CN114940689A - 一种用于检测线粒体温度的荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

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CN114940689A CN202210372171.1A CN202210372171A CN114940689A CN 114940689 A CN114940689 A CN 114940689A CN 202210372171 A CN202210372171 A CN 202210372171A CN 114940689 A CN114940689 A CN 114940689A
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王凯
卢奇
朱勍
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Abstract

本发明目的是提供一种可以用于检测温度的线粒体靶向荧光探针及其制备方法与应用。所述近红外荧光化合物在制备用于线粒体温度检测的荧光探针中的应用。具体的，所述荧光探针用于测定细胞内温度，检测温度范围为25‑60℃，荧光强度最大可改变约32倍。

Description

一种用于检测线粒体温度的荧光探针及其制备与应用
(一)技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种用于检测线粒体温度的荧光探针及其制备方法与应用。
(二)背景技术
线粒体温度是反应细胞生命活动的重要参数，因为线粒体参与真核细胞代谢活动时，有许许多多的酶参与了线粒体生命活动的调控，线粒体温度会随着细胞生命活动的变化而改变，从而造成线粒体的温度与细胞中其他细胞器有着很大差别。线粒体温度的异常也常作为反映线粒体生命活动异常的依据，进一步用作疾病方面的研究，这使得线粒体温度的研究十分有意义。近年来，有一些检测线粒体温度的方法被提出，但大多依赖外部设备嵌入，很难准确标记线粒体；或者是对于温度的敏感性不高。由此，目前线粒体靶向的温度检测存在诸多限制，急需开发一种新型可应用于细胞层面的以线粒体为靶向的温度检测手段。
近年来，小分子荧光探针凭借着其灵敏性、靶向性以及生物体的微创性，成为了细胞层面实时检测成像的重要工具。自然而然的将小分子荧光探针与线粒体温度检测融合在一起。为此，本专利设计的线粒体靶向的温度探针凭借其优异的温度敏感性和线粒体靶向，可成为研究线粒体以及其他细胞器温度等科学技术领域一个有效工具，并在临床诊断领域提供早期诊断。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种可以用于检测温度的线粒体靶向荧光探针，及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种式(1)所示化合物：
Figure BDA0003588997370000021
本发明还涉及上述式(1)所示化合物的制备方法，所述方法包括：
(1)将4-二乙基氨基水杨醛、碳酸铯溶于无水乙腈中，在62-67℃下搅拌30-45min(优选65℃反应30min)；加入化合物(2)，在81-83℃下回流反应10-12h(优选82℃回流反应10h)，所得反应液A经后处理A后，得到化合物(3)(无其他杂点，直接进行下一步反应)；所述化合物(2)、4-二乙基氨基水杨醛与碳酸铯的物质的量之比为1:1～1.2:1.7～2(优选1:1:2)；
Figure BDA0003588997370000022
(2)将丙二腈、对二乙氨基苯乙酮、乙酸、乙酸铵加入甲苯中，110-112℃回流反应15-20h(优选111℃回流反应18h)，所得反应液B经后处理B后，得到化合物(4)；所述丙二腈、对二乙氨基苯乙酮、乙酸与乙酸铵的物质的量之比为13～15：4～5：5～5.5：1(优选15：5：5.5：1)；
Figure BDA0003588997370000031
(3)将步骤(1)所述的化合物(3)、步骤(2)所述的化合物(4)以及哌啶加入乙醇中，78-80℃回流反应2-3h(优选80℃回流反应2h)，所得反应液C经后处理C后，得到化合物(1)；所述化合物(3)、化合物(4)与哌啶的物质的量之比为1:1～1.2:0.2～0.4(优选1:1:0.2)；
Figure BDA0003588997370000032
进一步，步骤(1)所述无水乙腈的体积以化合物(2)的质量计为10-12mL/g(优选10.41mL/g)。
进一步，步骤(1)中所述后处理A为：将所述反应液A过滤并收集固体，用二氯甲烷溶解并萃取并收集有机相；将有机相减压浓缩，得到化合物(3)，为棕色油状物。
进一步，步骤(2)中所述甲苯的体积以对二乙氨基苯乙酮的质量计为50-53mL/g(优选52.63mL/g)。
进一步，步骤(2)中所述后处理B为：将所述反应液B冷却至室温后，抽滤，所得滤饼用体积比为5:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行硅胶柱色谱纯化，减压浓缩，得到化合物(4)，为浅黄色固体。
进一步，步骤(3)中所述乙醇的体积以化合物(4)的质量计为55-57mL/g(优选56.81mL/g)。
进一步，步骤(3)中所述后处理C为：所述反应液C经二氯甲烷萃取，取有机相进行减压浓缩，以二氯甲烷为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩，得到式(1)所示化合物。
第三方面，本发明还提供上述式(1)所示化合物作为荧光探针在温度检测中的应用，尤其是靶向线粒体在线粒体的温度检测中的应用。
本发明中字母A-C只是为了区分不同阶段中的相同步骤或物质，方便描述，无其它特殊含义。
本专利所述化合物(2)为公开化合物，制备方法可参考文献(Garam Han,Prof.Dr.Dongwook Kim,Prof.Dr.Younbong Park,Prof.Dr.Jean Bouffard,Prof.Dr.Youngmi Kim,Excimers Beyond Pyrene:A Far-Red Optical ProximityReporter and its Application to the Label-Free Detection of DNA,(2015)3912-3916)。
与现有小分子荧光探针相比，本发明的有益效果体现在：
如参考文献(Satoshi Arai,Madoka Suzuki,Sung Jin Park,Mitochondria-targeted fluorescent thermometer monitors intracellullar temperaturegradient,SRC，2015，51，8044-8047)所述化合物(c)：
Figure BDA0003588997370000051
所述化合物(a)进行了线粒体温度与荧光强度变化的检测，其荧光强度对温度的敏感性不高：温度从20℃提升到45℃，荧光强度降低不到两倍，需要复杂的检测分析仪器才能取得理想的效果，难以在复杂的环境中准确的检测线粒体的温度。
根据前人线粒体靶向温度探针以及自身温度敏感化合物的筛选，本发明在化合物(1)的设计中加入了温度敏感的氮二乙基以及线粒体靶向基团三苯基膦，并选用丙二腈为化合物(1)的吸电子基团。经检测验证化合物(1)荧光性能激发为ex＝460nm，em＝630nm，随着温度从20℃逐渐升温42℃，荧光强度变化约4倍，温度从25℃逐渐升温至60℃，荧光强度减弱约32倍，并且具有较好的线性关系，同时拥有良好的线粒体靶向性。因此化合物(1)可应用于线粒体温度的荧光定量检测，能够在线粒体温度的研究工作中充当一种有效的研究工具。所述的线粒体温度的荧光定量检测原理为：化合物(1)随着环境温度的升高，原本被限制旋转的碳碳单键结构发生旋转，使荧光减弱；而温度降低时，化合物(1)再次回到不易发生旋转的状态。同时三苯基膦的结构使探针具有优秀的线粒体靶向。测定在激发为460时，检测630nm处探针的荧光强度变化，从而获得温度与荧光强度的关系。
本发明效果的优势主要体现在：化合物(1)可做为线粒体温度检测的工具，能够为温度和荧光强度提供一个可靠的线性关系；其荧光性能激发为ex＝460nm，em＝630nm，大的斯托克位移可以避免检测过程中背景光的干扰；在靶向线粒体的同时，拥有着超出以往线粒体温度探针的温度敏感性；基于此化合物(1)能够在线粒体细胞生命活动的研究中起到非常重要的作用。
(一)附图说明
图1分别为本发明中实施例3制备的化合物(1)的核磁氢谱。
图2分别为本发明中实施例3制备的化合物(1)的核磁碳谱。
图3为本发明中实施例3制备的化合物(1)，加入PBS缓冲液中的荧光吸收光谱图。
图4为本发明中实施例3制备的化合物(1)，加入PBS缓冲液中的荧光发射光谱图。
图5为本发明中实施例3制备的化合物(1)，在不同温度下(25℃-60℃)的PBS缓冲液(pH＝7.4)中荧光发射光谱图。激发波长460nm，发射波长630nm。
图6为本发明中实施例3制备的化合物(1)，在不同温度下(25℃-60℃)的PBS缓冲液(pH＝7.4)的线性关系图。激发波长460nm，发射波长630nm。
图7为本发明中实施例3制备的化合物(1)，在常温下的PBS缓冲液(pH＝7.4)的常见离子选择性荧光图。1-15分别为Cu2+、Ca2+、CO3 2-、Mn+、HSO3 -、NH4 +、Zn2+、Mg+、HCO3 -、ClO-、Fe3 +、Na+、K+、PO4 3-、Cl-。激发波长为460nm，发射波长为630nm。
图8为本发明中实施例3制备的化合物(1)，在常温下的不同pH的PBS缓冲液中的荧光图。激发波长为460nm，发射波长为630nm。
图9为本发明中实施例3制备的化合物(1)，在常温下的不同粘度的Gly(甘油)/水溶液(v/v＝0:1至9:1)中的荧光发射光谱图。激发波长460nm，发射波长630nm。
图10为本发明中实施例3制备的化合物(1)的线粒体共定位成像。
图11为本发明中实施例3制备的化合物(1)在Huh7细胞中的不同温度的成像。
图12为本发明中实施例1制备的化合物(4)的核磁氢谱。
图13为本发明中实施例13制备的对比例(a)的核磁氢谱。
图14为本发明中实施例14制备的对比例(b)的核磁氢谱。
图15为本发明中实施例13制备的对比例(a)，加入到PBS缓冲液中，温度25℃到60℃不同阶段的荧光发射光谱图(pH＝7.4)。
图16为本发明中实施例14制备的对比例(b)，加入到PBS缓冲液中，温度25℃到60℃不同阶段的荧光发射光谱图(pH＝7.4)。
(二)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：化合物(3)的制备
将4-二乙基氨基水杨醛(0.17g,1.0mmol)、碳酸铯(0.27g,2.0mmol)加入5mL无水乙腈中，65℃反应30min；之后向反应液加入化合物(2)(0.48g，1.0mmol)，82℃回流反应10h，TLC监测反应完全进行；将反应液过滤并收集固体，用二氯甲烷溶解并萃取，收集有机相，减压浓缩得到棕色油状化合物(3)粗品，直接应用于下一步反应。
实施例2：化合物(4)的制备
将对二乙氨基苯乙酮(0.19g，1.0mmol)和丙二腈(0.20g，3.0mmol)完全溶解在装有10mL甲苯的烧瓶中。向反应体系加入乙酸铵(0.354g，0.2mmol)和乙酸(0.07g，1.1mmol)，111℃回流18小时。将反应体系移至室温冷却，过滤收集固体。通过用石油醚/乙酸乙酯(5:1v/v)作为洗脱剂进行硅胶柱色谱纯化，将收集到含目标产物的洗脱液减压浓缩，得到化合物(4)纯品228mg，产物收率为95％，为浅黄色固体。核磁氢谱见图12。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.71(s,1H),7.69(s,1H),6.69(s,1H),6.67(s,1H),3.45(t,J＝7.1Hz,4H),2.58(s,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,6H).
实施例3：化合物(1)的制备
将化合物(3)(0.19g，0.37mmol)与化合物(4)(0.088g，0.37mmol)以及哌啶(6.3mg，0.074mmol)加入5mL乙醇中，80℃回流反应2h，TLC监测反应完全进行，反应液用二氯甲烷萃取，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析，二氯甲烷溶剂为洗脱剂，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩得到化合物(1)纯品46mg，产品收率18％，为红色固体。其核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.75(dd,J＝11.4,7.3Hz,5H),7.61(d,J＝15.2Hz,1H),7.47(dtd,J＝14.4,8.4,6.7,2.7Hz,9H),7.22(d,J＝8.5Hz,2H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),7.03(d,J＝15.1Hz,1H),6.67(d,J＝8.5Hz,2H),6.23(d,J＝2.3Hz,1H),6.04(d,J＝2.5Hz,1H),4.03(t,J＝5.8Hz,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,8H),2.42(td,J＝11.2,8.0Hz,2H),2.06(q,J＝7.2,6.3Hz,2H),1.89–1.83(m,2H),1.23–1.19(m,12H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ173.00,161.05,151.66,146.70,134.62,133.37,132.59,131.94,131.81,131.70,130.80,130.73,128.71,128.62,120.59,116.81,110.55,104.62,94.25,71.42,67.76,45.06,44.78,44.41,30.18,30.06,28.84,19.09,12.67,12.64,12.59.
实施例4：化合物(1)的荧光吸收光谱图(激发波长460nm，发射波长630nm。)
称取一定量的实施例3的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入398μLPBS缓冲液中，转移至96孔板中检测。得到化合物(1)的荧光吸收发射光谱。
荧光图谱见图3图4。
实施例5：化合物(1)(5μM)的荧光强度随温度变化光谱图(激发波长460nm，发射波长630nm，温度范围25℃-60℃)。
称取一定量的实施例3的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入398μLPBS缓冲液中，转移至96孔板中检测。通过升温，分别检测化合物(1)在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃时的荧光强度，并绘制线性关系图。
荧光图谱见图5、图6。由结果可知，温度20℃化合物(1)的荧光强度为温度60℃时化合物(1)的荧光强度的33倍，并且呈现较好的线性关系。因此化合物(1)有较好的温度敏感性。
实施例6：化合物(1)(5μM)在不同生物活性离子中的荧光强度检测。
称取一定量的实施例3的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入398μL的水溶液中(用氯化铜、氯化钙、碳酸钾、氯化锰、亚硫酸氢钠、氯化铵、氯化锌、氯化镁、碳酸氢钠、次氯酸钠、氯化铁、磷酸钠配制成含有生物相关活性小分子1～20，分别为，Cu2+、Ca2+、CO3 2-、Mn+、HSO3 -、NH4 +、Zn2+、Mg+、HCO3 -、ClO-、Fe3+、Na+、K+、PO4 3-、Cl-)，转移至96孔板中检测，分别以25℃与60℃下检测其荧光谱图。
荧光谱图见图7。由结果可知，生物活性离子没有对化合物(1)的荧光强度没有影响，化合物(1)的荧光强度只会受温度变化发生改变。
实施例7：化合物(1)(5μM)在不同生物pH溶液中的荧光强度检测。
称取一定量的实施例3的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入不同pH的398μL缓冲溶液中(pH3-13，缓冲液分别用0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸配置而成；pH11-13，缓冲液分别用0.05mol/L磷酸氢二钠、0.1mol/L氢氧化钠以及0.2mol/L氯化钾配制而成)，转移至96孔板，在25℃的环境下进行荧光光谱检测。
荧光光谱见图8。由结果得，不同pH对化合物(1)的荧光强度几乎没有影响。
实施例8：化合物(1)(5μM)在不同粘度环境下的荧光谱图。
称取一定量的实施例(3)的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入不同粘度的甘油/水缓冲液(甘油：水分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0)，移至96孔板，25℃环境下检测其荧光光谱。
荧光光谱见图9。由结果可知粘度对化合物(1)的荧光强度几乎没有影响。
实施例9：本发明中化合物(1)的线粒体共定位成像图。
称取一定量的实施例3的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入到1.998mLDMEM培养基中。取1mL含有化合物(I)的培养液加入到Hela细胞中,在37℃下培育0.5h，用DMEM培养基洗涤两次，然后加入Molecular公司的线粒体绿色荧光探针(C1048)，37℃孵化20min，PBS洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。
荧光谱图见图10。实验结果表明，化合物(1)可以靶向细胞内线粒体。
实施例10：化合物(1)(5μM)在细胞层面的温度检测。
称取一定量的实施例3的化合物(1)，溶于二甲基亚砜，使母液浓度为1mM，抽取2μL母液加入到1.998mLDMEM培养基中。取1mL含有化合物(1)的培养液加入到Huh7细胞中,37℃下染色15min，PBS洗涤两次；吸取相同浓度的化合物(1)2μL至DMEM中，通过加入加入2μL线粒体解偶联剂(将线粒体解偶联剂溶于二甲基亚砜，浓度为10mM)，用于提高细胞温度，，再次染色15min,PBS洗涤两次；用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。
荧光谱图见图11。实验结果表明，该化合物可用于细胞层面的温度检测。
实施例11：对比例(a)的制备。
Figure BDA0003588997370000091
将1-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-ium(188.29mg,1.0mmol)、4-二乙氨基苯甲醛(177.24mg,1.0mmol)和哌啶(85.15mg，0.2mmol)加入4ml乙醇中，80℃回流2h，TLC检测进程,反应液用二氯甲烷萃取，有机相减压浓缩，硅胶柱层析，用二氯甲烷与石油醚体积比1：1的混合溶剂为洗脱液，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩得到对比例(a)纯品46mg，产品收率28％，为深红色固体。核磁氢谱见图13。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(d,J＝15.3Hz,2H),7.48(dd,J＝7.9,1.3Hz,2H),7.43–7.36(m,2H),7.25(dd,J＝15.3,2.5Hz,1H),6.79(d,J＝8.9Hz,2H),4.68(q,J＝7.2Hz,2H),3.51(q,J＝7.1Hz,4H),1.78(s,6H),1.54(t,J＝7.3Hz,3H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H).
实施例12：对比例(b)的制备。
Figure BDA0003588997370000092
将1,2-dimethylquinolin-1-ium(158mg,1mmol)、4-二乙氨基苯甲醛(39.88mg,0.225mmol)和哌啶(85.15mg，0.2mmol)加入4ml乙醇中，80℃回流2h，TLC检测进程,反应液用二氯甲烷萃取，有机相减压浓缩，硅胶柱层析，用二氯甲烷与石油醚体积比1：1的混合溶剂为洗脱液，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩得到对比例(a)纯品107.7mg，产品收率34％，为红色固体。核磁氢谱见图14。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(td,J＝13.8,11.4,6.3Hz,1H),8.48–8.41(m,1H),8.33(dd,J＝10.6,6.4Hz,1H),8.17(dtd,J＝16.1,8.8,7.8,4.0Hz,2H),8.05–7.95(m,1H),7.76(ddt,J＝17.5,7.5,3.1Hz,3H),7.49–7.33(m,1H),6.66(dt,J＝28.8,7.9Hz,2H),4.41–4.32(m,3H),3.38(dt,J＝21.2,7.3Hz,4H),1.11(dt,J＝10.1,6.8Hz,6H).
实施例13：实施例11中对比例(a)分别在不同温度下测定的荧光谱图(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)。
称取一定量的实施例11的对比例(a)，以二甲基亚砜为溶剂将其配制成浓度为1mM的探针母液，抽取2μL母液加入398μLPBS缓冲液中，在96孔板中检测。通过持续升温，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃检测其荧光强度。荧光图谱见图15。
实施例14：实施例12中对比例(b)分别在不同温度下测定的荧光谱图(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)。
称取一定量的实施例12的对比例(b)，以二甲基亚砜为溶剂将其配制成浓度为1mM的探针母液，抽取2μL母液加入398μLPBS缓冲液中，在96孔板中检测。通过持续升温，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃检测其荧光强度。荧光图谱见图16。
化合物(a)ex＝550nm，em＝620nm，温度从20℃升至45℃荧光强度相差不到2倍；
化合物(b)ex＝520m，em＝630nm，温度从20℃升至45℃荧光强度相差约4倍；
虽然这两款化合物能够标记线粒体，但其对温度敏感性较差，难以应用于复杂的细胞检测环境中。

Claims (10)

1.一种式(1)所示化合物：
Figure FDA0003588997360000011
2.如权利要求1所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于所述方法包括：
(1)将4-二乙基氨基水杨醛、碳酸铯溶于无水乙腈中，在62-67℃下搅拌30-45min；加入化合物(2)，在81-83℃下回流反应10-12h，所得反应液A经后处理A后，得到化合物(3)；所述化合物(2)、4-二乙基氨基水杨醛与碳酸铯的物质的量之比为1:1～1.2:1.7～2；
Figure FDA0003588997360000012
(2)将丙二腈、对二乙氨基苯乙酮、乙酸、乙酸铵加入甲苯中，110-112℃回流反应15-20h，所得反应液B经后处理B后，得到化合物(4)；所述丙二腈、对二乙氨基苯乙酮、乙酸与乙酸铵的物质的量之比为13～15：4～5：5～5.5：1；
Figure FDA0003588997360000013
(3)将步骤(1)所述的化合物(3)、步骤(2)所述的化合物(4)以及哌啶加入乙醇中，78-80℃回流反应2-3h，所得反应液C经后处理C后，得到化合物(1)；所述化合物(3)、化合物(4)与哌啶的物质的量之比为1:1～1.2:0.2～0.4；
Figure FDA0003588997360000021
3.如权利要求2所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述无水乙腈的体积以化合物(2)的质量计为10-12mL/g。
4.如权利要求2所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述后处理A为：将所述反应液A过滤并收集固体，用二氯甲烷溶解并萃取并收集有机相；将有机相减压浓缩，得到化合物(3)。
5.如权利要求2所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述甲苯的体积以对二乙氨基苯乙酮的质量计为50-53mL/g。
6.如权利要求2所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述后处理B为：将所述反应液B冷却至室温后，抽滤，所得滤饼用体积比为5:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行硅胶柱色谱纯化，减压浓缩，得到化合物(4)。
7.如权利要求2所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述乙醇的体积以化合物(4)的质量计为55-57mL/g。
8.如权利要求2所述的式(1)所示化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述后处理C为：所述反应液C经二氯甲烷萃取，取有机相进行减压浓缩，以二氯甲烷为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩，得到式(1)所示化合物。
9.如权利要求1所述的式(1)所示化合物在温度检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用为式(1)所示化合物在检测线粒体温度中的应用。
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