CN103333676B

CN103333676B - 一种硒离子荧光探针及其制备方法和用途

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Publication number: CN103333676B
Application number: CN201310242234.2A
Authority: CN
Inventors: 冯国栋; 代艳娜
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: CN103333676A

Abstract

本发明的一种硒离子荧光探针及其制备方法和应用，属于环境分析，生物分析检测的技术领域。硒离子荧光探针是罗丹明6G的底环修饰衍生物，分子式为C₃₀H₃₇N₅O₂。制备方法是采用将罗丹明6G酯基胺解重新成环的方法，合成具有特异性响应的硒离子荧光探针分子。硒离子荧光探针的用途是用于水环境体系、药物或生物细胞体系中硒含量传感检测。本发明的硒离子荧光探针的合成仅需一步反应，后处理简单、原料易得、成本低廉；硒离子荧光探针具有选择性好，抗金属离子干扰能力强等特点，是一种简单、快速、灵敏的硒离子特异性检测试剂，具有生色传感功能的荧光探针，在生物及离子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种硒离子荧光探针及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及环境分析，生物分析检测的技术领域，尤其涉及一种高选择性的，能够对样品中硒含量进行定量检测的荧光探针及其合成方法。

背景技术

硒是在工业，环境，生物学，毒理学上有着非常重要意义的一种非金属元素。它也是哺乳类生物所需的一种必需营养元素。它的化合物在代谢反应中起着重要的催化作用，如参与蛋白质的合成，细菌、古生菌、哺乳类生物体内有五十多种蛋白质中都含有硒。此外，硒元素还有其它功能性的作用，如抗癌和抵抗其它重金属离子的毒副作用，然而，硒具有双重作用，只有在一定浓度范围内的硒对生物体包括人类是有益的，超过这个范围的过高含量的硒元素会引起一些疾病。因此，发展快速有效的方法来精确测定微量乃至痕量硒在药学、医学和环境科学领域都有着非常重要的意义。在过去几年中，它们对环境和人类健康的作用，已经引起了科学家致力于有机硒在化学形态上的生物效应及其毒理学方面的研究兴趣，但是在自然水体和土壤中，无机形式的硒比有机形式的硒毒性大。因此，发展快速有效的方法来检测无机形式的硒是很有意义的。

目前检测无机形式的硒的方法有很多，包括氢化物发生或者石墨炉原子吸收光谱(HG-AAS或GF-AAS)，氢化物发生-原子荧光光谱（HG-AFS），电感耦合等离子体-原子发射光谱(ICP-AES)。此外还有其它方法，如不同分离机制的高效液相色谱(HPLC)，毛细管电泳（CE），电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)，这些方法有灵敏度高，检出限低，可多种元素同时测定等优点，但同时也有缺点，如需要对待测样品进行气化或雾化，分析操作繁杂，易受干扰，成本高，条件要求苛刻等。近年来，氢化物发生-原子发射光谱法，电感耦合等离子体-原子发射光谱法和电感耦合等离子体-质谱越来越多被用来测定生物材料和环境样品中硒含量。但是氢化物发生法有着明显的缺点，如过渡金属离子的干扰和THB的不稳定性，此外其检测效率很大程度上受到目标元素的化学形态和氧化态的影响。而ICP-AES有很好的灵敏度，但是其价格昂贵，还有其他元素和等离子气的背景辐射干扰，相比较而言ICP-MS有更好的灵敏度，但是其分析设备的价格昂贵，易受到硒的同位素和氩气干扰（相对分子质量均为80）。

近些年来，特定目标的阴离子或阳离子选择性化学传感器的需求不断增加，选择性荧光探针的发展也得到越来越多的关注，文献中已报道了多种金属离子的荧光探针，如Cu²⁺，Hg²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Cd²⁺等。和其他方法相比，分子荧光更便宜，更简便，更直接。据了解，至今为止用来检测硒离子的荧光探针极少，这些少数的相关报道中多数以2,3-二氨基萘（DAN）为配体与硒络合，然而Se-DAN络合物形成于水中，为了除去干扰和提高检测灵敏度必须用有机溶剂萃取出来。萃取的过程可能会造成分析物的损失和污染，且Se-DAN络合需要PH的优化和很长的显色时间。基于此，本发明研究出一种新的有机配体罗丹明6G的底环修饰衍生物(ABDO)用来测定硒的含量。该配体显示出很好的选择性和灵敏度，并且在溶液中有“turn-on”荧光变化，ABDO用于多种维生素中硒含量的测定，结果令人满意。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种硒离子荧光探针及其制备方法和应用，该硒离子荧光探针采用将罗丹明6G底环酯基胺解重新成环的方法，合成具有特异性响应的硒离子荧光探针分子，用于硒离子的选择性荧光快速检测。

本发明所述的一种硒离子荧光探针ABDO，是罗丹明6G的底环修饰衍生物，分子式为C₃₀H₃₇N₅O₂。

硒离子荧光探针ABDO的结构式为：

所述的硒离子荧光探针的制备方法，按下列步骤进行：

a.将罗丹明6G溶于无水乙醇，再加入二亚乙基三胺，加热回流至溶液的绿色荧光消失，二亚乙基三胺与罗丹明6G的摩尔比为7∶1；

b.蒸去部分乙醇后，边超声边加入纯净水，有浅粉色固体生成，至固体析出量不再增加时，停止加纯净水；然后进行抽滤，用水洗涤2～3次；

c.将抽滤得到的浅粉色固体溶于乙腈，用无水硫酸钠除水，加热过滤，得到滤液进行旋蒸得到浅粉色晶体，即为硒离子荧光探针分子ABDO。

所述的将罗丹明6G溶于无水乙醇，可以溶于热（40～70℃）的无水乙醇中，使罗丹明6G与乙醇的质量体积比为0.09～0.10g/mL。

本发明所述的一种硒离子荧光探针的合成路线如下：

本发明的硒离子荧光探针的用途，该荧光探针用于水环境体系，药物或生物细胞体系中硒含量传感检测；所述的传感检测，是荧光强度检测，或目视比色法检测，或目视定性检测。

荧光强度检测的具体过程是，①将硒离子荧光探针ABDO溶于无水乙醇中，配成浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针标准溶液；应用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.1mol/L，pH＝7.5）的缓冲溶液配制不同浓度的Se(Ⅳ)，即Se离子储备液；取30μL硒离子荧光探针标准溶液分别与3mL的不同浓度的Se(Ⅳ)储备液混合，室温下静置30min，分别测混合液在波长550nm处的荧光发射强度；以Se(Ⅳ)的浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制标准曲线(如图6)，或再拟合得到标准直线方程；②将浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针的无水乙醇溶液30μL加入到3mL的待测样品溶液中，室温下静置30min，测定被检测溶液在波长550nm处的荧光发射强度，再与标准曲线对比或带入标准直线方程计算，得到被检测溶液中的硒浓度。

目视比色法检测的具体过程是，①将硒离子荧光探针ABDO溶于无水乙醇中，配成浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针标准溶液；应用HEPES（0.1mol/L，pH＝7.5）的缓冲溶液配制不同浓度的Se(Ⅳ)储备液；取30μL硒离子荧光探针标准溶液分别与3mL的不同浓度的Se(Ⅳ)储备液混合，室温下静置30min，紫外灯照射下得到一系列不同浓度标准亮度的Se(Ⅳ)荧光；②将浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针的无水乙醇溶液30μL加入到3mL的待测样品溶液中，室温下静置30min，紫外灯照射得到被检测溶液荧光亮度，再与一系列标准荧光亮度比较，得到被检测溶液中的硒浓度。

也可以用目视定性检测，将浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针的无水乙醇溶液取30　L加入到3mL的被测样品或被测样品溶液中，含有硒离子的被测样品能从无色变成粉红色；或者是伴随着紫外灯下肉眼可视含硒被检测样品会发出绿色荧光。

本发明的优点：（1）荧光探针的合成仅需一步反应，且后处理简单；（2）原料易得，成本低廉；（3）本发明实现了硒离子的选择性荧光快速检测，并且选择性好，抗其他金属离子干扰能力强。该探针具有良好的检测灵敏度，对硒离子发生特异性响应后，能够同时产生两种光学性质（即颜色，荧光）的变化，这拓展了其潜在的适用范围。此外，还伴随着紫外灯下肉眼可视的荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中硒离子存在的专一性指示剂，可进行现场实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的硒离子特异性检测试剂，在生物及离子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。

附图说明

图1是实施例1所制备的罗丹明6G的底环修饰衍生物(ABDO)的质谱图。

图2是实施例1所制备的罗丹明6G的底环修饰衍生物(ABDO)核磁氢谱。

图3是实施例1制备的Se荧光探针的荧光光谱。

图4荧光探针与硒混合前后，荧光探针最大发射波长处荧光强度随时间变化情况。

图5其他金属离子对荧光探针检测硒的干扰情况。

图6硒荧光探针对硒离子浓度分别为1.0×10^-8mol/L，3.0×10^-8mol/L，5.0×10^-8mol/L，8.0×10^-8mol/L，1.0×10^-7mol/L荧光响应的线性关系曲线，R＝0.999。

图7荧光探针溶液中分别加入等摩尔量的硒和竞争金属离子的标准溶液，只有硒离子可以使荧光探针的乙醇溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成粉红色。

图8是实施例6中测试溶液伴随着紫外灯下肉眼可视的硒诱导荧光探针发出明亮的绿色荧光。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步说明。

实施例1硒离子荧光探针的制备。

称取1.916g（4.0mmol）罗丹明6G溶于20mL热的乙醇溶液，加入3mL（28mmol）二亚乙基三胺，加热回流至溶液的绿色荧光消失。蒸去部分乙醇后，边超声边加入纯净水，有浅粉色固体生成，至固体析出量不再增加时，停止加纯净水。然后进行抽滤，用水洗涤2～3次。将抽滤得到的浅粉色固体溶于乙腈，用无水硫酸钠除水后，加热过滤，滤液进行旋蒸得到浅粉色固体，即为罗丹明6G的底环修饰衍生物，产率约为76%。

产物罗丹明6G的底环修饰衍生物的表征，质谱图见图1，核磁图见图2。图1中，质荷比为500.3处的正谱质谱峰（M+1:(m/z)500.3）表明所合成的化合物的分子量为499。罗丹明6G的底环修饰衍生物(ABDO)的分子量正是499，两者吻合。产物的核磁表征数据为：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm):7.90(m,1H),7.45(t,J=3.75Hz,2H,),7.02(m,1H),6.34(s,2H),6.23(s,2H),3.50(d,J=4.2Hz,2H,),3.21(m,6H),2.58(t,J=6Hz,2H),2.41(t,J=6.6Hz,4H),1.90(s,6H),1.43(s,3H),1.32(t,J=7.05Hz,6H)。核磁图及核磁数据与罗丹明6G的底环修饰衍生物(ABDO)的理论数据吻合。结合质谱及核磁表征数据，可以断定所合成的化合物为罗丹明6G的底环修饰衍生物(ABDO)。

实施例2硒离子荧光探针荧光性质的测量

取实施例1制备的Se荧光探针溶于无水乙醇中，制成10mmol/L储备液。从储备液中取出30　L加入到5mL的离心管当中，加入30　L硒标准溶液（100μmol/L）用HEPES缓冲溶液（0.1mol/L，pH=7.5）稀释至3mL，测量其荧光性质。荧光光谱如图3所示。由图3可见，硒荧光探针的荧光最大激发波长为530nm，最大发射波长为550nm。

实施例3硒离子荧光探针与硒混合前后，荧光探针最大发射波长处荧光强度随时间变化情况。

a.从实施例2中荧光探针储备液中取出30　L加入到5mL的离心管当中，加入HEPES缓冲溶液（0.1mol/L，pH=7.5）稀释至3mL，检测最大荧光发射波长处荧光探针荧光强度随时间变化情况。

b.从实施例2中荧光探针储备液中取出30　L加入到5mL的离心管当中，加入30　L硒标准溶液（100μmol/L）用HEPES缓冲溶液（0.1mol/L，pH=7.5）稀释至3mL，检测最大荧光发射波长处荧光探针荧光强度随时间变化情况。

如图4所示，荧光探针与硒混合30min内荧光强度增加迅速，30min后荧光强度保持稳定，不再增加，因此最佳检测时间为30min。

实施例4金属离子对硒离子荧光检测的影响。

从实施例2中荧光探针储备液中取出30　L加入到5mL的离心管当中分成两组，一组分别加入等摩尔量的竞争金属（图5）离子标准溶液，另一组在此基础上再加等摩尔量的硒离子标准溶液，30min后检测溶液的荧光发射光谱变化，可以发现，其他金属离子对硒离子的荧光检测几乎没有影响。

实施例5硒荧光探针对不同浓度硒离子的荧光响应。

从实施例2中荧光探针储备液中取出30　L加入到5mL的离心管当中分别加入硒离子浓度分别为1.0×10^-8mol/L，3.0×10^-8mol/L，5.0×10^-8mol/L，8.0×10^-8mol/L，1.0×10^-7mol/L，发射波长550nm处的荧光强度具有很好线性，如图6所示。

实施例6

从实施例2中荧光探针储备液中取出30　L加入到5mL的样品管当中分别加入等摩尔量的硒和竞争金属（图7）离子的标准溶液，只有硒离子可以使荧光探针的HEPES缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成粉红色。

伴随着紫外灯下肉眼可视的硒诱导荧光探针发出明亮的绿色荧光（图8），说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

Claims

1.一种硒离子荧光探针的用途，所述的硒离子荧光探针，是罗丹明6G的底环修饰衍生物，分子式为C₃₀H₃₇N₅O₂，结构式是

其特征是，用于水环境体系、药物或生物细胞体系中硒含量传感检测；所述的传感检测，是荧光强度检测，或目视比色法检测，或目视定性检测。

2.根据权利要求1所述的硒离子荧光探针的用途，其特征是，所述的荧光强度检测，具体过程是：①将硒离子荧光探针溶于无水乙醇中，配成浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针标准溶液；应用4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲溶液配制不同浓度的Se离子储备液；取30μL硒离子荧光探针标准溶液分别与3mL的不同浓度的Se离子储备液混合，室温下静置30min，分别测混合液在波长550nm处的荧光发射强度；以Se离子的浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，或再拟合得到标准直线方程；②将浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针的无水乙醇溶液30μL加入到3mL的待测样品溶液中，室温下静置30min，测定被检测溶液在波长550nm处的荧光发射强度，再与标准曲线对比或带入标准直线方程计算，得到被检测溶液中的硒浓度。

3.根据权利要求1所述的硒离子荧光探针的用途，其特征是，所述的目视比色法检测，具体过程是：①将硒离子荧光探针溶于无水乙醇中，配成浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针标准溶液；应用4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲溶液配制不同浓度的Se离子储备液；取30μL硒离子荧光探针标准溶液分别与3mL的不同浓度的Se离子储备液混合，室温下静置30min，紫外灯照射下得到一系列不同浓度标准亮度的Se离子荧光；②将浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针的无水乙醇溶液30μL加入到3mL的待测样品溶液中，室温下静置30min，紫外灯照射得到被检测溶液荧光亮度，再与一系列标准荧光亮度比较，得到被检测溶液中的硒浓度。

4.根据权利要求1所述的硒离子荧光探针的用途，其特征是，所述的目视定性检测，具体过程是：将浓度为10mmol/L的硒离子荧光探针的无水乙醇溶液取30μL加入到3mL的被测样品或被测样品溶液中，含有硒离子的被测样品能从无色变成粉红色；或者是伴随着紫外灯下肉眼可视含硒被检测样品会发出绿色荧光。