CN114934092B - 一种生物转化制备薯蓣皂素的方法 - Google Patents

一种生物转化制备薯蓣皂素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物转化制备薯蓣皂素的方法，涉及生物转化技术领域。本发明通过单因素和Box‑Behnken试验设计对副干酪乳杆菌B56和乳酸乳球菌K172菌体直接转化和边培养边转化穿山龙皂苷制备薯蓣皂素的工艺进行了优化。通过高效液相色谱UV和ELSD对皂素进行定性检测，自制薯蓣皂素和标准品、工业皂素的出峰时间一致，峰形完整，确定为薯蓣皂素。本发明以穿山龙皂苷为原料，通过乳酸菌生物转化制备薯蓣皂素解决了传统酸水解带来的污染问题，优化确定了菌体转化和生长转化两种生产工艺，最高转化率可达76.73％，为穿山龙资源的高值化利用提供了新思路，也为乳酸菌制备皂素提供理论依据和技术支撑。

Description

一种生物转化制备薯蓣皂素的方法
技术领域
本发明涉及生物转化技术领域，特别是涉及一种生物转化制备薯蓣皂素的方法。
背景技术
薯蓣皂素为众多甾体激素类药物中重要的合成原料，因其昂贵的价格和不可取代性，有着“医药黄金”的美誉，在医药等领域发挥其价值。除直接应用于药物生产外，薯蓣皂素在临床方面的应用也有相关研究。除此之外，薯蓣皂素在医美、保健等方面也有不错的前景。现有技术中薯蓣皂素的检测是评判粗提物质量、产品纯度、工艺水平和提取效率等指标的重要手段。目前，薯蓣皂素检测方式多样，其基本可以分为物理法、化学法、高效液相法和其他方法几方面。根据现有的研究进展，薯蓣皂素的制备工艺大致可以分为三类，即酸水解法、生物转化法和其它方法，其中生物转化法包括酶转化法、微生物转化法、酶菌共转化法等。
薯蓣皂素是甾体激素类药物不可缺少的原料，目前，薯蓣皂素的生产主要以黄姜为原料，而其他富含薯蓣皂苷的原料作物如穿山龙没有被应用于皂素生产，而仅仅用于分离生产薯蓣皂苷粗产物。如以穿山龙为原料生产薯蓣皂素，既能提高其产品附加值，又能填补日益提高的薯蓣皂素需求，因此利用穿山龙皂苷转化制备薯蓣皂素是很有必要的。此外，目前相对于微生物转化法生产薯蓣皂素的研究主要以曲霉、木霉等霉菌为主，研究细菌的相对较少。
穿龙薯蓣广泛生长于东北、华北等地区，也可通过耕种生长收获，是薯蓣皂素生产理想的补充和替换方式。目前穿山龙主要用于制备薯蓣皂苷粗品，其产值低、消耗量大、会极大消耗野生自然资源。而随着穿山龙人工培养技术的日趋成熟，其必定会存在市场饱和情况，因此通过深加工进一步制备成薯蓣皂素很有必要，既能提高产品附加值，同时也为生物转化制备薯蓣皂素提供新工艺与新思路，又能扩大市场，还能进一步补充国内外皂素需求市场。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物转化制备薯蓣皂素的方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
技术方案一：一种利用乳酸菌转化制备薯蓣皂素的方法，包括(1)或(2)所示的任一种方法：
(1)直接转化法，其包括如下步骤：
A1：将活化后的乳酸菌接种到MRS培养基，分离收集菌泥，并将所述菌泥加入皂苷溶液中转化制备皂素；
A2：向步骤A1所得发酵液中加入四氯化碳萃取，再经分离纯化，得到所述薯蓣皂素；
(2)边培养边转化法，其包括如下步骤：
B1：将乳酸菌接种至皂苷-MRS培养基中边培养边转化制备皂素；
B2：向步骤B1所得发酵液中加入四氯化碳萃取，再经分离纯化，得到所述薯蓣皂素。
进一步地，所述乳酸菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)B56，其保藏号为CICC 20355。
进一步地，所述菌泥按照质量分数2％加入所述皂苷溶液中。
进一步地，采用直接转化法，用所述副干酪乳杆菌B56转化时，转化条件为：将 MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72h；所述皂苷溶液中皂苷浓度为 W/V＝0.7-1.3％；所述乳酸菌接种至MRS培养基中的菌体的浓度，按照质量浓度计为 3-5％。
进一步地，采用边培养边转化法，用所述副干酪乳杆菌B56转化时，转化条件为：按照质量浓度计，将2％-3％的副干酪乳杆菌B56接种至皂苷-MRS培养基中培养24h；将皂苷-MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72h；所述皂苷-MRS培养基中皂苷的浓度，按照体积分数计为0.8-1.0％。
进一步地，所述乳酸菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)K172，其保藏号为CICC 20410。
进一步地，采用直接转化法，用所述乳酸乳球菌K172转化时，转化条件为：将 MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72h；所述皂苷溶液中皂苷浓度为 W/V＝0.7-1.3％；所述乳酸菌接种至MRS培养基中的菌体的浓度，按照质量浓度计为 3％-5％。
进一步地，采用边培养边转化法，用所述乳酸乳球菌K172转化时，转化条件为：按照质量浓度计，将2％-3％的副干酪乳杆菌K172接种至皂苷-MRS培养基中培养24h；将皂苷-MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72h；所述皂苷-MRS培养基中皂苷的浓度，按照体积分数计为0.8-1.0％。
进一步地，所述MRS-皂苷培养基的配包括：向pH＝7.0的磷酸缓冲液中加入按照质量浓度计为0.9％的皂苷，溶解后进行抽滤，再向滤液中加入MRS培养基。
进一步地，所述皂苷的添加方式为分批次添加，所述分批次为第一天加入0.2％，第三天和第四天分别加入0.35％。
本发明公开了以下技术效果：
本发明对2株转化皂苷生成薯蓣皂素效率高的菌株，采用单因素、析因试验及响应面法分析了乳酸菌菌体直接转化、边培养边转化以及补料等对转化穿山龙皂苷制备薯蓣皂素的影响，并获得了最佳转化工艺的参数，并对不同工艺制备的薯蓣皂素的熔点、晶体形貌等进行了分析，最后对皂苷转化效率高的两株乳酸菌进行代谢组学分析。通过乳酸菌转化穿山龙皂苷制备薯蓣皂素，可为薯蓣皂素的制备提供新原料、新菌株和新工艺，解决酸水解生产薯蓣皂素带来的污染问题，为薯蓣皂素的生产提供理论支持和技术参考，本发明研究的乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56菌体直接转化和边培养边转化制备薯蓣皂素工艺，皂苷最高转化率可达76.73％，为生物转化制备薯蓣皂素和解决皂素工业污染提供了新工艺和新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为甲醇-硫酸法测定薯蓣皂苷标准曲线；
图2为高氯酸法测定薯蓣皂素标准曲线；
图3为不同反应条件对皂苷转化率的影响，其中，图3中的a为pH、b为反应时间、c为皂苷添加量、d为菌体浓度、e为温度；
图4为pH调节方法对两菌株转化制备薯蓣皂素的影响，其中，图4中的a为转化率，b为葡萄糖剩余量；
图5为菌体转化与培养转化制备薯蓣皂素的比较，其中，图5中a为转化率，b为菌体干重，c为葡萄糖残留量；
图6为边培养边转化各条件与皂苷转化率的关系，其中，图6中a为pH，b为pH 与葡萄糖浓度的关系，c为转化温度与皂苷转化率的关系，d为温度与葡萄糖浓度的关系，e为皂苷添加量与皂苷转化率的关系，f为皂苷添加量与葡萄糖浓度的关系，g为菌体浓度与皂苷转化率的关系，h为菌体浓度与葡萄糖浓度的关系；
图7为补料对两菌株培养转化制备皂苷转化率和积累量的影响，其中图7中的a 为皂苷转化率，b为积累量；
图8为皂苷添加方式和双菌混合培养对转化率和皂素浓度的影响，其中图8中的a为转化率，b为皂素浓度；
图9为优势菌株在MRS肉汤和皂苷-MRS培养基中的电镜图(左：MRS，右：皂苷-MRS)；
图10为皂素样品的熔点对比；
图11为不同菌转化薯蓣皂素的显微晶体形态，其中，图11中的a为标准品，b为工业，c为K172边培养边转化，d为B56边培养边转化，e为K172菌体，f为B56菌体。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
穿山龙薯蓣皂苷粉购自西安冰禾生物科技有限公司，薯蓣皂素样品由金川皂素厂提供，薯蓣皂苷(批号：AF8070683)和薯蓣皂素(批号：AF8031202)标准品均购自成都埃法生物科技有限公司。本发明试验所用试剂和仪器若无特殊说明，则均为实验室常规试剂或仪器。副干酪乳杆菌B56购买自中国工业微生物菌种收藏中心CICC 20355，所述乳酸乳球菌K172购买自中国工业微生物菌种收藏中心CICC 20410。MRS 肉汤培养基购买自山东拓扑。
实施例1
1材料与方法
1.1原料、标准品与菌株
1.1.1MRS-皂苷培养基的配制方法及其制备
MRS培养基主要成分见表1，特殊培养基为增加或减少其中的成分，如无糖MRS 培养基为去除培养基中的葡萄糖，并溶解于1L去离子水中。
表1
MRS-皂苷培养基的配制：配制pH＝7.0磷酸缓冲液，在800mL水中加入11.857gKH2PO4·3H2O和44.409g K2HPO4·12H2O，完全溶解后定容至1L。向磷酸缓冲液中加入一定质量的皂苷，溶解后进行抽滤，再向滤液中加入52.2g MRS培养基，装入厌氧瓶高压蒸汽灭菌，备用。
1.1.2萃取溶剂选取
将2g薯蓣皂素粗品分别溶解于50mL的石油醚(60～90℃)、乙醇、四氯化碳、正辛醇、环己烷及正辛烷溶剂中，并测定溶解时间，发现四氯化碳溶解速度最快，3min 时完全溶解，乙醇其次，28min时完全溶解，石油醚、正辛醇分别在96min和172min 时溶解完全，环己烷和正辛烷难以完全溶解。四氯化碳分子量为153.84，不易燃易爆，不溶于水，沸点76.8℃，是理想的萃取剂。综上，本发明选用四氯化碳作萃取剂，反应相水相为上相，提取相四氯化碳为下相，进行反应提取。
1.1.3乳酸菌活化及菌体制备
乳酸菌的活化：使用无菌注射器吸取0.5mL MRS肉汤，加入装有0.2g菌粉的冻干管中，完全溶解。吸取菌悬液并加入装有15mL MRS肉汤的厌氧管中，在37℃培养箱中培养18h。镜检观察无杂菌后，2％接种量MRS肉汤活化2次，37℃培养箱培养 18h，活化后放入冰箱保存备用。
菌体制备：将活化菌体按2％接种量接入MRS肉汤培养基中，37℃培养24h，于7000rpm、4℃情况下高速冷冻离心离心10min，收集菌体备用。
1.1.4乳酸菌菌体直接转化穿山龙皂苷制备薯蓣皂素工艺优化
首先研究单因素在条件范围菌体添加量(1～5％，V/V)、皂苷浓度(1～5％，W/V)、转化时间(12～60h)、转化温度(30～42℃)、pH(4～8)时对乳酸乳球菌K172(Lactococcuslactis)和副干酪乳杆菌B56(Lactobacillus paracasei)菌体直接转化穿山龙皂苷制备薯蓣皂素工艺的影响，基础转化条件为：皂苷溶液浓度2％，调节pH至5.0，菌泥添加量 2％，在37℃，120rpm情况下转化24h，测定皂素含量，计算转化率并获得各因素适宜条件，在此基础上采用Box-Behnken试验设计(BBD)进一步优化确定最佳转化条件，并进行验证，并研究pH为7.0的磷酸缓冲液、NaOH调节溶液pH至7.0和不调节的转化体系对两菌株转化制备薯蓣皂素的影响。
1.1.5菌体直接转化与边培养边转化制备薯蓣皂素的比较
菌体直接转化法：以50mL MRS培养基培养菌体，将菌泥投入20g/L、50mL皂苷溶液中，加入20mL萃取剂，每12h测定高氯酸转化后的吸光度、菌体湿重和葡萄糖浓度，连续测定4天(96h)，并计算转化率。
边培养边转化法：配制皂苷-MRS培养基，将2％菌液接种至培养基中，在摇床中120rpm生长24h后，再加入20mL萃取剂。从第36h开始，每12h测定高氯酸转化后的吸光度、菌体湿重和葡萄糖浓度，连续测定至第4天(96h)，并计算转化率。
1.1.6乳酸菌边培养边转化制备薯蓣皂素的工艺优化
1.1.6.1发酵条件对乳酸菌边培养边转化制备薯蓣皂素的影响
根据生长转化结果，首先研究单因素在条件范围菌体接种量(1～5％，V/V)、皂苷浓度(1～5％，W/V)、培养温度(30～42℃)、pH(4～8)时对乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56菌体边培养边转化的影响，基础条件为：使用皂苷-MRS培养基，菌体接种量2％，皂苷浓度2％，36℃情况下120rpm摇床培养24h，之后加入20mL四氯化碳作萃取剂，连续萃取48h，超声催化30min，取2mL萃取剂用高氯酸法测定吸光度。
1.1.6.2利用析因实验优化培养转化法制备薯蓣皂素
使用JMP软件进行2×3析因设计，接种量为两水平(2％，3％)，皂苷浓度为三水平(0.8％，0.9％，1％)。利用皂苷-MRS培养基培养24h，再加入萃取剂反应48h，高氯酸法测定吸光度、测定葡萄糖含量，对结果进行分析和优化，并对优化结果进行验证。
1.1.6.3薯蓣皂素样品制备
根据乳酸乳球菌K172(Lactococcus lactis)和副干酪乳杆菌B56(Lactobacillusparacasei)菌体直接转化最佳工艺参数和边培养边转化的最佳工艺参数获得转化液和培养液各1升，添加200mL四氯化碳萃取，并分离出四氯化碳层，离心除去菌体菌体，使用旋转蒸发仪浓缩至20mL，并在通风橱中水浴挥干并结晶，获得4种皂素样品。
1.1.7分析与检测方法
1.1.7.1菌体形态观察
光学显微镜法：利用甲苯胺蓝法对乳酸菌进行菌体形态检测。使用注射器吸取少量菌液，滴1-2滴于载玻片上，使用酒精等烘干固定，使用0.2％的甲苯胺蓝染色2min，无菌水冲洗5s，盖上玻片并进行镜检。扫描电子显微镜法：通过SEM对乳酸菌菌体表面及细胞结构进行检测。MRS-肉汤培养菌体，7000rpm离心获得菌泥，参考杨欣的方法，使用戊二醛胶联法制样，并使用扫描电子显微镜观察菌体形态。
1.1.7.2薯蓣皂苷、薯蓣皂素及其标准曲线的测定
薯蓣皂苷的测定：利用硫酸-甲醇法测定薯蓣皂苷，首先建立标准曲线，如图1所示，测穿山龙薯蓣皂苷商品时，取10mg薯蓣皂苷，甲醇定容至200mL，吸取1mL 溶液于试管中，挥干溶剂，加入硫酸-甲醇(7:3)溶液5.0mL，60℃水浴加热1h，取出后冰水浴冷却至室温，摇匀，在329nm测定吸光度。薯蓣皂素的测定：利用香草醛 -高氯酸法(沈晖等.紫外分光光度法测定薯蓣皂甙元含量的研究[J].食品研究与开发,2013,34(07):107-110)测定薯蓣皂素含量，吸取1mL待测液体于试管中，挥干溶剂，并加入含香草醛5％(W/V)的冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，80℃情况下反应 2h，反应结束后冷却至室温，在553nm情况下测定其吸光度。
薯蓣皂素标准曲线的测定：配制浓度为100mg/L标准薯蓣皂苷-甲醇溶液，准确称取10.0mg薯蓣皂苷，使用100mL容量瓶定容。取2mL分别稀释至5mg/L、10mg/L、 15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L，利用硫酸-甲醇法进行测定，绘制标准曲线。结果见图1。同时对薯蓣皂苷进行检测，其平均吸光度为0.197，浓度为18.215mg/L，得出有效皂苷含量为36.43％(W/V)。
薯蓣皂苷标准曲线的测定：配制浓度为500mg/L标准薯蓣皂素-四氯化碳溶液，准确称取25.0mg薯蓣皂素，定容于50mL四氯化碳中。取2mL分别稀释至50mg/L、 100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L，高氯酸法测定其吸光度值，并绘制标准曲线。结果如图2所示。
1.1.8菌体生长情况测定
菌体湿重测定：发酵液于50mL离心管，在7000rpm、4℃条件下离心15min，移去上层清液，分别称量离心后与空离心管质量，取差值即为菌体湿重。
菌体干重测定：将装有菌泥的离心管在65℃电热干燥烘箱中干燥2h，分别称量干燥后离心管质量与空管质量，取差值即为菌体干重。
pH测定：利用干净的pH计进行测定，使用前使用无菌水冲洗3次，再使用吸水纸完全干燥，再进行测量。
1.1.9薯蓣皂素熔点测定
熔点测定：利用内径0.5mm毛细管装样10mg左右，在熔点仪中进行测定，并得出皂素熔点，进行比对。
1.1.10HPLC定性分析薯蓣皂素
使用HPLC对产物薯蓣皂素进行定性分析，与其他样品进行对比。分别制备1mg/L薯蓣皂素-甲醇标准品溶液，1mg/L工业样品和1mg/L的K172、B56两种菌体以菌体转化和培养转化制得的薯蓣皂素-甲醇溶液，对样品进行对比。将样品利用50mL容量瓶定容，超声脱气处理，并通过0.22μm微孔滤膜过滤，取1mL加入进样瓶。高效液相色谱测定条件：使用C18反向柱，流动相甲醇：乙腈＝95：5(V/V)，进样量20μL，流动相流速1mL/min。分别使用UV和ELSD检测器对其进行检测。UV检测波长203 nm，ELSD检测进气量1.2L/min，漂移管温度80℃。
2乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56菌体转化制备薯蓣皂素工艺优化
2.1转化条件对两株菌菌体转化制备薯蓣皂素的影响
转化条件pH(4～8)、时间(12～60h)、温度(30～42℃)、菌体加量(1～5％，V/V) 和皂苷浓度(1～5％，W/V)对乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56菌体转化穿山龙皂苷制备薯蓣皂素的结果如图3所示。
pH与转化率的关系如图3a所示，根据两株菌与转化率的关系发现其转化最适pH在6-8范围内，其中当pH＝7时转化率最高，K172和B56转化率分别为19.21％和18.26％。当pH<5时，转化率显著降低，根据课题组之前相关探究发现，这是由于酸性环境对糖苷酶的抑制作用造成的，因此推测分解薯蓣皂苷糖苷酶最适转化范围在pH＝6-8之间。而由于乳酸菌本色的酸性，在反应过程中需要将整个体系保持在pH＝6以上，可以通过直接加碱或缓冲液实现。
反应时间与转化率的关系如图3b所示，随着转化时间的延长，两株菌转化率都呈现上升趋势，且K172的转化率上升趋势大于B56的上升趋势，60小时时，K172和 B56的转化率分别为28.01％和21.32％。这说明K172转化效率更高，菌体产生酶的活性更稳定，能有效通过延长反应时间的方式提高转化率。根据菌体生长曲线与转化率的关系推断，其转化并不依赖于菌体量的积累和菌体活性，而是副产物酶的积累。
皂苷添加量与皂苷转化率的关系如图3c所示。由于添加薯蓣皂苷时会产生转化率和皂素含量的变化，因此同时对转化率和皂素积累量进行测定。由图可知，随着皂苷浓度的提高，薯蓣皂素产物积累量随之提高，而转化率则逐渐降低，皂苷添加量10％时，K172和B56转化率分别为29.76％和20.90％，添加量为50％时则降低到8.48％和 8.81％，皂素含量分别为690.56mg/L和717.65mg/L。这说明在反应过程中，原料的增加会造成产物的积累，而转化率降低是由于酶的催化效率趋于饱和，通过延长转化时间等方法则可以解绝这一问题。另外，B56的转化率下降速度慢于K172是由于B56 菌体量更多，有利于产物积累造成的反馈抑制作为用，因此两种菌体在不同浓度时转化率各有优劣。
菌体浓度与皂苷转化率的关系如图3d所示。当两株菌菌体浓度达到4％时，转化率最高，K172和B56转化率分别达到23.57％和18.52％。当菌体浓度>4％时浓度呈下降趋势，高浓度的菌液会造成转化体系pH下降、副产物反馈抑制作用等，后续选用 4％添加量进行。
温度与皂苷转化率的关系如图3e所示。由图可得其最适转化温度在36℃左右，K172和B56最高转化率分别为17.00％和17.71％。由于乳酸菌通常生长在恒温动物的肠道中，大多数乳酸菌的最适生长温度在36-37℃，较低的温度会减缓菌体生长速率，温度过高则会影响胞内酶作用从而抑制菌体生长，且糖苷酶最适转化温度也在该区间范围内，因此其皂苷转化率最高。
根据单因素实验，其最佳转化条件为pH＝7、菌体浓度4％、温度36℃，其转化率会随皂苷的添加而降低，随时间的增长而提高。其结果表明，影响转化率的主要因素为时间和pH，两因素对转化率的提高起决定性作用，可以通过维持转化体系pH和改进原料、萃取剂添加方式的方式实现薯蓣皂素产率的提高。对菌体浓度、温度和皂苷添加量进行进一步探索，以确定其交互作用影响。
2.2响应面法优化乳酸乳球菌K172菌体转化制备薯蓣皂素工艺
为进一步提高皂苷转化率，对所得单因素结果各最佳条件进行响应面优化。根据单因素试验结果，固定pH＝7，反应时间3天，选取菌体加量、转化温度和皂苷浓度三个因素为变量，利用Box-Behnken设计法(BBD)对乳酸乳球菌K172菌体转化制备薯蓣皂素进行三因素三水平实验设计，试验设计水平因素表及结果如表2和3所示。
表2
表3
共15组实验对三因素交互作用进行研究，通过分析，构建系统回归方程，其结果见公式(1)、(2)、(3)。
Y1＝33.05+0.483A-7.77B+0.270C-0.484AB-0.853AC-0.471BC-14.42A2+1.50B2-0.7913C2 (1)
Y2＝538.26+6.70A+5.15B+3.25C-5.10AB-13.90AC-5.60BC-228.87A2-13.57B2-18.97C2 (2)
Y3＝0.84+0.169A+0.056B+0.025C+0.028AB+0.02AC+0.045BC-0.271A2-0.086B2-0.054C2 (3)
其中Y1为转化率、Y2为皂素浓度、Y3为葡萄糖含量，A为温度、B为皂苷含量、 C为菌体添加量。
对R1转化率、R2皂素浓度和R3葡萄糖模型进行方差分析，其结果如表4和5所示。
表4
注：*显著(p<0.05)；**非常显著(p<0.01)；***极显著(p<0.001)
表5
注：*显著(p<0.05)；**非常显著(p<0.01)；***极显著(p<0.001)
关于R1转化率模型，其模型项F＝53.26表明该模型显著，仅有0.02％的几率是由于噪音造成的，失拟项F＝12.49表示该模型失拟概率为7.50％(<10％)，说明该模型是有效的。在该模型中，B和A2是显著项，即转化率对皂苷含量呈线性关系，对温度呈平方关系。预测值Rpre 2＝0.8431与实际值Radj 2＝0.9713合理一至，差异小于0.2。模型信噪比为22.461>4表明信号充足，该模型可用于设计空间。关于R2皂素浓度模型，模型项F＝69.67表明该模型显著，仅有0.01％的几率是由于噪音造成的，失拟项F＝5.14表示该模型失拟概率为6.72％(<10％)，说明该模型是有效的。在该模型中，A2是显著项，即皂素浓度对温度呈平方关系。预测值Rpre 2＝0.8859与实际值Radj 2＝0.9778合理一至，差异小于0.2。模型信噪比为18.862>4表明信号充足，该模型可用于设计空间。对转化过程中葡萄糖浓度进行研究，并简单分析。得到的模型有效，模型显著(F＝12.31) 而失拟项不显著(F＝1.61),模型显著项为A和A2，葡萄糖浓度与温度呈平方关系，说明菌体对温度更敏感，当温度为36.6℃、皂苷含量1.136％、菌体添加量4.355％时，葡萄糖含量最高，为0.89mmol/L，在该点时，转化率相对较高且菌体对葡萄糖的利用率最低。利用响应面法对各因素之间的交互作用进行研究，得到响应面图，发现转化率随皂苷浓度提高而提高，接种量对其影响不大，而最适温度在36℃左右。利用响应面法对各因素之间的交互作用进行研究，根据响应面图，发现皂苷添加量存在最适区间范围使皂素浓度达到最大值，菌体添加量对其影响不大，最适温度则在36℃左右。
2.3响应面法优化副干酪乳杆菌B56菌体转化制备薯蓣皂素工艺
使用相同的方法，对B56进行优化。根据单因素试验结果，固定pH＝7，反应时间 3天，选取菌体加量、转化温度和皂苷浓度三个因素为变量，利用Box-Behnken设计法 (BBD)对副干酪乳杆菌B56菌体转化制备薯蓣皂素进行三因素三水平实验设计，试验设计水平因素表及结果如表6和表7所示。
表6
表7
共15组实验对三因素交互作用进行研究，通过分析，构建系统回归方程，其结果见公式(4)、(5)、(6)。
Y1＝41.73-1.02A-10.96B+1.72C+0.52AB-0.049AC+0.879BC-13.37A2+1.76B2-2.65C2 (4)
Y2＝679.63-15.40A-5.25B+30.15C-2.60AB-0.8AC+22.9BC-217.28A2-24.98B2-43.58C2 (5)
Y3＝7.13-0.166A+0.999B-0.2C-0.215AB+0.0025AC+1.36BC-5.31A2-1.22B2-1.35C2 (6)
其中Y1为转化率、Y2为皂素浓度、Y3为葡萄糖含量，A为温度、B为皂苷含量、 C为菌体添加量。
对R1转化率、R2皂素浓度和R3葡萄糖模型进行方差分析，其结果如表8和9所示。
表8
注：*显著(p<0.05)；**非常显著(p<0.01)；***极显著(p<0.001)
表9
注：*显著(p<0.05)；**非常显著(p<0.01)；***极显著(p<0.001)
关于R1转化率模型，模型项F＝68.57表明该模型显著，仅有0.01％的几率是由于噪音造成的，失拟项F＝6.51表示该模型失拟概率为3.61％(<10％)，说明该模型是有效的。在该模型中，B、C、A2和C2是显著项，即转化率对皂苷含量呈线性关系，对温度呈平方关系，对菌体浓度的一、二次方项都有关系，但显著程度较低。预测值 Rpre 2＝0.8817与实际值Radj 2＝0.9775合理一直，差异小于0.2。模型信噪比为25.094>4 表明信号充足，该模型可用于设计空间。关于R2皂素浓度模型，对皂素浓度模型进行方差分析，其结果如表8所示。模型项F＝12.93表明该模型显著，有0.58％的几率是由于噪音造成的，失拟项F＝15.27表示该模型失拟概率为6.21％(<10％)，该模型是有效的，但拟合效果较差。这说明除三因素外还存在其他因素对模型产生影响，如菌体失活等。在该模型中，A2是显著项，即皂素浓度对温度呈平方关系。预测值为Rpre 2＝0.3648，与实际值Radj 2＝0.8846相差较大，说明模型区块效应明显，即可能存在其他因素对模型造成干扰。模型信噪比为9.294>4表明信号充足，该模型可用于设计空间。
对转化过程中葡萄糖浓度进行研究，并简单分析。得到的模型有效，模型显著 (F＝15.19)而失拟项不显著(F＝11.20),模型显著项为B、BC、A2、C2，分别代表葡萄糖浓度与皂苷含量的关系呈线性关系、与皂苷含量和菌体添加量的交互项呈线性关系，说明皂苷在被分解过程中有部分葡萄糖积累到溶液中。葡萄糖浓度与温度和菌体添加量呈平方关系，说明菌体对温度敏感，且菌体浓度越高，转化率越高，但一定程度时菌体也能利用葡萄糖进行生长。根据对比可以得出，B56利用葡萄糖的效率高于K172，说明其在转化过程中依然保持较高的菌体活性。利用响应面法对各因素之间的交互作用进行研究，发现皂苷浓度越低、菌体添加量越高，其转化率越高。利用响应面法对各因素之间的交互作用进行研究，发现对皂素浓度影响最大的因素为温度，而皂苷的添加对转化率影响并不明显，这有可能是皂苷对菌体的抑制作用引起的。根据响应面，通过方程求最佳解决方案，当转化率和皂素浓度权重为1：1时，得到的最适转化条件为：温度在36℃时，加入7.37g/L薯蓣皂苷，菌体接种量为4.1％，并预测转化率为52.78％。对所得结果进行验证，皂素平均转化率为48.57±1.22％(N＝5)，与预测值无显著差异。经过对比，发现B56在转化过程中转化率高于K172，其原因可能是综合菌体生长速率、葡萄糖利用率、持续转化效率造成的。
2.4pH调节方式对乳酸乳球菌K171和副干酪乳杆菌B56制备薯蓣皂素的影响
由于pH对乳酸乳球菌K171和副干酪乳杆菌B56菌体糖苷酶水解穿山龙皂苷制备薯蓣皂素的影响较大，且调节pH的方式也会影响酶的活性，因此转化体系考察了常用的pH调节方法—碱法直接调节和磷酸缓冲液调节对两菌株转化制备薯蓣皂素的影响，试验分为三组，对照组使用MRS肉汤直接进行培养；直接调节法使用浓度为0.1mol/L 的NaOH将皂苷溶液调节至pH＝7；缓冲液法使用pH＝7的磷酸缓冲液配制皂苷溶液结果如图4所示。
由图4可知，与对照相比，使用磷酸缓冲液调节转化体系的pH对乳酸乳球菌K171和副干酪乳杆菌B56菌体转化皂苷的转化率提高而葡萄糖的剩余浓度显著降低(p＜0.05)，使用磷酸缓冲液时K172和B56的皂苷转化率分别为52.4％和48.17％，葡萄糖残留量分别为0.41mmol/L和0.43mmoL/L，而对照组转化率分别为47.28％和36.77％，葡萄糖残留量分别为3.65mmol/L和2.72mmol/L，皂苷转化率分别提高了10.83％和 31.00％，葡萄糖残留量下降了3.24mmol/L和2.29mmol/L。使用NaOH调解转化体系的pH对K172和B56转化皂苷的转化率无显著影响(p＞0.05)，但葡萄糖残留量随NaOH 添加量的增高而降低(p＜0.05)。经过对比，可知以pH为7.0的磷酸缓冲液添加皂苷作为转化体系效果较好，能有效将pH维持在稳定范围。这说明以pH＝7的磷酸缓冲液作为转化体系是提高转化率有效的方法。
2.5边培养边转化与菌体直接转化制备薯蓣皂素的比较
以乳酸乳球菌K172作为试验菌株，比较菌体转化和边培养边转化制备薯蓣皂素的效果，转化时间均为96h，每隔12h取样测定转化率、菌体湿重和葡萄糖剩余量，菌体转化和边培养边转化分别从12h和36h开始取样，结果如图5所示。结果显示，在消耗相同培养基、反应条件相同的情况下，边培养边转化对薯蓣皂素的转化效率高于菌体转化，经过96h后，菌体转化的转化率为34.16％，菌体质量7.978g/L，葡萄糖浓度 5.01mmol/L；边培养边转化的转化率达到51.92％，菌体质量8.736g/L，葡萄糖浓度 4.85mmol/L。边培养边转化相较于菌体转化，其转化率比菌体转化增加17.76，菌体积累量增加了0.758g/L。在两种方法中菌体对葡萄糖利用速度方面，生长转化法的利用效率高于菌体转化法，同时，其菌体量也更大，说明培养转化法能增加菌体对体系中葡萄糖的利用效率，从而生成更多菌体。根据结果，通过菌体边培养边转化薯蓣皂素，不仅能提高菌体量，还能增加菌体对皂苷转化体系的耐受性，提高转化率。因此从转化效率和工艺操作复杂性上来讲，生长转化法优于菌体转化法。后续对生长转化法进行进一步研究。
3乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56培养转化制备薯蓣皂素工艺优化
3.1发酵条件对两菌株培养转化制备薯蓣皂素的影响
为得出生长转化法生产薯蓣皂素最适转化条件，对其进行单因素实验，对pH、温度、皂苷含量和菌体接种量四因素进行探究。基础反应条件为pH＝7，菌体接种量2％，皂苷含量0.9％，在36℃、120rpm摇床中生长转化72h。以pH(6～8)、反应温度(30～42℃)、菌体接种量(1～5％，V/V)和皂苷含量(0.3～1.5％，W/V)为变量，对皂苷转化率和葡萄糖浓度进行测定，结果见图6。
pH与转化率及葡萄糖浓度的关系如图6(a,b)所示，K172和B56在pH＝7情况下转化率最高，分别为57.69％和52.60％。当溶液pH在6～8范围内时，偏碱性环境对薯蓣皂素的影响小于偏酸性环境。根据葡萄糖的消耗量发现，pH值越低，菌体对葡萄糖的消耗速率越高，结合转化率可知当pH较低时菌体活性较高，当pH较高时酶活性较高，当pH＝7时，菌体的生长和酶的转化速率达到均衡状态。边培养边转化最适转化条件为pH＝7。
温度对薯蓣皂素的转化率及葡萄糖浓度的关系如图6(c,d)所示，K172和B56的转化率在36℃培养时达到最大值，分别为58.48％和54.71％。葡萄糖残余量与转化率呈相反关系，36℃时达到最低，葡萄糖浓度分别为1.63mmol/L和0.78mmol/L，但相对其他机组实验菌体对葡萄糖的利用率依然较高，据此推测温度对转化率的影响主要是由于酶活性收到抑制引起的，对菌体的生长的影响则是次要因素。
皂苷浓度与转化率及葡萄糖浓度的关系如图6(e,f)所示。随着薯蓣皂苷添加量提高，皂素含量随之提高，转化率降低。皂苷浓度为0.3％时，K172和B56转化率达到最大值，分别为59.91％和52.01％，皂素含浓度别达到292.76mg/L和254.16mg/L。皂苷浓度为1.5％时，K172和B56皂素浓度累计达到最大值，分别为790.36mg/L和847.76 mg/L，转化率分别为32.25％和34.7％
根据葡萄糖积累量发现，K172生长过程对薯蓣皂苷的加入并不敏感，其也能对分解过程中产生的葡萄糖进行利用。而高浓度皂苷则对B56生长起抑制作用，但并不明显，其分解产生的葡萄糖未能完全利用。结合两株菌转化率的关系，预计是由于两株菌之间的差异造成的，K172更偏向于酶的分解，B56则通过菌体积累实现转化分解。
接种量与转化率及葡萄糖浓度的关系如图6(g,h)所示。各菌体接种量与转化率的差异不大，K172和B56均在接种量3％时达到最大值，分别为58.92％和53.26％，其葡萄糖浓度随接种量变化关系呈现下降-上升-下降趋势。根据分析，在第一个阶段下降过程中，菌体生长不完全，转化率和葡萄糖消耗量随着接种量的提高；第二阶段上升过程中，皂苷分解造成副产物葡萄糖积累，从而提高菌液中葡萄糖含量；第三阶段下降中，由于接种量过大，葡萄糖消耗量过多，菌体的传代受到抑制，造成转化率呈下降趋势。根据结果可得最适接种量为3％。
综上，得出乳酸菌边转化边培养制备薯蓣皂素单因素最适条件为：K172最适pH＝7，温度为36℃，菌体接种量3％；B56最适pH＝7，温度为36℃，菌体接种量3％。且转化率随皂苷浓度的提高而降低，皂素含量随皂苷浓度的提高而提高。
3.2利用析因试验优化两菌株培养转化制备薯蓣皂素工艺
为进一步得出菌体接种量和皂苷添加量与转化率之间的关系，分别对两种菌进行两因素2×3析因实验。实验共四个响应值，分别对转化率、皂素含量、葡萄糖浓度和 OD260进行检测。结果通过最小二乘法进行分析和优化。
3.2.1副干酪乳杆菌B56析因实验优化
表10
通过方差分析，发现Y1、Y2、Y3均模型显著而失拟项不显著，模型有效。而Y4 (OD260)模型干扰项过多，模型并不显著。由于粗品皂苷和酵母膏中可能存在大量核酸物质，对结果造成干扰，因此后续不再进行分析。根据预测结果，可以拟合得到关于皂素浓度、转化率和葡萄糖的回归方程(7)、(8)、(9)。
Y1＝157.42+63.7X1+576X2-88X1X2 (7)
Y2＝55.91+3.92X1-10.8X2-5.49X1X2 (8)
Y3＝12-2.93X1-7.9X2+2.75X1X2 (9)
在后续优化过程中，我们希望提高薯蓣皂素转化效率，同时提升对皂苷的利用率，在对模型的预测刻画中，薯蓣皂素浓度(Y1)和转化率(Y2)意愿被同时设置为0.5，而对葡萄糖浓度不作要求。通过预测刻画器，得到最适菌体接种量为2％，皂苷添加量为0.944％。根据优化结果，通过B56生长转化制备薯蓣皂素的最适皂苷添加量为0.944％，菌体接种量为2％。通过对三个模型分析发现，随着皂苷浓度的提高，适当降低接种量有助于促进菌体更新换代，产生更多糖苷酶，加速对其他碳源的利用，从而提高转化率。对所得结果进行验证，得到培养液中皂素浓度和皂素转化率分别为650.84±7.80 mg/L和42.42±1.16％(N＝5)，与预测值基本相同。
3.2.2乳酸乳球菌K172析因实验优化
表11
K172实验结果见表11，通过最小二乘法分析，得到两因素对模型的影响效果及预测，通过方差析，发现Y1、Y2、Y3均模型显著而失拟项不显著，模型有效。根据预测结果，可以拟合得到关皂素浓度、转化率和葡萄糖的回归方程(10)、(11)、(12)。
Y1＝154.6+61.66X1+576X2-82X1X2 (10)
Y2＝78.25+2.66X1-28.1X2-1.85X1X2 (11)
Y3＝7.177-2X1-6.2X2+2.2X1X2 (12)
设置薯蓣皂素浓度(Y1)和转化率(Y2)意愿为0.5，对葡萄糖浓度不作要求。通过预测刻画器，得到最适菌体接种量为2％，皂苷添加量为0.917％。
根据优化结果，通过B56生长转化制备薯蓣皂素的最适皂苷添加量为0.917％，菌体接种量为2％。对所得结果进行验证，得到培养液中皂素浓度和皂素转化率分别为750.36±11.01mg/L和50.43±0.74％(N＝5)，与预测值无显著性差异。
虽然边培养边转化转化制备皂素优于菌体直接转化法，但培养液中皂苷浓度不低，后续探索补料、补料方式、双菌培养转化、葡萄糖及其加量、添加纤维素酶等对两菌株边培养边转化制备皂素的影响，以期进一步提高皂苷转化率和培养液中的皂素浓度。
3.3连续添加皂苷对培养转化制备薯蓣皂素的影响
连续发酵工艺通过向培养基中连续流加营养物质实现菌体的生长，薯蓣皂苷分子内含有一分子葡萄糖和两分子鼠李糖，作为一种碳源可促进菌体生长。因此，通过多次向培养基中添加皂苷的方式，既能促进菌体生长，又能提高产物薯蓣皂素积累量。
实验分为两组进行，对照组根据优化的最佳工艺参数进行边培养一般转化，实验组则从第二天开始，每天添加最适皂苷含量的50％，共发酵7天，取样测定培养转化过程中皂苷转化率和积累量的变化，结果见图7。
由图7可知，K172和B56通过生长转化方式转化率稳步提高，第7天时分别为76.73％和59.16％，皂素浓度则分别达到了1146.16mg/L和909.76mg/L。加料转化转化率相对趋向于稳定，从第四天开始转化率基本变化不大，第7天时分别为41.01％和 31.20％。而其皂素积累量则稳步提高，第七天时分别达到2144.16mg/L和1679.49mg/L，根据分析加料转化时两菌体的皂素积累量呈线性关系，通过拟合可以得到方程(13) 和(14)。
Y1＝335.84X-170.30 (13)
Y2＝261.31X-220.09 (14)
其中公式(13)为K171关于皂素浓度和时间的关系，Y1为薯蓣皂素浓度(mg/L)， X为时间(Day)；公式(14)为B56关于皂素浓度和时间的关系，Y2为薯蓣皂素浓度 (mg/L)，X为时间(Day)。
根据结果，通过加料转化的方式可有效提高薯蓣皂素积累量，提高转化效率。但补料的转化效率低于培养转化法，对皂苷的利用率更低，因此对皂苷补料方式需要进一步研究。
3.4皂苷添加方式和菌体混合培养转化对制备薯蓣皂素的影响
为探究皂苷添加方式以及双菌共同培养对制备薯蓣皂素的影响，共设计5组实验，第一组为对照组，在MRS肉体中添加0.9％的皂苷，接种量2％，温度36℃，磷酸缓冲液调节pH＝7；第二组为分批次添加皂苷加料，第一天加入0.2％，第三天和第四天分别加入0.35％，总添加量为0.9％；第三组为补料转化，第一天加入0.9％皂苷，后续每天加入0.45％皂苷；第四组为减半补料转化，第一天加入皂苷0.45％，后续每天加入0.225％皂苷；第五组为菌体混合转化，第一天加入0.9％皂苷，菌体接种时分别接入1％的K172 和B56菌液，所有组都培养7天，其转化率和皂素浓度所得结果如图8所示。
由图8可知，分批加料法转化薯蓣皂素对转化率有促进作用(P<0.05),其转化率对B56和K172分别达到42.91％和54.48％(对照组分别为40.77％和50.86％)；连续补料和减半连续补料的方法对转化率有明显抑制作用(P<0.05),对连续补料法，其转化率分别为26.64％和34.33％，对减半连续补料法，其转化率分别为29.95％和36.44％。但其皂素积累含量提高(P<0.05)，其中K172通过连续补料方式在几种方法中皂素浓度最高，达到1761.6mg/L，B56连续补料法转化率达到1366.9mg/L(对照组分别为 597.6mg/L和745.6mg/L)；当通过降低皂苷添加量而进行补料发酵时，其转化率分别提高了12.42％和6.15％，但其皂苷积累量显著降低，分别为768.3mg/L和934.9mg/L；使用菌体混合法生长转化对皂苷转化率影响不明显(P＝0.3359>0.05)，两菌体生长对薯蓣皂素转化贡献值相当，菌体之间无拮抗或促进作用，转化率没有变化。
综上，使用分批加料对皂苷转化率影响有促进作用，可以使用分批加入皂苷的方式优化转化工艺；使用连续补料的方式会降低转化率，但能提高皂素积累量，使用该方法能进一步提高单位反应体积内皂素的转化效率，但会增加皂素提取过程的难度；使用菌体混合转化的方法对转化率无显著影响。
3.5菌体形态观察及薯蓣皂素样品物性分析
3.5.1皂苷对优势菌株生长影响的电镜观察
为研究皂苷对6株优势乳酸菌菌株生长的微观形态影响，分别将菌株接种于皂苷-MRS肉汤培养基中，以不添加皂苷的MRS肉汤为对照，37℃培养48h，离心收集菌体，样品经处理后通过扫描电镜对菌体形态进行观察，结果如图10所示。
将两组电镜图片进行对比，菌体形态的变化共可分为三种：对K171和K172，其细胞表面颗粒明显增多；对014和B56，菌体表面褶皱加重；对2C2和C1，其裂殖中段出现褶皱，过度更加圆滑。由于菌体不能对薯蓣皂素进行利用且皂素不溶于水，细胞表面结构推测直接来自皂素的积累，由于菌体不同，其呈现形式不同。K171和K172 为乳酸乳球菌，由于没有荚膜，且皂素不溶于水，皂素可能吸附于菌体表面，014和 B56为杆菌，在生长过程中分泌物依附于细胞壁结构上造成褶皱，而C1和2C2为球菌，由于长度较短，分泌物积聚于裂殖缝隙处。
皂苷的引入对细胞结构无破坏，细胞未发生生理形态改变，如脱水、破裂等，因此可知乳酸菌在边培养边转化制备薯蓣皂素时在MRS肉汤培养基中添加皂苷对菌体的形态无显著影响。
3.5.2薯蓣皂素样品熔点测定
对标准品薯蓣皂素、工业皂素、乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56培养转化和菌体转化的K171和B56制备的皂素样品测定熔点，结果如图11所示。通过菌体转化和边培养边转化得到薯蓣皂素熔点在200.4～203.6℃之间，标准品薯蓣皂素熔点为 204.7℃。根据薯蓣皂素地方标准，薯蓣皂素优等品熔点≥196℃，一等品在195℃，二等品熔点在194℃左右。根据结果，四种提取方式所得薯蓣皂素均符合优等品标准。
3.5.3薯蓣皂素样品晶体形态
取少量上述晶体干粉于载玻片上，显微镜观察其晶体形态结构。根据晶体形态图，标准品皂素晶体纯净，晶型完整，整个晶体呈针状，晶体较大且透明。工业品薯蓣皂素晶型较小，以团块状聚集，质地松软，晶体相对纯净。通过生长转化制备的薯蓣皂素杂质较多，多呈非晶体状态，而薯蓣皂素结晶晶体较小，以游离态居多。分析其原因，是由于培养基中部分物质溶于萃取液中，薯蓣皂素结晶过程中仅采用了浓缩结晶，未进一步提纯导致的，后续可进一步分离纯化。菌体转化法制得的薯蓣皂素晶型完整，体积较小，多以游离态存在。杂质多以团块状存在，也可通过改进提纯合结晶方法提高纯度，制取纯度更高的薯蓣皂素。
3.5.4薯蓣皂素定性分析
分别采用HPLC-UV法和HPLC-ELSD法对薯蓣皂素样品进行定性分析，样品情况如表12和表13所示。
表12
表13
通过UV检测203nm波长，对不同薯蓣皂素进行进一步分析，结果如表13所示。根据结果，发现菌体转化所得物质与薯蓣皂素标准品出峰时间基本相同，大致时间为 5.310min理论塔板数相差不大，基本可以确定为同一种物质。蒸发光散射检测器(ELSD) 通过挥发流动相并对待测物视差折光进行检测，其对薯蓣皂素灵敏度高于普通UV检测器。通过ELSD检测器对薯蓣皂素进行定性分析，发现薯蓣皂素吸收峰在5.40min 左右，四种转化样本与标准品出峰时间基本一致，因此可判定为同一种物质。其中K172 菌体转化法制备的皂素有杂峰出现。对UV检测法和ELSD检测结果进行比较，发现 ELSD检测灵敏度更高，效果更好，参考人参皂苷两种检测方法，这是由于甾体皂素类物质紫外波段吸光能力较弱，而光散射效应明显，进一步为ELSD法测定薯蓣皂素浓度提供了支持。根据薯蓣皂素地方标准(DB42/T277-2004薯蓣皂素[S].湖北:湖北省质量技术监督局,2004.)要求，通过使用120#汽油重结晶的方法可以进一步提高纯度，达到工业纯度要求，或使用重结晶法(张艳,吴永江,王龙虎,等.黄姜有效成分薯蓣皂素结晶工艺研究[J].中国现代应用药学,2015,32(03):301-304.)提高纯度，以实现提高样品薯蓣皂素纯度的目的。
4结论
乳酸乳球菌K172菌体直接转化制备薯蓣皂素的最佳工艺参数为：皂苷浓度0.7％(W/V)，菌体添加量4.3％，pH7.0，36℃恒温转化72h，皂苷转化率为(41.54±0.52)％，与预测值无显著性；副干酪乳杆菌B56菌体转化制备薯蓣皂素的最佳工艺参数为：皂苷添加量0.74％(W/V)，菌体添加量4.7％，pH＝7.0，36摄氏度时转化72h，皂苷转化率(48.57±1.22)％，与预测值无显著差异。在对缓冲液体系的探索中，发现使用pH＝7 的PB溶液分别使转化率提高了5.12％和2.56％。乳酸乳球菌K172采用边培养边转化法制备薯蓣皂素的最佳发酵条件为：皂苷浓度0.94％(V/V)，菌体添加量2％，pH＝7.0， 36℃培养转化72h，皂苷转化率达到(42.42±1.16)％，与预测值无显著差异；副干酪乳杆菌B56采用边培养边转化法制备薯蓣皂素的最佳发酵条件为：皂苷浓度0.92％ (V/V)，菌体添加量2％，pH＝7.0，36℃培养转化72h，皂苷转化率达到(50.43±0.74)％，与预测值无显著差异。连续发酵培养可提升薯蓣皂素转化效率，发现K172和B56转化率分别维持在41％和31％左右，转化7天时皂素累积浓度分别达到1146.16mg/L和 909.76mg/L。通过分批加料的方式分别使转化率提高了2.14％和3.62％，两菌株均不能通过降低葡萄糖浓度的方法提高转化率。扫描电子显微镜(SEM)观察发现皂苷的添加对菌体结构无负面影响。乳酸乳球菌K172和副干酪乳杆菌B56菌体转化和边培养边转化所得的4种薯蓣皂素的熔点范围在200.4～203.6℃之间，符合地方标准优等品水平，其晶体形态完整，结晶体积较小。通过高效液相色谱UV和ELSD对皂素进行定性检测，自制薯蓣皂素和标准品、工业皂素的出峰时间一致，峰形完整，而ELSD检测器对薯蓣皂素更灵敏。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种利用乳酸菌转化制备薯蓣皂素的方法，其特征在于，包括（1）或（2）所示的任一种方法：
（1）直接转化法，其包括如下步骤：
A1：将活化后的乳酸菌接种到MRS培养基，分离收集菌泥，并将所述菌泥加入皂苷溶液中转化制备皂素；
A2：向步骤A1所得发酵液中加入四氯化碳萃取，再经分离纯化，得到所述薯蓣皂素；
（2）边培养边转化法，其包括如下步骤：
B1：将乳酸菌接种至皂苷-MRS培养基中边培养边转化制备皂素；
B2：向步骤B1所得发酵液中加入四氯化碳萃取，再经分离纯化，得到所述薯蓣皂素；
所述乳酸菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）B56，其保藏号为CICC20355；
采用所述直接转化法，用所述副干酪乳杆菌B56转化时，转化条件为：将MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72 h；所述皂苷溶液中皂苷浓度为W/V=0.7-1.3%；所述乳酸菌接种至MRS培养基中的菌体的浓度，按照质量浓度计为3-5%；
采用所述边培养边转化法，用所述副干酪乳杆菌B56转化时，转化条件为：按照质量浓度计，将2%-3%的副干酪乳杆菌B56接种至皂苷-MRS培养基中培养24 h；将皂苷-MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72 h；所述皂苷-MRS培养基中皂苷的浓度，按照体积分数计为0.8-1.0%；
所述乳酸菌为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）K172，其保藏号为CICC 20410；
采用所述直接转化法，用所述乳酸乳球菌K172转化时，转化条件为：将MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72 h；所述皂苷溶液中皂苷浓度为W/V=0.7-1.3%；所述乳酸菌接种至MRS培养基中的菌体的浓度，按照质量浓度计为3%-5%；
采用所述边培养边转化法，用所述乳酸乳球菌K172转化时，转化条件为：按照质量浓度计，将2%-3%的副干酪乳杆菌K172接种至皂苷-MRS培养基中培养24 h；将皂苷-MRS培养基的pH调至7，在36℃下恒温转化72 h；所述皂苷-MRS培养基中皂苷的浓度，按照体积分数计为0.8-1.0%；
所述皂苷的添加方式为分批次添加，所述分批次为第一天加入0.2%，第三天和第四天分别加入0.35%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌泥按照质量分数2%加入所述皂苷溶液中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MRS-皂苷培养基的配包括：向pH=7.0的磷酸缓冲液中加入按照质量浓度计为0.9%的皂苷，溶解后进行抽滤，再向滤液中加入MRS培养基。
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