CN114945598B - 基质金属蛋白酶1的单克隆抗体、其检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
基质金属蛋白酶1的单克隆抗体、其检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开内容提供基质金属蛋白酶1的单克隆抗体，该单克隆抗体的重链可变区之氨基酸序列包含i)选自于SEQ ID NO:1、7及13所组成的组的CDR1，ii)选自于SEQ ID NO:2、8及14所组成的组的CDR2，以及iii)选自于SEQ ID NO:3、9及15所组成的组的CDR3；该单克隆抗体的轻链可变区之氨基酸序列包含i)选自于SEQ ID NO:4、10及16所组成的组的CDR1，ii)选自于SEQ ID NO:5、11及17所组成的组的CDR2，以及iii)选自于SEQ IDNO:6、12及18所组成的组的CDR3。同时提供编码所述单克隆抗体的多核苷酸序列及与其互补的多核苷酸序列。本公开内容还提供含有前述单克隆抗体的基质金属蛋白酶1检测试剂盒及检测方法。
Description
【技术领域】
本公开内容涉及MMP-1以及口腔癌的检测方法，且特别是MMP-1的单克隆抗体、含有MMP-1单克隆抗体的检测试剂盒、以及使用检测试剂盒的检测方法。
【现有技术】
根据世界卫生组织统计，每年新罹患口腔癌人数超过529,000例，由于发生率逐年攀高，预期到2035年人数会达到一年856,000例。在中国台湾，根据卫生福利事务主管部门的2016年死因统计资料，口腔癌、口咽癌及下咽癌占所有男性恶性肿瘤死因的第4位。每年新诊断罹患病人数约7000人，死亡人数约3000人。在2012到2016之间，口腔癌病患发现期别从I到IV期的存活率分别为：79.9％、71.0％、56.5％和35.6％，若能及早发现，则存活率将得以改善。
目前口腔黏膜筛检为口腔癌临床评估的重要手段，由病灶处的组织切片检查结果做为诊断依据。然而目前口腔黏膜的筛检需由专业的口腔保健人员(如：牙医、口腔卫生保健师、牙科治疗师、口腔卫生治疗师等)施行，许多区域会因为缺乏专业的口腔保健人员而延误口腔癌的诊出时间。因此，若能分析样本中是否具有肿瘤标志(Biomarker)，可提高口腔癌的早期诊出率。
目前口腔癌并没有作为常规辨识的肿瘤标志。依据2016年美国国家科学院月刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica；PNAS)的报导，以质谱定量分析法定量基质金属蛋白酶1(matrixmetalloproteinase-1；MMP-1)，呈现出MMP-1在病人与对照组的唾液样本间表现量差异高达83倍(其它分子的倍数差异是-1.3～5.5倍)，为最有潜力做为口腔癌肿瘤标志的分子。
由于现行针对MMP-1的质谱定量分析法并不适用于大量样本的常规定量分析，因此希望针对MMP-1开发检测试剂盒，以供口腔癌的筛检之用。
【发明内容】
本公开内容中的一些实施方式中提供一种单克隆抗体，包括重链可变区序列与轻链可变区序列。重链可变区序列包含i)选自于SEQ ID NO:1、7及13所组成的组的CDR1，ii)选自于SEQ ID NO:2、8及14所组成的组的CDR2，以及iii)选自于SEQ ID NO:3、9及15所组成的组的CDR3；轻链可变区序列包含i)选自于SEQ ID NO:4、10及16所组成的组的CDR1，ii)选自于SEQ ID NO:5、11及17所组成的组的CDR2，以及iii)选自于SEQ ID NO:6、12及18所组成的组的CDR3。
在一些实施方式中，重链可变区序列包含SEQ ID NO:1、2、及3的氨基酸序列，并且轻链可变区序列包含SEQ ID NO:4、5、及6的氨基酸序列。
在一些实施方式中，重链可变区序列包含SEQ ID NO:7、8、及9的氨基酸序列，并且轻链可变区序列包含SEQ ID NO:10、11、及12的氨基酸序列。
在一些实施方式中，重链可变区序列包含SEQ ID NO:13、14、及15的氨基酸序列，并且轻链可变区序列包含SEQ ID NO:16、17、及18的氨基酸序列。
本公开内容中的一些实施方式中提供一种多核苷酸，多核苷酸编码出前述的氨基酸序列，或具有与编码出前述单克隆抗体的核苷酸序列互补的序列。
本公开内容中的一些实施方式中提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含单克隆抗体A，其中所述单克隆抗体A包含重链可变区与轻链可变区，重链可变区包含SEQ IDNO:1、2、及3的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:4、5、及6的氨基酸序列。
在一些实施方式中，检测试剂盒还包含酶免疫分析试剂组、胶体金免疫试片或其组合。
在一些实施方式中，酶免疫分析试剂组包含单克隆抗体B。所述单克隆抗体B包含重链可变区与轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO:7、8、及9的氨基酸序列；轻链可变区包含SEQ ID NO:10、11、及12的氨基酸序列。
在一些实施方式中，单克隆抗体B连接呈色基团。
在一些实施方式中，胶体金免疫试片包含单克隆抗体C。所述单克隆抗体C包含重链可变区与轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO:13、14、及15的氨基酸序列；轻链可变区包含SEQ ID NO:16、17、及18的氨基酸序列。
在一些实施方式中，胶体金免疫试片还包含单克隆抗体A，而胶体金免疫试片中的单克隆抗体A连接金粒子。
在本公开内容的一些实施方式中提供体外检测基质金属蛋白酶1的检测方法，包含使用前述的检测试剂盒检测样本中的基质金属蛋白酶1。
在一些实施方式中，样本包含体液或血液。
在一些实施方式中，体液包含口腔分泌物或呼吸道分泌物。
【附图简单说明】
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的说明如下：
图1A以及图1B例示本发明的一实施例中以酶免疫分析法测定自行生产的单克隆抗体对基质金属蛋白酶1的结合能力比较图；
图2A以及图2B例示本发明的一实施例中分别以四种较佳配对的单克隆抗体做为酶免疫分析法的捕获抗体以及侦测抗体，针对正常人(图2A)以及口腔癌病人(图2B)的唾液进行酶免疫分析法所测得的浓度分布图；
图3A例示本发明的一实施例中的胶体金免疫试片的示意图；
图3B例示本发明的一实施例中以比色卡呈现胶体金免疫试片检测的等级分的示意图；以及
图4例示本发明的一实施例中胶体金免疫试片与酶免疫分析试剂组交叉比对的散布关系图。
【实施方式】
为了使本发明的叙述更加详尽与完备，下文详细描述本发明的实施方式与具体实施例；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所公开的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本发明的实施例。
于本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则『一』与『该』可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，于本文中所使用的「包含」、「包括」、「具有」及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、组件与/或组件，但不排除其它的特征、区域、整数、步骤、操作、组件、组件，与/或其中的群组。
虽然下文中利用一系列的操作或步骤来说明在此公开的方法，但是这些操作或步骤所示的顺序不应被解释为本发明的限制。例如，某些操作或步骤可以按不同顺序进行及/或与其它步骤同时进行。此外，并非必须执行所有操作、步骤及/或特征才能实现本发明的实施方式。再者，在此所述的每一个操作或步骤可以包含数个子步骤或动作。
于本文中，「CDR」(complementarity determining regions，互补决定区)，是抗原与抗体接触的区域，为抗体可变区中的一部分，一般抗体可变区中的CDR有三个，分别为CDR1、CDR2、以及CDR3。
于本文中，「衍生序列」系指在核苷酸序列的3’端或5’端进行修饰的序列。
在本公开内容的一些实施方式中提出一种可辨识基质金属蛋白酶1(MMP-1)的单克隆抗体，包括重链可变区序列以及轻链可变区序列。重链可变区序列包含i)选自于SEQID NO:1、7及13所组成的组的CDR1，ii)选自于SEQ ID NO:2、8及14所组成的组的CDR2，以及iii)选自于SEQ ID NO:3、9及15所组成的组的CDR3；轻链可变区序列包含i)选自于SEQ IDNO:4、10及16所组成的组的氨基酸序列的CDR1，ii)选自于SEQ ID NO:5、11及17所组成的组的CDR2，以及iii)选自于SEQ ID NO:6、12及18所组成的组的CDR3。
在一些实施方式中，重链可变区序列包含SEQ ID NO:1、2、及3的氨基酸序列，并且轻链可变区序列包含SEQ ID NO:4、5、及6的氨基酸序列。在一些实施方式中，重链可变区序列包含SEQ ID NO:7、8、及9的氨基酸序列，并且轻链可变区序列包含SEQ ID NO:10、11、及12的氨基酸序列。在一些实施方式中，重链可变区序列包含SEQ ID NO:13、14、及15的氨基酸序列，并且轻链可变区序列包含SEQ ID NO:16、17、及18的氨基酸序列。
在本公开内容的一些实施方式中提供一种多核苷酸，其可编码出前述的氨基酸序列，或具有与前述多核苷酸序列互补的序列。在一实施方式中，多核苷酸可进一步包含衍生序列。
在本公开内容的一些实施方式中提供一种检测试剂盒，其中所述检测试剂盒可用于检测临床样本，例如体液(举例而言口腔分泌物或呼吸道分泌物)或血液。检测试剂盒包含单克隆抗体A。单克隆抗体A的重链可变区包含SEQ ID NO:1、2、及3的氨基酸序列；单克隆抗体A的轻链可变区包含SEQ ID NO:4、5、及6的氨基酸序列。在一些实施方式中，单克隆抗体A的重链可变区包含CDR1为SEQ ID NO:1、CDR2为SEQ ID NO:2、及CDR3为SEQ ID NO:3的氨基酸序列；单克隆抗体A的轻链可变区包含CDR1为SEQ ID NO:4、CDR2为SEQ ID NO:5、及CDR3为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施方式中，检测试剂盒包含酶免疫分析试剂组、胶体金免疫试片或其组合。
在一些实施方式中，酶免疫分析试剂组采用三明治酶免疫分析法(sandwichenzyme-linked immunosorbent assay；sandwich ELISA)，并以单克隆抗体A作为捕获抗体(capture antibody)。在一实施方式中，酶免疫分析试剂组包含单克隆抗体A以及单克隆抗体B，其中单克隆抗体A作为捕获抗体，而单克隆抗体B连接呈色基团，作为侦测抗体(detection antibody)。单克隆抗体B的重链可变区包含SEQ ID NO:7、8、及9的氨基酸序列，单克隆抗体B的轻链可变区包含SEQ ID NO:10、11、及12的氨基酸序列。在一实施方式中，单克隆抗体B的重链可变区包含CDR1为SEQ ID NO:7、CDR2为SEQ ID NO:8、及CDR3为SEQID NO:9的氨基酸序列；单克隆抗体B的轻链可变区包含CDR1为SEQ ID NO:10、CDR2为SEQID NO:11、及CDR3为SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一实施方式中，呈色基团包含荧光基团或化学发光基团(例如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP))。
值得注意的是，本公开内容的一些实施方式中，揭示了使用人类重组MMP-1(全长MMP-1)作为免疫原，自行生产出11株单克隆抗体，并从中筛选出可用于酶免疫分析试剂组的单克隆抗体配对(捕获抗体:单克隆抗体A；以及侦测抗体:单克隆抗体B)，克服了单克隆抗体连接呈色基团可能衍生的结合MMP-1的能力大幅下降、检测临床样本常发生的背景值过高、以及灵敏度不足的限制，相对于其他配对(有些配对甚至无法检测MMP-1)，具有较佳的灵敏度。此外，需要强调的是，这样的配对与单克隆抗体结合MMP-1的能力强弱并无相关性。更值得一提的是，相对于捕获抗体使用市售抗体(免疫原为MMP-1的第20-469个氨基酸)、以使用无蛋白酶活性的MMP-1作为免疫原生产的其他单克隆抗体、或以MMP-1片段(例如MMP-1的第100-300个氨基酸中的任一片段，或是不含蛋白酶活性的片段)作为免疫原免疫产生的多株抗体的抗体配对，本公开内容的一些实施方式的单克隆抗体配对，更具有较高的灵敏度。
在一些实施方式中，胶体金免疫试片包含胶金垫与测定板，两者相互搭接，胶金垫上喷涂包含侦测抗体-金粒子偶合物的胶金垫溶液，测定板表面具有硝化纤维膜，含有捕获抗体的溶液涂布于其上，作为测定线。在一实施方式中，胶体金免疫试片包含单克隆抗体A以及单克隆抗体C，单克隆抗体A作为连接金粒子的侦测抗体，而单克隆抗体C则做为捕获抗体。单克隆抗体C的重链可变区包含SEQ ID NO:13、14、及15的氨基酸序列，单克隆抗体C的轻链可变区包含SEQ ID NO:16、17、及18的氨基酸序列。在一些实施方式中，单克隆抗体C的重链可变区包含CDR1为SEQ ID NO:13、CDR2为SEQ ID NO:14、及CDR3为SEQ ID NO:15的氨基酸序列；单克隆抗体C的轻链可变区包含CDR1为SEQ ID NO:16、CDR2为SEQ ID NO:17、及CDR3为SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
值得注意的是，本公开内容的一些实施方式中，自可用于酶免疫分析试剂组的单克隆抗体配对中，筛选出可用于胶体金免疫试片的单克隆抗体组合(捕获抗体:单克隆抗体C；以及侦测抗体:单克隆抗体A)，侦测抗体克服了部分单克隆抗体无法连接金粒子的问题，顺利与金粒子连接，且相对于其他组合而言，具有较佳的灵敏度。此外，更同时揭示了，在酶免疫分析试剂组中灵敏度最佳的配对，未必于胶体金免疫试片中也呈现最佳灵敏度。也就是，若欲将一种检测系统中的抗体配对应用于其他检测系统，灵敏度的优劣仍需经实际的试验验证，与既有已知的检测系统不一定正相关。
本公开内容的一些实施方式中，提供一种基质金属蛋白酶1的检测方法，包含使用前述的检测试剂盒检测样本中的基质金属蛋白酶1，例如可通过判读检测试剂盒中的酶免疫分析试剂组、胶体金免疫试片、或前述组合的呈色的有无或呈色量化的读值(例如光密度(Optical Density value；OD值)，检测基质金属蛋白酶1的有无或是含量。在一些实施方式中，样本包含体液(例如口腔分泌物或呼吸道分泌物)或血液。在一实施方式中，检测试剂盒可使用酶免疫分析试剂组进行定量，并以胶体金免疫试片进行快筛，藉此，可同时取得定性以及定量的结果。
由于MMP-1可作为口腔癌的检测指标，通过本公开内容的一些实施方式所提供的MMP-1的检测试剂盒与检测方法，可同步作为口腔癌筛检之用。而这样的应用，无须由专业的口腔保健人员执行，可提升筛检的普及度，加速口腔癌病人的确诊，提升治愈的机率。
为进一步说明本公开内容的各种实施方式所提供的基质金属蛋白酶1的单克隆抗体、多核苷酸、检测试剂盒、及检测方法，遂进行以下实施。应注意的是，下述实施例仅提供作为示范目的，而非限制本发明。
实施例一、单克隆抗体的开发流程
首先，使用保留蛋白酶活性的人类MMP-1重组蛋白质做为免疫原，经由小鼠的免疫反应，开发小鼠的MMP-1单克隆抗体细胞株，并从中筛选出11株小鼠单克隆抗体细胞株，收取细胞液并纯化出各单克隆抗体，并分别命名为：1-8A12株、4-26株、6-2株、20-4株、30-22株、31-34株、44-28株、57-41株、61-24株、73-1株以及79-4株。
实施例二.1、用于检测MMP-1的酶免疫分析试剂组-测试各单克隆抗体结合MMP-1的能力
为了测试各单克隆抗体是否可专一性结合MMP-1，在连续稀释前述11株单克隆抗体后，使用直接酶免疫分析法(direct ELISA)测试单克隆抗体对人类重组MMP-1的结合反应，结果如图1A所示。
图1A呈现，各单克隆抗体均会与MMP-1专一性结合，而不同的单克隆抗体对MMP-1的结合能力不同，结合能力由强到弱依序是：6-2株>73-1株>1-8A12株>4-26株>20-4株>31-34株>44-28株>61-24株>30-22株>57-41株>79-7株。
另外，为测试单克隆抗体是否可做为酶免疫分析中的侦测抗体之用，也就是单克隆抗体在连接呈色基团后，是否仍具有MMP-1的结合能力。将各单克隆抗体连接HRP后，同前述图1A的流程进行MMP-1的结合能力测试，结果如图1B所示。
图1B呈现，各单克隆抗体在连接HRP后，仍具有专一性结合人类重组MMP-1的能力。然而，相对于图1A，连接HRP的单克隆抗体所呈现的对于人类重组MMP-1的结合能力的略有所改变，由强到弱依序是：73-1-HRP>4-26-HRP＝6-2-HRP>44-28-HRP>31-34-HRP>1-8A12-HRP>20-4-HRP>61-24-HRP>57-41-HRP>30-22-HRP>79-7-HRP。
实施例二.2、用于检测MMP-1的酶免疫分析试剂组-筛选抗体配对
将上述11株单克隆抗体分别做为酶免疫分析试剂组中的捕获抗体以及侦测抗体(连接HRP)，进行两两配对测试，虽理论上会产生11x10＝110种组合的配对，然而，由于有3株单克隆抗体在配对测试中效果极差，因此予以剔除，实际上共完成92种组合的配对测试，接着，从中筛选出可以检测MMP-1的较佳配对。
各配对的测试过程，以1-8A12株做为范例，说明如下：1.将1-8A12株作为捕获抗体，4-26-HRP做为侦测抗体进行三明治酶免疫分析法(Sandwich ELISA)。捕获抗体包含4种浓度，侦测抗体则是6种浓度，一组配对共测试24种条件，计算这24种条件中，含人类重组MMP-1的溶液(样品值)以及不含人类重组MMP-1的溶液(背景值)之间的OD值差异(样品值-背景值)，数值越高表示抗体配对可侦测的MMP-1的结合能力越佳。2.依前述步骤1完成共92组配对测试，结果列于下表1，表格数值为在配对测试中，各配对的OD值差异最大的数值。
表1、各配对的样品值扣除背景值的最大差值表
注：差值<0.5的用「-」标示，没有进行测试的用「NA」标示。
表1呈现，配对测试中讯号较强(差值较高)的单克隆抗体配对，与个别单克隆抗体的MMP-1结合能力并无绝对关系。也就是，适用于酶免疫分析试剂组的较佳抗体配对无法由个别单克隆抗体的MMP-1结合能力决定，必须实际进行配对测试才能筛选得出。
实施例二.3、用于检测MMP-1的酶免疫分析试剂组-各抗体配对的标准浓度曲线
根据实施例二.2的结果，从中挑选12种抗体配对(整理列表于表2)，进行三明治酶免疫分析法，测试个别抗体配对可侦测的人类重组MMP-1标准浓度曲线范围，结果呈现于表3。
表2、各抗体配对的比较表
表3、抗体配对测试的标准浓度曲线范围对照表
表3结果呈现，测试0.01至2.5奈克/毫升之间的人类重组MMP-1的浓度范围，各配对的OD值均随着MMP-1浓度增加而升高。
接着，用回收率(Recovery)评估各组抗体配对可侦测的标准曲线浓度范围，设定Recovery80-120为可信赖范围，落在可信赖范围内的浓度用星号标示。结果呈现，12种抗体配对的标准曲线浓度范围有差异，且有些配对在低浓度时还有负值的现象，表示背景值较高，不利于低浓度样本的侦测。
实施例二.4、用于检测MMP-1的酶免疫分析试剂组-侦测临床唾液样本中的内生MMP-1
接着，以实施例2.3的12种抗体配对侦测8个已知内生MMP-1含量的临床唾液样本(含量以多重液相层析-多重反应监测质谱分析(Multiplex LC-MRM-MS)测定)，确认抗体配对除了可侦测人类重组MMP-1外，是否还可以在临床唾液样本中侦测到内生MMP-1，结果见于表4。
表4、抗体配对侦测唾液样本中的内生MMP-1的OD值比较表
结果显示，12种抗体配对都可以侦测到唾液样本中内生的MMP-1，大部分配对测到的MMP-1含量与实际含量有一致性，显示12种抗体配对用于侦测唾液样本的MMP-1时，也有足够的特异性。根据表4结果，从中选择灵敏度较佳的No.2、No.4、No.5、No.10做进一步评估。
为评估临床应用的可行性，收集包含15个来自正常健康人(Healthy Control,HC)以及25个来自口腔癌病人(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)的临床唾液样本，稀释5倍进行酶免疫分析实验，结果请见图2A(正常人组)以及图2B(口腔癌病人组)。并以图2A以及图2B进一步进行数据分析。
结果呈现，不论是在正常人或口腔癌病人组，4种抗体配对测得数值有显著相关(斯皮尔曼等级相关系数(Spearman’s rho)＝0.953-0.988)；此外，受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve；ROC)分析结果，呈现4种抗体配对都适用于侦测唾液样本的内生性MMP-1(受试者工作特征曲线下方的面积(Area Under the Curveof ROC；AUC of ROC)＝0.937-0.967)，四种配对通过ROC分析而得的灵敏度以及特异性，整理于表5。
表5、抗体配对的灵敏度以及特异性分析
| 配对编号 | 灵敏度 | 特异性 |
| No.2 | 80.00％ | 100.00％ |
| No.4 | 94.40％ | 80.00％ |
| No.5 | 76.20％ | 100.00％ |
| No.10 | 88.00％ | 93.30％ |
根据表5，选择具有较高的灵敏度的抗体配对No.4，用于制备MMP-1酶免疫分析试剂组。
实施例二.5、用于检测MMP-1的酶免疫分析试剂组-功能性试验
根据美国临床和实验室标准化协会所公布的标准规范(Global LaboratoryStandards for a Healthier World)，对于使用抗体配对No.4的MMP-1酶免疫分析试剂组，进行功能性试验，结果如下。
1.灵敏度分析(参照规范Ep17-A2)，空白品侦测极限(Limit of blank；LoB)为57.40皮克/毫升，待测品侦测极限(Limit of Detection；LoD)为117.02皮克/毫升。
2.线性分析(参照规范Ep06-A)，最佳非线性多项式为3级回归，浓度在140～8000皮克/毫升间为线性分布(非线性度≦5％)。
3.精密度分析(参照规范Ep05-A3)，可重复性(repeatability)的CV(％)平均为4.809％，实验室内精密度(within-laboratory precision)的CV(％)平均为9.569％。
实施例三.1、用于检测MMP-1的胶体金免疫试片-抗体搭配组合的挑选
接着，进一步测试自行生产的单克隆抗体中，适用于检测MMP-1的胶体金免疫试片的抗体组合。胶体金免疫试片1的示意图请见图3A，包含胶金垫110与测定板120，两者可相互迭设，例如胶金垫110迭设于测定板120上或是测定板120迭设于胶金垫110上，胶金垫110上喷涂包含侦测抗体-金粒子偶合物的胶金垫溶液111，测定板120表面覆盖硝化纤维膜，接着，使用含有捕获抗体的溶液涂布测定线122于硝化纤维膜上。另外，亦可根据需求，涂布含有可作为内控抗体的溶液于硝化纤维膜上，作为内控线121。在测定时，将样本添加至含有侦测抗体-金粒子偶合物的胶金垫110上，样本将通过免疫层析作用由胶金垫110移动至测定板120上的硝化纤维膜，若MMP-1已与侦测抗体-金粒子偶合物结合，则测定线122上的捕获抗体将捕获与侦测抗体-金粒子偶合物结合的MMP-1，进而聚集形成橘色至红色讯号(金粒子的颜色)。因此，通过测定线122呈色与否，可判读测定结果。
为挑选抗体搭配的组合，将实施例二.4中呈现较佳灵敏度的4种抗体配对(No.2、No.4、No.5、No.10)，其中所用的到单克隆抗体：1-8A12株、6-2株、20-4株、31-34株以及73-1株，进行配对组合测试如下。
首先，将5株抗体分别与奈米级胶金颗粒(直径<100奈米)反应形成「侦测抗体-金粒子偶合物」。然而，由于1-8A12株与73-1株与胶金颗粒反应不佳，金粒子无法连接于侦测抗体上，因此，仅以6-2-金粒子、20-4-金粒子、31-34-金粒子，与人类重组MMP-1进行配对测试，总计共有10种配对组合，结果见于表6。
表6、用于胶体金免疫试片的抗体配对组合的测定极限
根据表6，由于组合C可达成较佳灵敏度，因此，选择组合C进行后续的临床样本测试。
实施例三.2、用于检测MMP-1的胶体金免疫试片-临床样本的测试
为评估以含有组合C的胶体金免疫试片检测临床样本的可行性，进行215组唾液样本的检测测试，并同步用酶免疫分析法进行交叉比较。
胶体金免疫试片部分，请参考图3B。将样本反应程度对照比色卡进行评分，比色卡依测定线122呈色强度分为0～5分，套用比色卡打分会有0、0-1(0.5)、1、1-2(1.5)、2、2-3(2.5)、3、3-4(3.5)、4、4-5(4.5)、5、>5(5.5)，共12个等级分。接着，将比色卡的等级分与酶免疫分析法测得的MMP-1浓度做X-Y分布图，结果请见图4。
图4呈现，胶体金免疫试片与酶免疫分析法的测定结果呈正相关，而相关性分析结果为R＝0.871(p<0.0001)。即，含有组合C的胶体金免疫试片可用于侦测临床唾液样本中的MMP-1。
综上所述，本公开内容的实施例揭示了有效用于侦测临床样本中内生MMP-1的检测方法。检测方法至少可包含：酶免疫分析试剂，使用单克隆抗体配对为No.4(捕获抗体:31-34株以及侦测抗体:73-1株)与胶体金免疫试片，使用单克隆抗体配对为组合C(捕获抗体:1-8A12株以及侦测抗体:31-34株)，各单克隆抗体的氨基酸序列、主要特征、以及对应的序列表编号如下表7所示。
表7、31-34、73-1及1-8A12的序列比对表
实施例四、与对照组的检测结果比较
实施例二至三的开发过程中，各检测同时亦采用若干对照组作为捕获抗体，自行生产的1-8A12作为侦测抗体，检测结果同步进行比对分析。对照组抗体请见表8，其中包含市售抗体(编号7)、MMP-1肽片段做为免疫原生产的多株抗体(编号1至4)、以无蛋白酶活性的MMP-1做为抗原生产的多株抗体(编号5至6)及使用无蛋白酶活性的MMP-1作为免疫原生产的其他小鼠单克隆抗体(编号8至16)共16支抗体。
表8、对照组的抗体制备流程信息表
注:表格中的A.A.表示氨基酸(amino acid)
比对结果呈现，大部分抗体在直接酶免疫分析法的阶段皆可有效结合人类重组MMP-1，但是进入到抗体配对过程，很多配对会出现非专一性结合过高的情况，且灵敏度普遍不足。在对照组做为捕获抗体与自行生产的抗体做为侦测抗体的配对中，最佳的配对是市售抗体MAB901搭配1-8A12-HRP，然而其标准浓度曲线范围(表9A)以及在唾液样本中(表9B)侦测MMP-1的效力都比自行生产的抗体配对差。因此，本公开内容的实施例所筛选的配对，其灵敏度优于捕获抗体使用市售抗体、以使用无蛋白酶活性的MMP-1作为免疫原生产的其他单克隆抗体、或以MMP-1片段作为免疫原免疫产生多株抗体的抗体配对。
表9A、对照组的标准浓度曲线范围与自行筛选的抗体配对数值对照表
表9B、对照组与自行筛选的抗体配对分别用于侦测唾液样本的结果对照表
【符号说明】
1:胶体金免疫试片
110:胶金垫
120:测定区
121:内控线
122:测定线
序列表
<110> 世延生医股份有限公司
<120> 基质金属蛋白酶1的单克隆抗体、其检测试剂盒及其检测方法
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1 5
Claims (3)
1.一种单克隆抗体，其特征在于，选自：
单克隆抗体A，其中该单克隆抗体A的重链可变区包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3的氨基酸序列，并且该单克隆抗体A的轻链可变区包含SEQID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3的氨基酸序列；
单克隆抗体B，其中该单克隆抗体B的重链可变区包含SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:8的CDR2和SEQ ID NO:9的CDR3的氨基酸序列，并且该单克隆抗体B的轻链可变区包含SEQID NO:10的CDR1、SEQ ID NO:11的CDR2和SEQ ID NO:12的CDR3的氨基酸序列；或
单克隆抗体C，其中该单克隆抗体C的重链可变区包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ IDNO:14的CDR2和SEQ ID NO:15的CDR3的氨基酸序列，并且该单克隆抗体C的轻链可变区包含SEQ ID NO:16的CDR1、SEQ ID NO:17的CDR2和SEQ ID NO:18的CDR3的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码出如权利要求1所述的单克隆抗体的氨基酸序列，或为与前述编码出该氨基酸序列的核苷酸序列互补的序列。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包含酶免疫分析试剂组、胶体金免疫试片或其组合，其中，
该酶免疫分析试剂组包含单克隆抗体A以及单株抗体B，该单克隆抗体B连接呈色基团，
其中该单克隆抗体A的重链可变区包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQID NO:3的CDR3的氨基酸序列，并且该单克隆抗体A的轻链可变区包含SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3的氨基酸序列，
该单克隆抗体B的重链可变区包含SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:8的CDR2和SEQ IDNO:9的CDR3的氨基酸序列，并且该单克隆抗体B的轻链可变区包含SEQ ID NO:10的CDR1、SEQ ID NO:11的CDR2和SEQ ID NO:12的CDR3的氨基酸序列；
该胶体金免疫试片包含该单克隆抗体A以及单株抗体C，该胶体金免疫试片中的该单克隆抗体A连接金粒子，
其中该单克隆抗体C的重链可变区包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:14的CDR2和SEQ ID NO:15的CDR3的氨基酸序列，并且该单克隆抗体C的轻链可变区包含SEQ ID NO:16的CDR1、SEQ ID NO:17的CDR2和SEQ ID NO:18的CDR3的氨基酸序列。
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