由质量-体积比为30g:70mL的碳酰胺与浓度为75％乙醇溶液混合而成；
步骤4、在颅骨表面滴加1mL的质量分数为15％十二烷基苯磺酸钠溶液，静置反应5min后用棉球擦除，该过程将进一步使得颅骨透明化；
步骤5、在颅骨表面滴加0.5mL紫外光固化胶，并在紫外光固化胶表面放置盖玻片，然后用紫外灯在盖玻片上方照射2min，使第三试剂固化，将颅骨与盖玻片胶合。至此，长期颅骨光透明窗建立完成。实施例2所得的颅骨光透明窗的实验结果与实施例1基本相同。
实施例3
步骤1、将两月龄雌性Balb/c小鼠麻醉后，用刀片刮除小鼠头部毛发，用眼科剪从双眼到双耳之间剪开一个两厘米长开口，再用湿润的棉球轻轻擦除颅骨表面的黏膜后，用压缩空气将颅骨表面吹干；
步骤2、将一个铝制带孔固定片用502胶水固定在小鼠单侧颅骨表面，等待5-8min胶水凝固后将小鼠移放于小鼠定位器上并对其头部进行固定；
步骤3、在颅骨表面滴加4.5mL质量分数为27g/mL碳酰胺的乙醇溶液，反应15min后用棉球擦除，该过程中用脱脂棉球不断摩擦颅骨表面以加速透明化过程；其中，所述碳酰胺的乙醇溶液由质量-体积比为27g:73mL的碳酰胺与浓度为75％乙醇溶液混合而成；
步骤4、在颅骨表面滴加2.5mL的质量分数为17％十二烷基苯磺酸钠溶液，静置反应5min后用棉球擦除，该过程将进一步使得颅骨透明化；
步骤5、在颅骨表面滴加1.5mL紫外光固化胶，并在紫外光固化胶表面放置盖玻片，然后用紫外灯在盖玻片上方照射2min，使第三试剂固化，将颅骨与盖玻片胶合。至此，长期颅骨光透明窗建立完成。实施例2所得的颅骨光透明窗的实验结果与实施例1基本相同。
实施例4
将“质量分数为25g/mL碳酰胺的乙醇溶液”替换为“质量分数为25g/mL丙二酰脲的乙醇溶液”，其他步骤均同实施例1。实施例4所得的颅骨光透明窗的实验结果与实施例1基本相同。
对比例1
与实施例1不同的是，该对比例中不滴加紫外光固化胶；其余步骤均同实施例1。对比例1所得的颅骨光透明窗的实验结果如4所示。
对比例2
与实施例1不同的是，该对比例中不加酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液和阴离子表面活性剂水溶液，只滴加紫外光固化胶；其余步骤均同实施例1。对比例2所得的颅骨光透明窗的实验结果如5所示。
实验例1
将实施例1-实施例3和对比例1-2中的颅骨光透明窗采用光学显微成像系统进行成像，成像1情况统计如表1所示；
表1
组别 颅骨光透明窗
实施例1 透明效果好，成像质量高，且一次操作后可长期重复观测
实施例2 透明效果好，成像质量高，且一次操作后可长期重复观测
实施例3 透明效果好，成像质量高，且一次操作后可长期重复观测
实施例4 透明效果好，成像质量高，且一次操作后可长期重复观测
对比例1 成像质量较高，但无法长期重复观测
对比例2 透明效果差，成像质量低
由表1的数据可知，
对比例1中，不滴加紫外光固化胶，存在对于需要长期观测的场景需要重复实施透明步骤的缺点；
对比例2中，只滴加紫外光固化胶，透明效果差，成像质量不好；
实施例1-实施例4中，成像质量高，且一次操作后可长期重复观测；
附图3-附图5的说明：
本发明实施例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明前、光透明化当天、第二天和一周后的效果图分别见图3a、图3b、图3c和图3d；通过图3a、图3b、图3c和图3d可以看出，颅骨光透明窗建立后的当天、第二天和一周后的分辨率基本相同，成像效果良好，实现大脑皮层血管的长期重复观测，操作简单、成像质量高。
本发明对比例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明前、光透明化当天、液体试剂去除后效果图分别见图4a、图4b和图4c；表明液体试剂去除后无法成像，对于需要长期观测的场景需要重复实施透明步骤；
本发明对比例1对两月龄Balb/c小鼠实施活体颅骨组织光透明前、光透明化后效果图分别见图5a和图5b；表明只滴加紫外光固化胶，透明效果差，成像质量不好。
上述本申请实施例中的技术方案，至少含有如下的技术效果或优点：
1、本发明实施例提供的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，获得的颅骨光透明窗能有效降低小鼠颅骨散射，实现对皮层血管网络的高分辨观测；
2、本发明实施例提供的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，获得的颅骨光透明窗能使颅骨长期保持透明，在数周内运用光学显微技术对皮层进行成像观测的分辨率基本没有下降。
3、本发明实施例提供的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂和方法，进行单次处理即可获得长期透明的颅骨光透明窗，方法简单，成像效果好。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，其特征在于，包括：
质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液；
质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液；
紫外光固化胶。
2.根据权利要求1所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，其特征在于，所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液的质量分数为27％-28％。
3.根据权利要求1所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，其特征在于，所述阴离子表面活性剂水溶液的质量分数为17％-18％。
4.根据权利要求1所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，其特征在于，所述酰胺类有机化合物及其衍生物为碳酰胺或丙二酰脲。
5.根据权利要求1所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，其特征在于，所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液中的醇溶液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的浓度为73％-77％。
6.根据权利要求1所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明试剂，其特征在于，所述阴离子表面活性剂包括磺酸盐型阴离子表面活性剂和硫酸酯类阴离子表面活性剂中的一种。
7.一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法，其特征在于，所述方法包括：
固定颅骨；
向所述颅骨表面滴加质量分数为25％-30％的酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液，后擦净，获得第一预处理颅骨；
向所述第一预处理颅骨表面滴加质量分数为15％-20％的阴离子表面活性剂水溶液，后擦净，获得第二预处理颅骨；
向所述第二预处理颅骨表面滴加紫外光固化胶，后固化，获得颅骨光透明窗。
8.根据权利要求7所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法，其特征在于，所述向所述第二预处理颅骨滴加紫外光固化胶，后固化，获得颅骨光透明窗，包括：
向所述第二预处理颅骨滴加紫外光固化胶，后在所述外光固化胶上放置盖玻片，再固化以使玻片与颅骨胶合，获得颅骨光透明窗。
9.根据权利要求7所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法，其特征在于，所述固定颅骨包括：采用带孔固定片固定颅骨。
10.根据权利要求7所述的一种用于长期观测大脑皮层的颅骨光透明方法，其特征在于，质量分数为25％-30％的所述酰胺类有机化合物及其衍生物的醇溶液、质量分数为15％-20％的所述阴离子表面活性剂水溶液和所述紫外光固化胶的使用体积比为(2-4.5)：(1-2.5)：(0.5-1.5)。
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