CN114933979B - 扣囊复膜酵母菌株sf-1、用该菌株制备的胞外蛋白及制备方法 - Google Patents

扣囊复膜酵母菌株sf-1、用该菌株制备的胞外蛋白及制备方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种扣囊复膜酵母菌株SF‑1、用该菌株制备的胞外蛋白及制备方法。菌株SF‑1的保藏编号为CGMCC No.22671；利用该菌株制备胞外蛋白的方法包括：将菌株SF‑1经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液接种至液体发酵培养基进行发酵培养处理得到发酵液；对所述发酵液进行分离处理得到上清液，对所述上清液进行沉淀处理即得所述胞外蛋白。该胞外蛋白具有高效的清除自由基、保护皮肤紫外损伤和提高内源性抗氧化酶的活性从而抗氧化的作用，可以作为功效成分加入到化妆品配方；制备成本低、操作简单、绿色安全等特征，具有较强的实用性和推广价值。

Description

扣囊复膜酵母菌株SF-1、用该菌株制备的胞外蛋白及制备 方法
技术领域
本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)菌株SF-1、用该菌株制备的胞外蛋白及制备方法。
背景技术
扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)，又称拟内孢霉，是子囊菌门(Ascomycota)酵母亚门(Saccharomycotina)下酵母纲(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)复膜酵母属(Saccharomycopsis)的一个种，一类产子囊孢子的二形态酵母。扣囊复膜酵母是FDA公认的食品安全级酵母，与其他微生物协同作用对酒精的生成和白酒风味的形成都具有重要贡献。扣囊复膜酵母作为一类高产酶的应用型酵母，分泌的淀粉酶(α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、生淀粉糖化酶)、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶类，可以将大分子物质分解为小分化合物，其应用在食品发酵和制药工业中具有重要的意义。
但是，关于扣囊复膜酵母分泌的胞外蛋白应用于化妆品方面的报道目前还是空白，发明人筛选得到一种新型扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1，其分泌的胞外蛋白具有高效的清除自由基、保护皮肤紫外损伤和提高内源性抗氧化酶的活性从而抗氧化的作用，可以作为功效成分用于化妆品。
发明内容
在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
为解决上述技术问题，本公开提供的技术方案是：
第一方面，本公开提供一种扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1，其保藏编号为CGMCC No.22671。
本公开的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1由申请人从黄酒曲中分离纯化得来，具体做法如下：将黄酒曲接种于YPD液体培养基(酵母浸出粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉15g/L，葡萄糖20g/L)中培养制成菌液，取100μl菌液用灭菌水稀释10倍，继续用无菌水稀释至10-6～10-7倍，吸取50μL稀释后的菌液于孟加拉红固体平板上(孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO41g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉15g/L)，用涂布棒涂匀，28℃培养48h。挑选单个的具有典型酵母菌菌落特征且形态差异较为明显的菌落，划线纯化2～3代，将上述分离纯化得到的酵母菌接入YPD斜面培养基，4℃保藏。
第二方面，本公开提供一种扣囊复膜酵母胞外蛋白的制备方法，包括：
将上述扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液接种至液体发酵培养基进行发酵培养处理得到发酵液；
对所述发酵液进行分离处理得到上清液，对所述上清液进行沉淀处理即得所述胞外蛋白。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述种子液的OD值为0.5-1.0，所述种子液和所述液体发酵培养基的体积之比为2％-5％(比如2.2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％等)。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述培养基为YPD培养基，其配方为：20g/L的葡萄糖、20g/L的胰蛋白胨和10g/L的酵母浸粉，如果是固体培养基则另添加20g/L的琼脂粉；所述培养基在接种前需经灭菌处理，比如在115℃下高温灭菌20min。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述发酵培养处理的温度为25-35℃(比如26℃、28℃、30℃、32℃/34℃等)，时间为24-48h(比如28h、30h、35h、40h、42h、45h等)。
更进一步地，所述发酵培养处理在摇床中进行，摇床中转速为150r/min-180r/min(比如155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、175r/min)。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min(比如4600r/min、4800r/min、5000r/min、5200r/min、5400r/min等)，离心时间为10min-20min(比如12min、15min、18min等)。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述沉淀处理采用本领域内常规方法处理，比如醇沉法，硫酸铵法等。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述沉淀处理包括：将所述上清液置于冰水浴中，在磁力搅拌器的搅拌下加入硫酸铵至溶液饱和，搅拌10～30min后于离心机以约10000r/min离心10min收集沉淀。
进一步地，上述胞外蛋白的制备方法中，所述沉淀处理包括：往所述上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，于4℃下醇沉24h，4900r/min离心收集沉淀。
第三方面，本公开提供一种由上述制备方法制得的胞外蛋白。
第四方面，本公开还提供一种含有上述胞外蛋白的化妆品。所述化妆品可以是面膜、精华液、面霜、乳液等。
按上述方案，所述化妆品成分中所述胞外蛋白的质量百分含量为3.0％～0.1％(比如2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.7％、0.5％等)。
相比于现有技术，本公开的有益效果包括但不限于：
1、本公开提供一种扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1，其保藏编号为CGMCC No.22671，该菌株能生产胞外蛋白，该胞外蛋白具有高效的清除自由基、保护皮肤紫外损伤和提高内源性抗氧化酶的活性从而抗氧化的作用，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，制备面膜、精华液、防晒霜、乳液等化妆品；
2、本公开提供的扣囊复膜酵母胞外蛋白作为化妆品功效成分具有功效性强、成本低、操作简单、绿色安全等特征，具有较强的实用性和推广价值。
本公开的扣囊复膜酵母新菌株保藏日期为2021年06月07日，保藏编号为CGMCCNo.22671，分类命名为：扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
附图说明
图1为扣囊复膜酵母菌株SF-1的鉴定结果进化树；
图2、图3分别为实施例2.2中蛋白标准品、实施例2.1所得扣囊复膜酵母胞外蛋白的高效液相色谱(HPLC)分析图谱；
图4为实施例2.1制得的胞外蛋白清除DPPH自由基结果示意图；
图5、图6分别为实施例2.1制得的胞外蛋白对人皮肤成纤维细胞毒性以及对人皮肤成纤维细胞紫外损伤的保护作用的结果示意图；
图7、图8为实施例2.1制得的胞外蛋白对人皮肤成纤维细胞内活性氧(ROS)影响的结果示意图；
图9为实施例2.1制得的胞外蛋白的总抗氧化能力的结果示意图；
图10中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对超氧化物歧化酶(SOD)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；
图11中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对过氧化氢酶(CAT)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；
图12中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；
图13中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对NF-E2相关因子Nrf2的核易位和mRNA表达水平的影响结果示意图；
图14中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对Kelch Like ECH相关蛋白1(Keap1)含量和mRNA表达水平影响的结果示意图；
图15中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对Nrf2/Keap1通路下游抗氧化酶HO-1酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；
图16中的(a)、(b)、(c)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对MAF bZIP转录因子K(Mafk)、p38蛋白、PI3K蛋白的mRNA表达水平影响的结果示意图；(d)为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对MMP-1酶活性影响的结果示意图；
图17中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对I型胶原蛋白(COL-1)含量和mRNA表达水平影响的结果示意图；
图18为实施例2.1制得的胞外蛋白的鸡胚尿囊膜刺激性的结果示意图；
图19、图20为实施例2.1制得的胞外蛋白对红细胞溶血试验的溶血曲线和溶血结果示意图；
图21为实施例2.6制得的化妆品的稳定性评价结果示意图；
图22为实施例2.6制得的化妆品使用后感官评价结果示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。再不背立本发明精神和实质的情况下，本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，属于本发明的范围。
在下文中将结合示范性实施例对本公开的技术方案进行描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1的分离、鉴定和 保藏
1、菌种的分离
扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1从黄酒曲分离得到。具体地，本申请人将黄酒曲接种于YPD液体培养基(酵母浸出粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉15g/L，葡萄糖20g/L)中培养制成菌液，取100μl菌液用灭菌水稀释10倍，继续用无菌水稀释至10-6～10-7倍，吸取50μL稀释后的菌液于孟加拉红固体平板上(孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉15g/L)，用涂布棒涂匀，28℃培养48h。挑选单个的具有典型酵母菌菌落特征且形态差异较为明显的菌落，划线纯化2～3代，将上述分离纯化得到的酵母菌接入YPD斜面培养基，4℃保藏。
2、菌种筛选实验
本申请人将从孟加拉红固体培养基分离出来的单菌落接种于50ml YPD液体培养基中培养2d，分别编号1～6号。按照实施例2.1所述的盐析浓缩法提取胞外蛋白，50ml去离子水溶解成蛋白溶液。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定各个菌落胞外蛋白的含量。1～6号菌落的胞外蛋白含量如表1所示，筛选的高产蛋白的4号菌种于斜面保存，送往北京新时代众合科技有限公司鉴定菌种。
表1各菌株胞外蛋白蛋白含量测定
3、菌种的鉴定
4号菌株在孟加拉红培养基平板上的菌落为圆形，白色，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明。
按照真菌基因组DNA提取试剂盒(品牌为OMEGA，型号为D3390-02)的操作步骤，提取SF-1的基因组DNA。以上述提取的SF-1基因组DNA作为扩增模版，以真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性3min(1个循环)，94℃变性30sec、54℃退火30sec和72℃延伸1.5min(24个循环)。对得到的PCR产物进行测序，SF-1的rDNA-ITS序列与NCBI数据库中已公开的rDNA-ITS序列进行在线同源性对比，结果显示SF-1与扣囊复摸酵母菌(Saccharomycopsisfibuligera strain)的核酸序列同源性最高，相似性为99％。图1为4号菌株的鉴定结果进化树，从图中可以看出4号菌株为扣囊复膜酵母菌株，命名为SF-1，Genebank号：OK236774。
4、菌种的保藏
SF-1已于2021年06月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.22671。SF-1的全称为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)No.22671。
实施例2.1扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1发酵实验制 备胞外蛋白
(1)菌种活化：从保藏的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)菌株SF-1斜面中挑取菌落放入装有50ml液体培养基的250ml锥形瓶中，放入摇床中(180rpm)将菌种活化，使保持更高的生活力。
(2)菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。
(3)菌种扩培：将待用菌种单菌落接种到相应液体培养基中，在适宜温度的摇床中培养，至其OD值＝0.5～1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度，得到种子液。酵母菌的活化、纯化、扩培的培养温度28℃，所用培养基为YPD培养基，配方为：20g/L的葡萄糖、20g/L的胰蛋白胨和10g/L的酵母浸粉(固体培养基添加20g/L的琼脂粉)，接种前经115℃下高温灭菌20min。
(4)接菌和摇菌：按照体积百分比5％的接种量，将种子液5mL接种于装有100mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，并且在摇床中发酵，转速为180r/min，培养温度为28℃，发酵时间为48h。
(5)离心：离心处理发酵液，4800r/min离心10min，取上清液。
(6)将上清液置于冰水浴中，在磁力搅拌器的搅拌下加入硫酸铵至溶液饱和，搅拌30min后于离心机以约10000r/min离心10min收集沉淀，即得到粗提的胞外蛋白。
对实施例2.1制得产物的主要成分，包括蛋白质、粗多糖进行检测；同时对其体外清除自由基和保护成纤维细胞免受UVA损伤进行分析，对其抗氧化、抗衰老和保护作用进行评价。
实施例2.2扣囊复膜酵母胞外蛋白的理化性质分析
对实施例2.1制备所得的扣囊复膜酵母胞外蛋白采用高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography\HPLC)进行理化性质分析。
(1)色谱条件：1)色谱柱：TsK gel 2000SWXL 300mm×7.8mm；2)流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7)+0.3mol/L NaCl；3)检测波长：UV 220nm；4)流速：1ml/min；5)柱温：25℃；6)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样；7)标准样品：将牛血清蛋白(Mr 67000)、维生素B12(Mr 1335)、氧化型谷胱甘肽(Mr614)配成混合标准品，每种物质含量均为5mg/ml。
(2)标准曲线的制定：将上述三种标准样品按5mg/ml配制，按照上述色谱条件进行分析，图2蛋白标准品的高效液相色谱(HPLC)分析图谱；三种标准品的洗脱时间和分子量的如表2所示，以洗脱时间为横坐标，分子量为纵坐标计算标准曲线：
表2蛋白标准品HPLC洗脱时间与分子量
(3)样品的分析：
表3扣囊复膜酵母胞外蛋白的HPLC及分子量
将制备好的样品按上述色谱条件进行分析，参见图3扣囊复膜酵母胞外蛋白的HPLC分析图谱，将得到的样品的洗脱时间依照制作的标准曲线计算样品中蛋白质分子量的大小如表3所示。
实施例2.3扣囊复膜酵母胞外蛋白的抗氧化功效分析
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
本实施例中实验步骤如下：使用水倍比稀释实施例2.1中制得的胞外蛋白样品至如下5个浓度：30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml、3.25mg/ml和1.875mg/ml。样品加液要求见表4。在所有试管中(T、T0、C、C0)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性用95％乙醇，补足3mL，混匀。在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL，样品本底(T0)和溶剂本底(C0)用95％乙醇替代，摇匀，室温下静置5min。将各反应溶液移入1cm比色皿中，测定在517nm处的吸光值。
表4样品加液要求
按照下式计算DPPH清除率：
式中：T为样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；T0为样品本底吸光值；C为DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；C0为溶剂本底吸光值。
通过实验得到的DPPH自由基清除率作用曲线如图4所示，半清除率(IC50)为5.037mg/ml。说明实施例2.1制得的扣囊复膜酵母胞外蛋白具有较强的抗氧化能力，可以清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
实施例2.4扣囊复膜酵母胞外蛋白对皮肤成纤维细胞的功效性分析
一、扣囊复膜酵母胞外蛋白对成纤维细胞的毒性和保护作用
本实施例中实验步骤如下：将人皮肤成纤维细胞(HSF)在含有添加10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养液的培养瓶中进行培养。细胞保存在含5％CO2的37℃的HeraCell CO2孵箱中培养2天。
使用基础培养基DMEM倍比稀释实施例2.1所得到的扣囊复膜酵母胞外蛋白，浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml，过无菌滤膜备用。加样要求和操作步骤如表5所示，实验在96孔板中进行。
表5实验加液操作要求
细胞存活率计算公式如下：
图5为实施例2.1制得的胞外蛋白对人皮肤成纤维细胞毒性的结果示意图，从图中可以看出，胞外蛋白几乎不存在毒性作用，5个浓度下的细胞存活率都在95％以上，并且在5.0mg/ml和10.0mg/ml处细胞存活率高于100％，表现出促进细胞生长的趋势。图6为实施例2.1制得的胞外蛋白对人皮肤成纤维细胞紫外损伤的保护作用的结果示意图，从图中可以看出，胞外蛋白与UVA损伤模型组相比较，在胞外蛋白的孵育下的HSF的死亡程度得到了明显得到的改善。通过细胞实验可知胞外蛋白对细胞的毒性作用较小，甚至呈现出促进作用，并且可以有效地减少了UVA诱导的细胞死亡率。
二、扣囊复膜酵母胞外蛋白对胞内活性氧含量的影响
活性氧(ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激，因此导致的细胞氧化应激损伤会致使细胞结构和功能发生变化，会加快细胞的凋亡和衰老。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，因此可以通过细胞内DCF的荧光强度来检测胞外蛋白对清除细胞内活性氧能力的大小。
本实施例的具体步骤如下：使用基础培养基DMEM倍比稀释实施例2.1所得到的扣囊复膜酵母胞外蛋白，浓度分别为10mg/ml、5mg/ml和2.5mg/ml，将VC作为阳性对照，过无菌滤膜备用。加样要求和操作步骤如表6所示，实验在6孔板中进行。
表6实验加液及操作要求
图7、图8为实施例2.1制得的胞外蛋白对人皮肤成纤维细胞内活性氧(ROS)影响的结果示意图，从图中可以看出，胞外蛋白孵育后细胞内的ROS荧光阙值都极其显著性地下降(p<0.001)，当浓度为10.0mg/ml时荧光阙值为892.63±27.62，比空白对照组要低且与阳性对照组接近，说明胞外蛋白对抑制细胞内活性氧水平的增高具有有效的作用。
三、扣囊复膜酵母胞外蛋白的总抗氧化能力
机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS˙+，在抗氧化物存在时ABTS˙+的产生会被抑制，在414nm或734nm测定ABTS˙+的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。Trolox是一种维生素E的类似物，具有和维生素E相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物总抗氧化能力的参考。
取按实施例2.4第二部分所述的孵育步骤孵育完后，除去培养液，用PBS清洗两次后冰浴条件下加200ul细胞裂解液(IP裂解液：PMSF＝100:1)裂解1～2min后用细胞刮刀刮取细胞并收集，将收集的细胞于高速低温离心机(10000r/min，4℃)离心1min，取上清液(-80℃冷藏备用)。
按总抗氧化能力试剂盒(ABTS法)说明要求将ABTS工作液配好避光反应12h，用PBS将ABTS工作液稀释至OD734＝0.7±0.05。于96孔板中加入200μl的ABTS工作液，每孔加入10μl配置好的Trolox做标准曲线。每孔加入10μl的裂解的细胞液作为样品孔，每孔加入10μlPBS作为空白孔，每孔加入10μl的VC溶液为阳性对照孔，测定其总抗氧化能力。
图9为实施例2.1制得的胞外蛋白的总抗氧化能力的结果示意图，从图中可以看出，孵育后的HSF的总抗氧化能力都有显著性的增高(p<0.01)，并呈剂量依赖性增加，在10.0mg/ml处达到1.096±0.006mM Trolox。
四、扣囊复膜酵母胞外蛋白对细胞内酶活性及蛋白含量的影响
细胞内的抗氧化物酶是细胞中消除过氧化物的重要防线，保护细胞免受氧化应激损伤，其中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶是抗氧化物酶中的重要成员，除此之外，Nrf2/Keap1信号通路是抗氧化的调控通路，HO-1即该通路的下游调控因子，也是抗氧化物酶的重要成员，因此测定细胞内抗氧化物酶的酶活性和Nrf2/Keap1通路中重要因子含量及其基因表达水平对评估样品的抗氧化能力有重要的意义。
细胞外基质(ECM)中的胶原蛋白的减少是皮肤衰老的重要体现，在紫外线或其他环境刺激下细胞内上调的基质金属蛋白酶(MMPs)会降解ECM，其中基质金属蛋白酶1(MMP-1)主要降解I型胶原蛋白(COL-I)，细胞分泌的胶原蛋白的含量和基质金属蛋白酶的酶活性大小及其基因表达水平的高低是评估样品抗衰老性能的重要指标。
本实施例步骤按实施例2.4第三部分所制备的裂解的细胞液上进行，按照超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、HO-1、基质金属蛋白酶1(MMP-1)ELISA酶活性检测试剂盒和Nrf2、Keap1、I型胶原蛋白(COL-I)ELISA蛋白含量检测试剂盒说明书要求进行。
五、扣囊复膜酵母胞外蛋白对细胞内蛋白表达水平的影响
(1)RNA的提取：
本实施例步骤按实施例2.4第三部分的方法裂解完细胞后，加入0.2mL氯仿，手摇振荡2min；4℃条件下8000r/min离心15min；取上层水相，加入等体积异丙醇(约700μL)，振荡，静置15min；于12000r/min离心10min，去上清，向沉淀中加入l mL 70％乙醇洗涤，于8000r/min离心10min；重复一次乙醇洗涤；室温干燥15min；加入40μL DEPC处理的ddH2O，溶10min(-80℃冷藏备用)。
(2)cDNA合成：
使用TINAGEN FastQuantRT试剂盒，FastQuant cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成反应，向cDNA中加入1000μl ddH2O，稀释并混合，并在-20℃下保存。
(3)引物的设计：
根据NCBI发布的序列基因，用PrimerExpress软件设计特异性引物，同时设计管家基因β-actin的特异性引物，如表7所示。
表7qRT-PCR引物序列
(4)实时荧光PCR扩增：
以cDNA为模板，反应体系为20μL，PrimeScriptRT Enzyme MIX 10μl，正向、反向引物各0.5μl，cDNA模板1μl，ddH2O补足20μl，使用实时荧光定量PCR仪扩增，扩增条件为95℃2min的预变性，然后在95℃下进行15s，在60℃下进行15s，在72℃下进行30s的40个循环，并在72℃下收集荧光信号。
图10中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对超氧化物歧化酶(SOD)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图，从图中可以看出，与UVA模型组相比，胞外蛋白孵育后的HSF内SOD酶活性和mRNA表达水平得到了不同程度的改善，在10.0mg/ml时的效果最强，但与空白对照组相比，胞外蛋白对SOD的mRNA表达水平的影响较弱，最高仅达0.189±0.008。
图11中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对过氧化氢酶(CAT)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图，从图中可以看出，与UVA模型组相比，胞外蛋白孵育后的HSF内CAT酶活性和mRNA表达水平都得到了不同程度的改善，在5.0mg/ml时的效果最强。尤其对于CAT mRNA的表达水平的影响较大，表达水平都要高于未诱导损伤的空白对照组。
图12中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图，从图中可以看出，与UVA模型组相比，胞外蛋白孵育后的HSF内GSH-px酶活性和mRNA表达水平都得到了不同程度的改善，在10.0mg/ml时的效果最强。
图13中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对NF-E2相关因子Nrf2的核易位和mRNA表达水平的影响结果示意图，从图中可以看出，UVA诱导损伤后，细胞质内和细胞核内的Nrf2含量变化极其显著，说明Nrf2被阻断进入细胞核的程度加大，从而下调了Nrf2的信号传导，但经过胞外蛋白孵育后，Nrf2的核易位得到了极其显著地改善，除此之外Nrf2 mRNA的表达水平也有了极其显著性的提高。这说明胞外蛋白可以减缓因UVA导致的Nrf2核易位程度降低，来提高Nrf2的信号传导。
图14中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对Kelch Like ECH相关蛋白1(Keap1)含量和mRNA表达水平影响的结果示意图，从图中可以看出，UVA诱导损伤后的细胞内Keap1蛋白的含量以及表达水平都有了极其显著性的提高，Keap1的增多会增强对Nrf2信号传导的阻断。但经过胞外蛋白的孵育后，细胞内的Keap1蛋白含量和mRNA的表达水平都得到了极其显著性的降低。这说明胞外蛋白可以通过减少因UVA导致的Keap1蛋白含量及mRNA表达水平的提高，来改善Keap1对Nrf2信号传导阻断的影响。
图15中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对Nrf2/Keap1通路下游抗氧化酶HO-1酶活性和HO-1mRNA表达水平的结果示意图，从图中可以看出，UVA诱导损伤后的细胞内HO-1酶活性和mRNA的表达水平都被显著下调，而经过胞外蛋白孵育后的细胞内HO-1酶活性和mRNA表达水平都有了极其显著性地提高。HO-1作为Nrf2/Keap1通路的下游调控酶，这说明胞外蛋白成功通过上调Nrf2/Keap1通路的传导提高了下游调控基因的转录表达。
图16中的(a)-(c)分别分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对MAF bZIP转录因子K(Mafk)、p38蛋白、PI3K蛋白的mRNA表达水平影响的结果示意图，从图中可以看出，UVA诱导损伤后，对mRNA的表达水平影响不显著，但经过胞外蛋白孵育后，Mafk mRNA、p38 mRNA、PI3K mRNA的表达水平有极其显著性的提升。
图16中的(d)为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对MMP-1酶活性影响的结果示意图，从图中可以看出，于空白对照组相比，UVA诱导损伤后细胞内MMP-1酶活性有显著地增高，经过胞外蛋白孵育后，MMP-1的酶活性有了极其显著性地下降，这说明胞外蛋白可以有效地缓解因UVA诱导引起的MMP-1酶活性的增强，来有效地减缓COL-I的分解。
图17中的(a)、(b)分别为实施例2.1制得的胞外蛋白分别对I型胶原蛋白(COL-I)含量和mRNA表达水平影响的结果示意图，从图中可以看出，UVA诱导损伤后的COL-I蛋白含量和mRNA表达水平都有显著地下降，而经过胞外蛋白孵育后COL-I蛋白含量和mRNA表达水平有极其显著性地提高这说明胞外蛋白可以有效地减缓因UVA诱导引起的COL-I的降解和表达水平的下调，从而有效地起到抗衰老的作用。
实施例2.5扣囊复膜酵母胞外蛋白的安全性评价
一、鸡胚绒毛尿囊膜试验(HET-CAM)
鸡胚绒毛尿囊膜试验(HET-CAM)是一种经典的眼刺激性体外评估方法，适用于对化妆品产品或原料的评价。绒毛尿囊膜(CAM)是位于鸡胚周围的呼吸膜。本试验利用孵化中期的CAM血管膜系统完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与CAM接触，作用一段时间之后通过观察绒毛尿囊膜毒性效应指标(如：出血、凝血和血管融解)的变化，组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。这些指标反映了血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度。
采用终点评价法进行的试验，应计算终点评分(ES)。根据鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度；每个样品做六组平行试验，并将各血管反应分值相加，以总分值最高的血管反应得分作为最终分值，以该组中评分最高的值作为反应ES值。根据ES数值按表8对受试物眼刺激性进行分类。
表8 HET-CAM终点评估法的眼刺激性预测模型
受试物包括：阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和实施例2.1中制得的扣囊复膜酵母胞外蛋白溶液(10mg/ml)。对阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和扣囊复膜酵母胞外蛋白溶液加样前后的CAM进行形态学观察和打分，得到表9如下，其中编号1、2、3、4、5、6分别为样品的平行，根据评分可知扣囊复膜酵母胞外蛋白无眼刺激性。鸡胚绒毛尿囊膜试验结果见图18，可见样品作用其前后均无出血现象，可知扣囊复膜酵母胞外蛋白无眼刺激性。
表9鸡胚尿囊膜实验评分记录
二、红细胞溶血实验
红细胞溶血实验(Red blood cell test，RBC)，是兔眼刺激实验(Draize test)的替代方法之一。红细胞被认为是研究生物膜效应最好的生物来源，操作性强且同质性好。RBC实验的基本原理是通过检测红细胞中血红蛋白的漏出量及蛋白质的变性程度来评价化学品对眼组织的刺激性。国际上也广泛地将RBC实验用于化妆品产品及原料等化学品的眼刺激性研究。
本实验的具体步骤如下：
1.RBC的前处理
(1)血液的获取和运输。屠宰场取新鲜兔血盛装于聚乙烯塑料容器中，按1：9加入抗凝剂柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21-22℃。30分钟内运于实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1小时。
(2)RBC的分离。1)分装稀释：收集新鲜血液(已用柠檬酸抗凝剂处理)用PBS溶液稀释(血液：PBS＝4：10体积比)。2)离心去杂：在室温下，用1500×g离心上述稀释液10min，离心后的上清液和淡黄色的白细胞层小心地吸掉，然后添加PBS重复上述洗涤离心步骤2-3次(第2次离心时打开酶标仪预热15min)。3)RBC悬液配制：最后一次离心后，将沉淀的细胞用PBS稀释至浓度约为2％红细胞悬液(约2mL沉淀+98mL PBS)，轻轻摇晃均匀。4)RBC浓度校准：取0.5mL上述细胞悬液于10mL EP管中，加入蒸馏水稀释至5mL，混匀反应1分钟，用酶标仪在541nm处测量(PBS为空白对照，用红细胞悬液调吸光度)，理想的吸光值应为0.5(±5％)。将处理好的RBC悬液密封于4℃储存。
2.溶血曲线的测定
(1)将实施例1最佳制备条件制得的扣囊复膜酵母胞外蛋白加PBS稀释而成浓度为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的样品溶液，然后将各浓度梯度样品溶液与RBC悬液按3：1的比例添加(750μl样品+250μl RBC)，混匀。(2)将受试物RBC混合液在室温下摇床孵育60min。(3)将各EP管置于离心机中，10000rpm/min速度离心1分钟，终止孵育。(4)取上清液测量其在540nm处的吸光度值。每个浓度做三个平行，结果取平均值。(5)同时测定对照组：阴性对照(零溶血)：750μl PBS+250μl RBC，设阴性对照的溶血率为0％；阳性对照：750μl 0.1％SDS水+250μl RBC；完全溶血对照：750μl水+250μl RBC，设完全溶血对照的溶血率为100％；空白对照：750μl样品+250μl PBS；样品组：750μl样品+250μl RBC。
3.数据处理
将各组在560nm波长下测得的吸光度OD值与浓度梯度曲线，取线性区作回归线，并将560nm下阴性对照与阳性对照OD值的差值带入回归线方程，得到H50(以在测试体系中的浓度表示)。
计算公式如下：
溶血曲线和溶血照片见图19和图20，由图19和图20可以得知实施例2.1制得的扣囊复膜酵母胞外蛋白溶血率低。
通过上述实施例2.1～2.4的实验结果证明，扣囊复膜酵母胞外蛋白具有较强的抗氧化能力和保护细胞免受氧化应激损伤和衰老的作用，制备条件温和、专属性高并且安全性高。
2.6扣囊复膜酵母胞外蛋白应用于化妆品的稳定性
1、扣囊复膜酵母胞外蛋白应用于膏霜化妆品的基础配方参见表10。
表10配方
配制方法：(1)在50ml烧杯中依次称取A相原料(g)；(2)称重250ml烧杯中，分别称取丁二醇、甘油、黄原胶和EDTA二钠，用玻璃棒手搅分散均匀后加入去离子水(根据配方计算用量)；(3)分别用玻璃棒手搅加热A、B相原料，升温至80-85℃后，B相搅拌5-10分钟，转速50-100转/分钟，将A相料液加入B相烧杯中进行均质，均质速度大约在3500r/min左右，均质5-8min(注意：两相均在高温下混合后均质，避免油相析出)；(4)以转速35-40转/分钟搅拌降温至45℃，加入扣囊覆膜酵母胞外蛋白、香精和甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(MTI)，搅拌降温；(5)搅拌降至室温后称量，装入已经灭菌的样品瓶、贴标签。
2、配方稳定性评价
将本实施例制得的化妆品装于离心管中，于3000r/min离心30min，观察样品乳化体系的稳定行；将本实施例制得的化妆品装于离心管中，于4℃保存5天，观察样品乳化体系的稳定行；将本实施例制得的化妆品装于离心管中，于60℃保存5天，观察样品乳化体系的稳定行；将本实施例制得的化妆品装于离心管中，于阳光照射的条件下保存5天，观察样品乳化体系的稳定行。结果如表11和图21所示，可见样品稳定性较强。
表11稳定性评价
3、安全性评价
人体斑贴试验(以下简称“斑试”)主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。对实施例2.6中最佳条件制得的化妆品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
实验方法如下：1)空白对照：空白滤纸对照。2)阴性对照：去离子水。3)受试者：共30人，男女不限，年龄20至28岁，符合受试者志愿入选标准。4)斑试方法：选用合格的斑试器材，以封闭性斑贴试验方法，将受试物0.020g-0.025g(面霜)置于斑试器内，外用低致敏胶带贴敷于受试者背部，24小时后去除受试物，于去除后0.5(待压痕消失后),24,48小时观察皮肤反应，按表12所示《化妆品卫生规范》(2015年)皮肤反应分级标准记录其结果。
表12皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
人体皮肤斑贴试验结果如表13显示，扣囊复膜酵母胞外蛋白(化妆品)在30人中未出现皮肤不良反应，根据《化妆品安全技术规范》(2015年)中规定，30例受试者中出现1级皮肤不良反应的多于5例或2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何一例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有明显不良反应。通过实验结果可看出本实施例制得的化妆品未引起人体不良反应，具有较好的安全性和耐受性。
表13人体斑贴实验结果汇总
4、感官评价
感官评价方法测试依据于《化妆品安全技术规范》(2015)，受试者的选择完全符合赫尔辛基宣言，志愿者的选择遵循人体测试的医学和伦理学标准，所有志愿者的测试都必须出于志愿者本人自愿，并在测试前签署知情同意书。对实施例2.6中制得的化妆品进行受试。
实验方法：1)样品使用方法：早/晚间洗净面部后取适量本品均匀涂抹于面部。2)评价人数：30人(有效数据30人)。3)随访时间点：隔一天使用一次，洗净面部后取适量本品均匀涂抹于面部，分别在1周、2周、3周、4周随访。4)随访评价形式：问卷调查。其中，调查问卷1、2、3、4周都进行打分。5)不良反应：无不良反应。
收集受试者在使用1周～4周的感官评价，并对结果进行分析，统计受试者人数，结果见图22。将问卷整体划分为6个维度，将不同程度改善的人群和明显改善的人群进行计数分析。结果发现使用样品1～4周后，除了“改善敏感”和“紧致肌肤”两个维度外，样品在整体改善、舒缓、补水滋养、修复屏障方面具有持续性的提升。
最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 扣囊复膜酵母菌株 SF-1、用该菌株制备的胞外蛋白及制备方法
<130> PD220245CN0094
<150> 2021114216529
<151> 2021-11-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 416
<212> RNA
<213> Saccharomycopsis fibuligera
<400> 1
cccgagggga accgcggaag gacaaagaga gaccgcgcaa cgcgcggaaa aaccaacaca 60
ggggcgaagg aggggcacga aaggagaaga gagcaaacac agcaaaccag accaagagaa 120
agaaaacaac agcgaacaaa caaaagaaaa ccagcaacgg accggccgca cgagaagaac 180
gcagcgaagc gaaagaagga agcagacgga acacgaacga acgcaagcgc caagacaaga 240
gcagccggag cgcacccaaa ccgggagaga aggggagccg caacccgaaa gacggcaaga 300
gagccaaagc aaggaaaaag gcaccaacaa aaacccgcga aggacaccgg acaaggccaa 360
acgcaaagac ccaaacagga aggaacccgc gaacaagcaa caaaagcgga ggaagc 416

Claims (13)

1.一种扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）菌株SF-1，其保藏编号为CGMCCNo.22671。
2.一种扣囊复膜酵母胞外蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）菌株SF-1经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液接种至液体发酵培养基进行发酵培养处理得到发酵液；
对所述发酵液进行分离处理得到上清液，对所述上清液进行沉淀处理即得所述胞外蛋白。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述种子液的OD值为0.5-1.0，所述种子液和所述液体发酵培养基的体积之比为2%-5%。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，上述胞外蛋白的制备方法中，所述发酵培养处理的温度为25-35℃，时间为24-48h。
5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养处理在摇床中进行，摇床中转速为150 r/min-180r/min。
6.如权利要求2-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述分离处理采用离心方法。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述分离处理的离心转速为4500r/min-5500r/min，离心时间为10min-20min。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀处理采用醇沉法或硫酸铵法。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵法包括：将所述上清液置于冰水浴中，在磁力搅拌器的搅拌下加入硫酸铵至溶液饱和，搅拌10～30min后于离心机以10000 r/min离心10min收集沉淀。
10. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉法包括：往所述上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，于4℃下醇沉24h，4900 r/min离心收集沉淀。
11.一种由权利要求2-10中任一项所述制备方法制得的胞外蛋白。
12.一种化妆品，其特征在于，含有权利要求11所述胞外蛋白。
13.根据权利要求12所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品成分中所述胞外蛋白的质量百分含量为0.1%~3.0%。
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