CN114920728B - 一种甲异靛衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲异靛衍生物及其制备方法与应用，属于药物化学技术领域；本发明提供了一种甲异靛衍生物(甲异靛PROTAC分子)，以其为活性成分的药物组合物，以及在制备ATM降解剂中的应用，还提供了甲异靛衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，该衍生物通过降解ATM，抑制DNA双链损伤修复，将细胞周期阻滞在G0/G1期，从而诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，尤其是涉及一种甲异靛衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
DNA损伤修复(DNA Damage Repair；DDR)在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。例如DNA损伤修复基因的突变是导致多种遗传性肿瘤发生的关键致病因素。在多种肿瘤发生的早期阶段也发现了DNA损伤修复蛋白的异常激活，这种异常激活一定程度上限制了早期阶段肿瘤的发展。因此，很多恶性肿瘤表现出DNA损伤修复蛋白(如p53基因编码的蛋白和ATM等)的功能缺失或失调，而这会导致基因组不稳定，从而进一步加速肿瘤的发展。此外，放疗、化疗会诱导DNA损伤修复，因此DDR也与上述治疗的临床疗效密切相关。肿瘤细胞可通过激活DDR，以抵抗放疗、化疗引起的基因毒效应。细胞一方面因为基因突变导致肿瘤的发生发展，但同时因为肿瘤细胞的基因不稳定性，比如卵巢癌，前列腺癌，乳腺癌等都具有强烈的基因不稳定性，此时靶向DNA损伤修复途径能够加重肿瘤细胞的DNA损伤压力，导致细胞在巨大压力下会诱导凋亡。同时由于正常细胞拥有正常完善的DNA修复系统，所以对正常细胞影响较小。因此，有效调控DNA损伤修复途径是极具前景的肿瘤治疗途径。
共济失调毛细血管扩张突变(Ataxia Telangiectasia Mutated，ATM)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白。ATM是参与细胞对DNA双链断裂(DNA double-strand break，DSB)的反应的中心激酶之一，主要是在同源重组(Homologous Recombination，HR)中发挥重要作用。在非活性状态下，ATM形成同源二聚体或寡聚体；在激活状态下，ATM丝氨酸1981的快速自磷酸化，解离成活性单体。ATM向DNA DSB位点的募集是通过MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物介导的。在其募集到DNA DSB位点后，ATM立即促进丝氨酸139上的组蛋白变体H2AX(称为γH2AX)的磷酸化，从而启动DNA损伤修复机制。而肿瘤细胞为了维持生存，通过下调ATM的表达，避免ATM活化的影响。乳腺癌、口腔癌、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中均发现ATM表达异常，且以上调为主。此外，肿瘤细胞可上调P38、HMGA(High mobility group A，高迁移率蛋白A)水平，以促进ATM的表达，产生耐药。由于肿瘤细胞中ATM高表达，导致肿瘤细胞对化疗不敏感；ATM还可通过活化AKT(蛋白激酶B)，促进肿瘤细胞存活。另由于ATM的研究定位更倾向于合成致死，故往往与其他药物联合使用。因此，ATM是肿瘤药物发现的重要靶标之一。目前，有3个ATM抑制剂进入临床阶段，分别是AZD-1390(阿斯利康)、M4076(默克)和XRD-0394(X Rad Therapeutics)。
靛玉红(CAS号：479-41-4)，是一种天然的双吲哚类生物碱，不仅存在于爵床科植物青黛中，还广泛存在于马蓝，菘蓝等植物的叶片和某些腹足纲软体动物中间，1997年首次发现靛玉红能够治疗慢性粒细胞白血病，但是66.7％的患者存在一定的胃肠道副反应，甲异靛是传统中药青黛活性成分靛玉红的衍生物，对多种白血病细胞系表现出较好的体内外抑制活性。甲异靛曾用于CML(chronic myelocytic leukemia，慢性粒细胞白血病)的治疗，同时对APL(acute promyelocytic leukemia，急性早幼粒细胞白血病)和AML均有一定的疗效，然而其结合靶点和具体作用机制尚不明确。目前，关于机制研究主要集中在诱导肿瘤细胞的凋亡以及抗炎活性上；并未研究其ATM抑制活性。
综上，本申请开发了一种甲异靛衍生物，该衍生物可用于制备ATM抑制剂。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种甲异靛衍生物，该衍生物可用于制备ATM降解剂。
本发明还提供了上述甲异靛衍生物的制备方法。
本发明还提供了一种ATM降解剂。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物。
本发明还提供了一种治疗白血病的药物。
本发明还提供了一种治疗白血病的药盒。
具体如下：本发明第一方面提供了一种甲异靛衍生物，结构式如下式Ⅰ或Ⅱ所示：
式Ⅰ和Ⅱ中R1均独立选自H、卤素原子、烷基、芳基、烷氧基中的一种；
式Ⅰ中R2、R3均独立选自H或组合为氧；
式Ⅰ和Ⅱ中R4均选自H、烷基、羟烷基、胺烷基、羧烷基中的一种；
式Ⅰ和Ⅱ中X均独立选自亚甲基、1,2-亚乙基、氧原子、亚氨基和硫原子中的一种；
式Ⅰ和Ⅱ中m的取值范围为1～5；
式Ⅰ和Ⅱ中n的取值范围为0～4。
根据本发明甲异靛衍生物技术方案中的一种技术方案，具备如下有益效果：
本发明的甲异靛衍生物为甲异靛PROTAC分子；相比于相关技术中小分子抑制剂或抗体药物通过占据靶蛋白的活性中心，依赖于对靶蛋白的高亲和力发挥作用，其优势体现在：
(1)可避免因抑制靶蛋白时产生的代偿性蛋白表达升高或基因突变，从而有效解决耐药性问题；
(2)药物用量小，理论上催化剂量即可，从而降低了脱靶效应的产生，减少毒副作用；
(3)PROTAC技术可以靶向任何蛋白，极大的拓展了靶标范围，而且不依赖于配体高亲和力，可通过靶蛋白表面的任何结合位点介导，而不仅限于单个活性位点，更容易开发出简单有效、选择性高的配体；
(4)PROTACTs可清除整个蛋白，包括功能区和非功能区，清除蛋白堆积，避免蛋白-药物复合物引起的副作用。
PROTAC技术利用细胞自身的泛素-蛋白酶体途径特异性降解靶蛋白，是一种全新的“事件驱动”的作用模式，同时克服了siRNA“敲低”不完全/脱靶效应频发、CRISPR/cas9技术不可逆“敲除”的缺陷，被认为是靶向蛋白的“化学敲低”技术。
R2、R3组合为氧的含义为：R2、R3与所连接C原子组合形成碳氧双键；如下式所示：下式右侧即为组合为氧的情况。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基为C1-10的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述芳基为C1-10的芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述芳基为苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基为C1-10的烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述羟烷基为C1-10的羟烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述羟烷基为羟甲基、羟乙基、羟丙基和羟丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述胺烷基为C1-10的胺烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述胺烷基为胺甲基、胺乙基、胺丙基、胺丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述羧烷基为C1-10的羧烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述羧烷基为羧甲基、羧乙基、羧丙基、羧丁基中的至少一种。
通过选用上述取代基，对ATM能起到更好的抑制效果。
根据本发明的一些实施方式，式Ⅰ和Ⅱ中m的取值范围为1～3。
根据本发明的一些实施方式，式Ⅰ和Ⅱ中n的取值范围为1～4。
根据本发明的一些实施方式，所述甲异靛衍生物为下式化合物6a～6f、化合物9a～9e中的一种：
上述化合物能够显著降低蛋白激酶ATM水平。
本发明第二方面提供了上述甲异靛衍生物的方法，包括以下步骤：
将式Ⅲ所示的化合物、偶氮化合物、铜催化剂、还原剂、碱和溶剂混合后反应；
所述偶氮化合物的结构式如式Ⅳ或式Ⅴ所示；
式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中R1均独立选自H、卤素原子、烷基、芳基、烷氧基中的一种；
式Ⅰ、Ⅳ和式Ⅴ中R2、R3均独立选自H或组合为氧；
式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中R4均选自H、烷基、羟烷基、胺烷基、羧烷基中的一种；
式Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ或Ⅴ中X独立选自亚甲基、1,2-亚乙基、氧原子、亚氨基和硫原子中的一种；
式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中m的取值范围为1～5；
式Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ或Ⅴ中n的取值范围为0～4。
根据本发明制备方法技术方案中的一种技术方案，至少具备如下有益效果：
本发明采用一步法即制得了上述甲异靛衍生物，制备工艺简单。
根据本发明的一些实施方式，如Ⅲ所示的化合物起到提供靶蛋白配体的作用。
根据本发明的一些实施方式，所述铜催化剂包括硫酸铜或氯化铜中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述还原剂为维生素C。
根据本发明的一些实施方式，所述碱为碳酸盐。
根据本发明的一些实施方式，所述碳酸盐为碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述溶剂由DMF和水组成。
根据本发明的一些实施方式，所述DMF和水的体积比为3～5:1。
根据本发明的一些实施方式，式Ⅲ所示的化合物和所述偶氮化合物摩尔比为1:0.8～1.2。
根据本发明的一些实施方式，所述偶氮化合物和所述铜催化剂的摩尔比为1:0.1～0.5。
根据本发明的一些实施方式，所述偶氮化合物和所述碱的摩尔比为1:0.4～0.6。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基为C1-10的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述芳基为C1-10的芳基。
根据本发明的一些实施方式，所述芳基为苯基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基为C1-10的烷氧基。
根据本发明的一些实施方式，所述烷氧基为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述羟烷基为C1-10的羟烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述羟烷基为羟甲基、羟乙基、羟丙基和羟丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述胺烷基为C1-10的胺烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述胺烷基为胺甲基、胺乙基、胺丙基、胺丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述羧烷基为C1-10的羧烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述羧烷基为羧甲基、羧乙基、羧丙基、羧丁基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述反应的温度为20℃～30℃。
根据本发明的一些实施方式，所述反应的时间为2h～4h。
本发明第三方面提供了一种ATM降解剂，活性成分为上述的甲异靛衍生物或其药理学上容许的盐。
本发明中甲异靛衍生物及其药理学上容许的盐通过对ATM进行降解，使ATM蛋白水平下降。
根据本发明的一些实施方式，所述ATM降解剂中所述甲异靛衍生物的质量分数为0.1％～99％。
根据本发明的一些实施方式，所述ATM降解剂中所述甲异靛衍生物的质量分数为0.5％～90％。
本发明第四方面提供了一种抗肿瘤药物，活性成分为上述的甲异靛衍生物或其药理学上容许的盐。
本发明中抗肿瘤药物通过降解ATM，抑制DNA双链损伤修复，将细胞周期阻滞在G0/G1期，从而诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。
根据本发明的一些实施方式，所述抗肿瘤药物中所述甲异靛衍生物的质量分数为0.1％～99％。
根据本发明的一些实施方式，所述抗肿瘤药物中所述甲异靛衍生物的质量分数为0.5％～90％。
本发明第五方面提供了一种治疗白血病的药物，活性成分为上述的甲异靛衍生物或其药理学上容许的盐。
本发明中衍生物及其药理学上容许的盐通过降解ATM，从而发挥抗血液肿瘤细胞增殖的作用。因此本发明中的甲异靛衍生物(甲异靛PROTACs)及其药理学上容许的盐具有治疗白血病的潜力。
根据本发明的一些实施方式，所述白血病为慢性髓细胞白血病(CML)。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的制备原料还包括药用载体。
根据本发明的一些实施方式，所述药用载体为药学领域常规的药物载体。
根据本发明的一些实施方式，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述赋形剂包括水。
根据本发明的一些实施方式，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述黏合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述湿润剂包括甘油。
根据本发明的一些实施方式，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述吸收促进剂包括季铵化合物。
根据本发明的一些实施方式，所述表面活性剂包括十六烷醇。
根据本发明的一些实施方式，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，本发明所述药理学上容许的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属和碱性氨基酸形成的盐。
根据本发明的一些实施方式，所述无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸和单宁酸中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱金属包括锂、钠和钾中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱土金属包括钙和镁中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为本领域常规的各种剂型，优选地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更优选地为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、干浸膏剂、注射剂或输注剂。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗白血病的药物通过抑制DNA双链损伤修复，将细胞周期阻滞在G0/G1期，从而发挥抗白血病作用。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗白血病的药物中所述甲异靛衍生物的质量分数为0.1％～99％。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗白血病的药物中所述甲异靛衍生物的质量分数为0.5％～90％。
本发明甲异靛衍生物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
本发明甲异靛衍生物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01mg/kg～10mg/kg体重；优选0.1mg/kg～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。
本发明还提供了一种治疗白血病的药盒，活性成分包括上述的ATM抑制剂、上述的抗肿瘤药物、上述治疗白血病的药物中的至少一种。
本发明中“约”代表±2％；例如：约100；代表的含义为100±2，即98～102。
本文所述的术语“给药剂量”为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。可以随被治疗的具体疾病以及其它因素而定，其它因素包括年龄、体重、健康状况、症状的严重程度、给药途径、治疗的频率和在治疗期间是否伴随其它的药物。
本文所述的术语“治疗”是指减轻白血病及其并发症的程度，或者治愈白血病及其并发症使之正常化，或者减缓白血病及其并发症的进程。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为DMSO与不同浓度的化合物9b作用下K562R的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图2为DMSO与不同浓度的化合物9b作用下K562R的ATM相对表达水平。
图3为不同时间下化合物9b作用下K562R的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图4为不同时间下化合物9b作用下K562R的ATM相对表达水平。
图5为DMSO与不同浓度的化合物6f作用下K562R的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图6为DMSO与不同浓度的化合物6f作用下K562R的ATM相对表达水平。
图7为不同时间下化合物6f作用下K562R的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图8为不同时间下化合物6f作用下K562R的ATM相对表达水平。
图9为DMSO与不同浓度的化合物9b作用下K562的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图10为DMSO与不同浓度的化合物9b作用下K562的ATM相对表达水平。
图11为不同时间下化合物9b作用下K562的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图12为不同时间下化合物9b作用下K562的ATM相对表达水平。
图13为DMSO与不同浓度的Meisoindigo作用下K562的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图14为DMSO与不同浓度的化合物9a、VHL ligand(叔丁基((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯甲基)氨基羰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧亚基丁烷-2-基)氨基甲酯；CAS：1448189-98-7)、Lenalidomide(来那度胺，CAS号：191732-72-6)作用下K562的ATM相对表达水平。
图15为不同浓度的Lenalidomide(甲异靛)和化合物6f共同作用下的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图16为不同浓度的Epoxomicin(环氧酶素，CAS号：134381-21-8)和化合物9b共同作用下的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图17为不同浓度的Epoxomicin(环氧酶素，CAS号：134381-21-8)和化合物9b共同作用下的ATM相对表达水平。
图18为DMSO与不同浓度的AZD1390(CAS号：2089288-03-7)，作用下K562的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图19为不同浓度的AZD1390和化合物9b共同作用下的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图20为不同浓度的AZD1390和化合物9b共同作用下的K562的ATM相对表达水平。
图21为不同浓度的Meisoindigo(甲异靛)和化合物9b共同作用下的ATM蛋白凝胶电泳结果图。
图22为不同浓度的Meisoindigo和化合物9b共同作用下的K562的ATM相对表达水平。
图23为不同化合物与ATM的亲和能力对比图。
图24为K562细胞中的ATM敲减结果图。
图25为K562细胞中的ATM敲减统计图。
图26为DMSO作用下K562细胞中细胞周期分布结果。
图27为5μM化合物9b作用下K562细胞中细胞周期分布结果。
图28为10μM化合物9b作用下K562细胞中细胞周期分布结果。
图29为10μM化合物9b作用8h下，K562细胞核染色及γH2AX免疫荧光染色图。
图30为10μM化合物9b作用8h下，K562细胞γH2AX免疫荧光统计图。
图31为不同时间化合物9b作用下K562的γ-H2AX凝胶电泳结果图。
图32为DMSO和不同浓度合物9b作用下化K562的caspase-8(韦半胱氨酸蛋白酶8)抗体、cleaved caspase-8抗体、bcl-2(B淋巴细胞瘤-2基因)凝胶电泳结果图。
附图标记：
+：代表加入；-：代表未加入；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
为了更好的理解本发明实质，下面将用本发明的实施例、试验例、制剂实施例来说明本发明的甲异靛衍生物的制备方法和药理作用结果，但本发明的技术方案并不局限于此，任何采用类似本发明技术方案，不需要本领域普通技术人员创造性劳动即可做出的方案均认为属于本发明技术方案范畴。
本发明中实施方式中化合物4a～4b由以下步骤制备得到：
1)向250mL圆底烧瓶中加入三乙二醇(CAS：112-27-6；4.5g，30mmol)和80mL无水DCM，然后于0℃下，向反应液中依次加入TEA(4.55g，45mmol)和MsCl(3.42g，30mmol)。将混合物在室温搅拌直至反应完成。反应完成后，过滤反应混合物，并将滤液真空浓缩得到粗产物。将粗产物溶于乙醇(100mL)，在70℃下快速搅拌并将NaN3(975mg，15mmol)分五次添加到反应混合物中，所得混合物加热搅拌过夜。然后真空除去溶剂，加入H2O稀释混合物，然后用DCM(100mL×3)萃取，合并的有机层用饱和NaCl洗涤，用无水Na2SO4干燥，并通过旋转蒸发仪浓缩得到粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(DCM洗脱)，得到白色油状化合物41a。
2)将步骤1)中的产物(5.25g，30mmol)在0℃下溶于无水DCM中，然后依次加入TEA(3.64g，36mmol)和MsCl(3.76g，33mmol)。将所得混合物在室温搅拌直至通过TLC未检测到起始原料，然后真空除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱纯化(PE：EA＝20：1)，得到2.28g白色油状化合物26a。两步总产率为30％。
化合物4b(将三乙二醇替换为二乙二醇)的合成步骤参照化合物4a(质量：1.76g；收率为28％)。
化合物4a：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.34–4.28(m,2H),3.74–3.70(m,2H),3.60(m,6H),3.37–3.27(m,2H),3.01(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ69.6,69.5,69.0,68.3,68.0,49.6,36.6.
化合物4b：1H NMR(500MHz,CDCl3):δ4.38(m,2H),3.81–3.77(m,2H),3.72–3.68(m,2H),3.42(t,J＝4.7Hz,2H),3.08(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ70.2,68.9,68.9,50.6,37.5.
化合物4c的合成步骤如下：
向250mL圆底烧瓶中加入1,6-二溴己烷(4.88g,20mmol)和40mL DMF，并将称量好的叠氮化钠(1.30g,20mmol)溶解于10ml纯净水中，在60℃搅拌下于1h内逐滴加入于反应液中。大约反应6h，TLC监测至原料反应完全，将反应液恢复至室温，向其中加入100mL水，并用无水乙醚(3×80mL)萃取。合并的有机相用饱和NaCl(3×80mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝80:1)，得到2.22g无色油状化合物4c，产率为54％。
化合物4c:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.43(t,J＝6.7Hz,2H),3.29(t,J＝6.9Hz,2H),1.88(p,J＝6.9Hz,2H),1.63(t,J＝7.4Hz,2H),1.51–1.39(m,4H).
化合物8a的合成步骤如下：
向250mL圆底烧瓶中加入6-溴己酸(3.90g，20mmol)和50mL DMF，再加入叠氮化钠(2.60g，40mmol)，置于85℃锅中反应。大约反应11h，TLC监测至原料反应完全，将反应液恢复至室温(25℃)，向其中加入150mL水，并用无水DCM(3×100mL)萃取。合并的有机相用饱和NaCl(3×100mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1)，得到2.22g白色油状化合物8a，产率为71％。
化合物8a：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.29(t,J＝6.9Hz,2H),2.38(td,J＝7.5,2.1Hz,2H),1.66(dq,J＝22.6,7.6Hz,4H),1.52–1.37(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.70,51.18,33.84,28.52,26.14,24.15.
化合物8b的合成步骤如下：
将250ml圆底烧瓶进行无水无氧处理，向反应瓶中加入叔丁醇钾(1.35g，12mmol)和80mL无水四氢呋喃，在0℃下加入41a(1.75g，10mmol)，搅拌30min后，缓慢加入溴乙酸叔丁酯(4.29g，22mmol)，然后置于室温(25℃)下反应，反应大约12h，TLC监测至原料反应完全。减压蒸馏除去四氢呋喃，然后向反应液中加入50ml水，并用稀盐酸将pH调制1-2，并用乙酸乙酯(3×40mL)萃取。合并的有机相用饱和NaCl(3×40mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得到466mg白色油状化合物8b，产率为20％。
化合物8b：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.73(s,1H),4.02(s,2H),3.63–3.51(m,10H),3.42–3.37(m,2H)
下面详细描述本发明的具体实施例。
实施例1
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，由以下步骤组成：
S1、称取靛红(CAS号为：91-56-5，化合物1，1.47g,10mmol)和Cs2CO3(480mg,12mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入DMF(30mL)，于0℃下逐滴滴加氯丙炔(CAS号：624-65-7；0.87mL,12mmol)；然后移至室温(约25℃)下搅拌，反应约6h后，TLC监测至原料反应完全。加入80mL水淬灭反应，然后加入CH2Cl2萃取三次(40mL×3)，再用饱和NaCl洗涤(40mL×3)并合并有机相，有机层再用无水Na2SO4干燥，减压浓缩除掉CH2Cl2，得到粗产品，粗产品无需纯化，直接用于下一步。
S2、向步骤S1制得的粗产品(1.61g，10mmol)中加入2-吲哚酮(1.31g，10mmol)和冰醋酸(30mL)，然后再加入两滴浓盐酸，回流搅拌12h后，有红色固体析出，过滤除去反应液。用EtOH洗涤红色固体，得到目标化合物2a，产率为33％。
S3、向50mL圆底烧瓶中加入化合物3(来那度胺，CAS号：191732-72-6；259mg，1mmol)和DMF(5mL)，再加入化合物4a(278mg，1.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，387mg，3mmol)，置于110℃锅中反应。约反应12h，TLC监测至原料反应完全，将反应液冷却至室温(约25℃)，向其中加入20mL水，并用EtOAc(乙酸乙酯)(10mL×3)萃取。合并的有机相用饱和NaCl(10mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(CH2Cl2：MeOH的体积比为20:1)，得到75mg白色固体化合物5a，产率为18％。
S4、向25mL圆底烧瓶中分别加入化合物2a(30.0mg,0.1mmol)、化合物5a(41.6mg,0.1mmol)、CuSO4-5H2O(5mg,0.02mmol)、无水Na2CO3(5.3mg,0.05mmol)和维生素C(8.8mg，0.05mmol)，最后加入DMF：H2O的体积比为4:1(5mL)，于室温(约25℃)下反应，约反应3h，TLC监测至原料反应完全，向反应液中加入20mL水，并用EtOAc(10mL×3)萃取。合并的有机相用饱和NaCl(10mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(CH2Cl2：MeOH的体积比为30：1)，得到52.3mg红色固体化合物6a，产率为73％。
化合物6a：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.24(s,1H),9.02(dd,J＝12.2,8.0Hz,2H),8.94(s,1H),7.74(s,1H),7.27–7.19(m,2H),7.19–7.12(m,2H),7.00(d,J＝7.8Hz,1H),6.97–6.86(m,2H),6.67(d,J＝7.7Hz,1H),6.61(d,J＝8.0Hz,1H),5.32(s,2H),5.13(dd,J＝13.4,5.4Hz,1H),5.09–4.98(m,2H),4.41(q,J＝4.3Hz,2H),4.13(d,J＝16.0Hz,2H),3.96(d,J＝16.1Hz,1H),3.75(h,J＝5.9Hz,2H),3.54–3.36(m,6H),3.18(d,J＝5.4Hz,2H),2.77–2.67(m,2H),2.27–1.97(m,3H).
实施例2
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例1的差异在于：
步骤S1中氯丙炔替换为5-氯-1-戊炔(CAS号：14267-92-6)。
步骤S2中制得化合物2b(产率为38％)。
步骤S4中化合物2a替换为化合物2b，制得化合物6b(产率为78％)。
化合物6b：红色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.11–9.04(m,2H),9.00(s,1H),8.63(s,1H),7.52(s,1H),7.35–7.18(m,5H),7.00(q,J＝8.0,7.5Hz,2H),6.78(dd,J＝7.8,3.6Hz,2H),6.69(d,J＝7.8Hz,1H),5.32(s,1H),5.20(dd,J＝13.2,5.1Hz,1H),4.47(h,J＝4.3Hz,2H),4.24(d,J＝16.0Hz,1H),4.08(d,J＝15.9Hz,1H),3.88–3.80(m,4H),3.64–3.54(m,6H),3.28(td,J＝5.1,2.5Hz,2H),2.80(q,J＝7.4,5.6Hz,4H),2.32(ddt,J＝17.8,12.4,5.7Hz,1H),2.12(q,J＝7.2Hz,3H).
实施例3
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例1的差异在于：
步骤S3中化合物4a替换为化合物4b，制得化合物5b(产率为10％)。
步骤S4中化合物5a替换为化合物5b，制得化合物6c(产率为60％)。
化合物6c：红色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.03(s,1H),10.94(s,1H),9.09(d,J＝8.0Hz,2H),8.10(s,1H),7.36(td,J＝7.7,4.6Hz,2H),7.26(d,J＝7.7Hz,1H),7.08(d,J＝7.8Hz,1H),7.03(d,J＝7.8Hz,1H),6.95(dd,J＝7.6,5.0Hz,2H),6.85(d,J＝7.7Hz,1H),6.73(d,J＝8.1Hz,1H),5.50(t,J＝5.7Hz,1H),5.13(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),5.07–4.99(m,2H),4.50(dd,J＝6.8,3.9Hz,2H),4.25(d,J＝17.2Hz,1H),4.13(d,J＝17.1Hz,1H),3.80(t,J＝5.1Hz,2H),3.55(t,J＝5.7Hz,2H),3.22(q,J＝5.9Hz,2H),2.92(ddd,J＝17.9,13.5,5.4Hz,1H),2.66–2.56(m,1H),2.35(qd,J＝13.3,4.2Hz,1H),2.04(dp,J＝12.2,4.4Hz,1H).
实施例4
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例2的差异在于：
步骤S4中化合物5a替换为化合物5b(实施例3制得)；从而制得化合物6d(产率为61％)。
化合物6d：红色固体；1H NMR 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),10.92(s,1H),9.12–9.05(m,2H),7.83(s,1H),7.43–7.37(m,1H),7.34(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.25(t,J＝7.7Hz,1H),7.02(t,J＝7.8Hz,2H),6.99–6.92(m,2H),6.84(d,J＝7.7Hz,1H),6.75(d,J＝8.0Hz,1H),5.51(t,J＝5.7Hz,1H),5.13(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.48(t,J＝5.1Hz,2H),4.29–4.09(m,2H),3.81(q,J＝5.3,4.2Hz,4H),3.59(t,J＝5.6Hz,2H),3.27(q,J＝5.7Hz,2H),3.00–2.87(m,1H),2.65(q,J＝6.1,4.6Hz,3H),2.35(qd,J＝13.1,4.4Hz,1H),2.09–1.98(m,1H),1.98–1.88(m,2H).
实施例5
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例2的差异在于：
步骤S3中化合物4a替换为化合物4c，制得化合物5c(产率为11％)。
步骤S4中化合物5a替换为化合物5c，制得化合物6e(产率为56％)。
化合物6e：红色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),10.93(s,1H),9.09(dd,J＝12.6,8.2Hz,2H),7.87(s,1H),7.41(t,J＝7.6Hz,1H),7.35(t,J＝7.6Hz,1H),7.25(t,J＝7.7Hz,1H),7.07(d,J＝8.1Hz,2H),6.97(t,J＝7.8Hz,1H),6.90(d,J＝7.5Hz,1H),6.84–6.79(m,1H),6.70(d,J＝8.1Hz,1H),5.54(t,J＝5.5Hz,1H),5.11(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.27(q,J＝8.7,7.9Hz,2H),4.20(d,J＝17.1Hz,1H),4.10(d,J＝16.9Hz,1H),3.98(dq,J＝14.3,8.1,7.6Hz,2H),3.84(t,J＝7.0Hz,2H),3.07(q,J＝6.7Hz,2H),2.69(t,J＝7.7Hz,2H),2.29(dq,J＝14.5,7.7Hz,3H),1.98(tt,J＝14.9,6.7Hz,3H),1.53(h,J＝7.8,7.3Hz,6H).
实施例6
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例3的差异在于：
将步骤S2中2-吲哚酮替换为N-甲基吲哚酮(CAS号：61-70-1)，制得化合物2c(产率为23％)。
步骤S4中化合物2a替换为化合物2c，制得化合物6f(产率为65％)。
化合物6f：红色固体；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),9.09(d,J＝8.0Hz,2H),8.10(s,1H),7.44–7.33(m,2H),7.25(t,J＝7.7Hz,1H),7.09–6.92(m,5H),6.70(d,J＝8.0Hz,1H),5.48(t,J＝5.7Hz,1H),5.13(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),5.02–4.95(m,2H),4.49(t,J＝5.1Hz,2H),4.27–4.08(m,2H),3.79(t,J＝5.1Hz,2H),3.54(t,J＝5.8Hz,2H),3.20(q,J＝5.6Hz,2H),3.17(s,3H),2.93(ddd,J＝18.2,13.7,5.3Hz,1H),2.61(dt,J＝16.8,3.5Hz,1H),2.41–2.26(m,1H),2.09–1.99(m,1H).
实施例7
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，由以下步骤组成：
S1、向100mL圆底烧瓶中加入化合物8a(6-叠氮基己酸，CAS号：79598-53-1；157mg，1mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(CAS号为：148893-10-1，HATU，570mg，1.5mmol)和20mL DMF，室温(约25℃)搅拌20min后，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，774mg，6mmol)，继续搅拌5min后，将化合物7(叔丁基((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯甲基)氨基羰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧亚基丁烷-2-基)氨基甲酯；CAS：1448189-98-7)溶于5mL DMF中，缓慢滴加到反应瓶中。室温(约25℃)下大约反应3h，TLC监测至原料反应完全，加入40mL水终止反应，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，合并的有机相用饱和NaCl(40mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(CH2Cl2：MeOH的体积比为50：1)，得到148.2mg白色固体产物，产率为26％。
S2、向25mL圆底烧瓶中分别加入化合物2a(实施例1中步骤S2制得，30.0mg,0.1mmol)、步骤S1中的产物(57.0mg,0.1mmol)、CuSO4-5H2O(5mg,0.02mmol)、无水Na2CO3(5.3mg,0.05mmol)和维生素C(8.8mg,0.05mmol)，最后加入DMF:H2O的体积比为4:1(5mL)，于室温下反应，大约反应3h，TLC监测至原料反应完全，向反应液中加入20mL水，并用EtOAc(10mL×3)萃取。合并的有机相用饱和NaCl(10mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经快速柱色谱法纯化(CH2Cl2：MeOH＝20:1)，得到59.2mg红色固体化合物9a，产率为68％。
化合物9a：红色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.71(s,1H),8.97(dd,J＝13.6,8.0Hz,2H),8.64(s,1H),7.67(q,J＝11.1,8.5Hz,1H),7.54(s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),7.28(s,3H),7.22(t,J＝7.7Hz,1H),7.11(t,J＝7.6Hz,1H),6.97(d,J＝7.9Hz,1H),6.88(q,J＝7.4Hz,3H),6.66(d,J＝7.7Hz,1H),4.98(s,2H),4.72(t,J＝8.1Hz,1H),4.61–4.50(m,3H),4.34(dd,J＝15.2,5.2Hz,1H),4.20–4.02(m,3H),3.77–3.62(m,1H),2.42(s,3H),2.37–2.27(m,1H),2.25–2.03(m,3H),1.69(p,J＝7.2Hz,2H),1.48(q,J＝7.5Hz,2H),1.14(q,J＝7.7Hz,2H),0.97(s,9H).
实施例8
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例7的差异在于：
将步骤S2中化合物2a替换为化合物2b(实施例2中步骤S2制得)，制得化合物9b(产率为55％)。
化合物9b：红色固体；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.77(s,1H),9.04(dd,J＝21.6,8.0Hz,2H),8.64(s,1H),7.61(d,J＝6.3Hz,1H),7.38–7.25(m,6H),7.23–7.14(m,2H),6.96(ddd,J＝15.0,11.8,6.7Hz,3H),6.73(dd,J＝25.2,7.8Hz,2H),4.75(t,J＝8.2Hz,1H),4.62–4.53(m,3H),4.36(dd,J＝15.7,5.1Hz,1H),4.16–4.06(m,3H),3.90(dt,J＝14.4,7.1Hz,1H),3.81–3.66(m,2H),2.78(t,J＝7.3Hz,2H),2.43(d,J＝2.2Hz,3H),2.18(dddd,J＝31.0,25.5,14.2,7.7Hz,6H),1.69(h,J＝8.1Hz,2H),1.56(q,J＝7.2Hz,2H),1.21(p,J＝7.7Hz,2H),0.99(s,9H).
实施例9
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例7的差异在于：
将步骤S1中化合物8a替换为化合物8b，最终在步骤S2中制得化合物9c(产率为67％)。
化合物9c：红色固体；1H NMR 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.23(s,1H),9.05(d,J＝8.1Hz,1H),8.97(d,J＝8.0Hz,1H),8.68(d,J＝13.9Hz,1H),7.71(s,1H),7.62(t,J＝5.8Hz,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,3H),7.27(d,J＝5.4Hz,5H),7.06(d,J＝7.9Hz,1H),7.00(q,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝7.7Hz,1H),5.14(d,J＝15.8Hz,1H),5.05(d,J＝15.7Hz,1H),4.69(t,J＝8.2Hz,1H),4.63–4.52(m,4H),4.47(d,J＝5.2Hz,2H),4.36–4.30(m,1H),4.12(d,J＝11.3Hz,1H),3.85(d,J＝15.6Hz,1H),3.74(d,J＝6.3Hz,4H),3.50(s,1H),3.42(d,J＝5.2Hz,2H),2.46(s,3H),2.22(dd,J＝13.7,8.2Hz,1H),1.30–1.22(m,5H),0.99(d,J＝10.7Hz,9H).
实施例10
本实施例为一种甲异靛衍生物的制备方法，与实施例9的差异在于：
将步骤S2中化合物2a替换为化合物2b(实施例2中步骤S2制得)，制得化合物9d(产率为73％)。
化合物9d：红色固体；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.08(d,J＝8.2Hz,1H),9.01(d,J＝8.1Hz,1H),8.70(d,J＝20.9Hz,2H),7.60(d,J＝6.1Hz,1H),7.53(s,1H),7.37–7.31(m,5H),7.28(s,3H),7.02(td,J＝8.0,7.6,3.8Hz,2H),6.81(t,J＝7.1Hz,2H),4.71(t,J＝8.0Hz,1H),4.63–4.55(m,3H),4.46(d,J＝5.7Hz,2H),4.34(dd,J＝14.2,4.9Hz,1H),4.09(d,J＝11.3Hz,1H),3.90(q,J＝6.5Hz,2H),3.84(d,J＝7.3Hz,1H),3.79(d,J＝5.7Hz,2H),3.67(dd,J＝21.0,10.9Hz,2H),3.58–3.48(m,9H),2.82–2.76(m,2H),2.49(s,3H),2.25–2.20(m,1H),2.14(t,J＝7.2Hz,2H),0.99(d,J＝2.1Hz,9H).
以下通过试验例来进一步阐明本发明甲异靛衍生物(甲异靛PROTAC分子)的药理作用：
本发明的试验例1为：CCK8法测定PROTACs化合物。
1、Western blot方法：
采用Western blot方法进行，具体实验方法如下：
提蛋白：将六孔板中的细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心5min，去除培养液，加入100μL的裂解液(SDS:8g+40ml甘油定容至100ml，稀释后使用)和10μL的蛋白酶抑制剂(Epoxomicin)和磷酸酶抑制剂(型号：K1015，APE-BIO(USA))，放置冰上裂解10min，100℃加热蛋白10min。
测定蛋白质的浓度：取96孔板，设置标准蛋白孔和待测孔。标准蛋白孔加10μL的标准蛋白；待测孔加入9μL ddH2O和1μL待测组蛋白。每孔加入BSA溶液100μL，放入烘箱30min。取出，测定吸光度，计算出蛋白质浓度和蛋白质上样量。将待测组加入蛋白上样缓冲液，100℃煮蛋白10min。
上样：根据计算的加样量，将蛋白加入预先配置的凝胶的孔道中，电泳至条带分开。
转膜：取PVDF膜，用甲醇活化后覆盖至凝胶上，转膜。
牛奶封闭：将膜取出，用牛奶封闭2h。
剪膜：根据需求剪切需要的条带。
一抗孵育：配制一抗溶液，将待测蛋白条带放入离心管中4℃摇床过夜。用PBST(磷酸缓冲液)将条带洗3次。
二抗孵育：配制二抗溶液，用PBST将条带洗3次后可显影。
2、非标记定量蛋白质组学：
样品处理：向样品中加入裂解溶液(8M Urea/100mM Tris-Cl)，水浴超声后加入二硫苏糖醇(DTT)37℃孵育1h；随后，加入碘乙酰胺(IAA)，于室温(约25℃、暗处进行烷基化反应以封闭巯基。采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白质定量后取50μg样本用于SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带。向还原、烷基化后的样品中加入100mM Tris-HCl溶液，将Urea浓度稀释至2M以下，按照酶与蛋白1:50的质量比加入胰蛋白酶，37℃孵育振荡过夜进行酶切。第二天加入TFA终止酶切，取上清进行Sep-Pak C18脱盐。抽干后-20℃冻存待用。
质谱检测：质谱数据使用Q Exactive Plus质谱仪串联EASY-nLC 1200液相的液质联用系统进行采集。肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至分析柱(50μm*15cm,C18,2μm,)进行分离。利用两个流动相(流动相A：质量分数为0.1％formicacid(甲酸)和流动相B：质量分数为0.1％formic acid，体积分数为80％CAN(乙腈))建立分析梯度。液相的流速设置为300nL/分钟。质谱以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(R＝70K,AGC＝3e6,max IT＝20ms,scan range＝350m/z～1800m/z)，以及随后的15个MS/MS扫描(R＝17.5K,AGC＝2e5,max IT＝50ms)。HCD碰撞能量设置为28。四级杆的筛选窗口设置为1.6Da。离子重复采集的动态排除时间设置为35s。本蛋白质组学实验委托武汉谱度众合公司进行。
3、免疫荧光检测DNA双链断裂情况：
免疫荧光：将悬浮细胞离心，后稀释至每孔1万个细胞溶于20μL均匀平铺在提前准备好的爬片上，后用4％多聚甲醛室温固定2小时，后用PBS轻轻清洗三次爬片上的多聚甲醛，随后用0.05％TritionX-100室温(约25℃)通透20分钟，PBS清洗三次，质量分数为5％BSA封闭2小时后，4度一抗γ-H2AX湿盒过夜(12h)，第二天敷带有荧光标签的二抗1小时，PBS清洗三次后进行荧光拍照。
本发明试验例1的测试结果见表1～3。
表1甲异靛PROTACs对K562和K562R细胞的增殖抑制活性
表2化合物9b处理差异蛋白统计表
表3 SPR分析3种化合物与ATM的亲和力
从表1～3中活性实验结果，可以看出：
表1的结果表明，对于亲本K562细胞(人类髓性白血病人工培养的细胞)而言，VHL型PROTAC分子化合物9f具有较甲异靛更优的细胞毒活性(IC50＝9.52μM)，但弱于伊马替尼；对于伊马替尼耐药的K562细胞而言，CRBN型PROTAC化合物6d～6f以及化合物9b均具有优于甲异靛的活性，其中化合物6d和化合物9b较伊马替尼活性更好，IC50分别为8.25μM和5.6μM。
表2的蛋白质组学结果表明，相比于DMSO组，化合物9b对蛋白激酶ATM水平下调幅度达到30余倍。
化合物9b和化合物6f均可浓度依赖和时间依赖的降低伊马替尼耐药的K562细胞中的ATM蛋白水平(图1～8)。
而对照试验表明(图9～17)，母体化合物甲异靛、CRBN配体来那度胺、VHL的ligand本身以及阴性对照化合物9a对ATM蛋白水平没有显著影响。同时加入化合物9b和甲异靛后，ATM的降解量变少，当加入甲异靛的浓度为10μM时，化合物9b对ATM的降解程度减少了62％，并随着甲异靛浓度的升高，化合物9b对ATM的降解效率越低，当加入相同量的甲异靛后，ATM表达量和对照组一致。按照化合物6f:来那度胺(1:1、1:2、1:3)的比例加药处理K562细胞8小时，可以观察到化合物6f对ATM表达有所减少，加入来那度胺后，化合物6f对ATM没有降解效果；当加入VHL配体20μM时，VHL配体明显竞争掉了化合物9b对ATM的降解作用，因此化合物9b以及化合物6f对ATM蛋白水平的降低，可被甲异靛(图21～22)和化合物VHL和来那度胺竞争取消(图13～14)；也可以被蛋白酶体抑制剂(Epoxomicin)去掉(图16～17)，在加入0.5倍剂量的蛋白酶抑制剂后可以恢复PROTAC导致的ATM表达下降，在10μM时恢复效果更为显著，几乎与对照组相持平，这表明，化合物9b确实通过甲异靛部分结合ATM，以及来那度胺结合VHL，并且通过蛋白酶体途径发挥降低ATM蛋白水平的作用。
SPR实验结果表明(图23和附表3)，对亲和力的判定，10-13至10-8之间为极强结合，10-8至10-5之间为强结合，如表3-3所示，9b、6f、甲异靛和ATM的Kd值分别为1.17nM、13mM和0.312nM，表明甲异靛、化合物9b均与ATM表现出很强的亲和力，6f对ATM具有弱亲和力。
图24为K562细胞中的ATM敲减结果图，图25为K562细胞中的ATM敲减统计图；从图24～25中得知：shATM处理48h可有效的敲减K562细胞的ATM蛋白水平。
按照浓度梯度加药9b处理K562细胞8小时，通过流式检测细胞周期变化水平，结果如图26～28，可以观察到，9b处理8小时后的K562细胞周期阻滞在了G0/G1期，相比于不加药组的G0/G1期占比39.2％，加药5μM的G0/G1期占比47.1％，加药5μM的G0/G1期占比62.8％，且呈浓度梯度趋势，化合物9b能够阻滞K562细胞停滞在G0/G1期，9b能够促进肿瘤细胞DNA双链断裂，增大肿瘤细胞DNA复制压力；同时我们发现9b可以使凋亡蛋白表达增加，抗凋亡蛋白表达降低，从而促进细胞的凋亡。
图29为在10μM化合物9b作用8h下，K562细胞核染色及γH2AX免疫荧光染色图；
图30为在10μM化合物9b作用8h下，K562细胞γH2AX免疫荧光统计图；从图中得知：与空白对照组(DMSO)相比，化合物9b(10μM)处理8小时，K562细胞核内DNA损伤标志物γH2AX水平显著上升。
图31为不同时间化合物9b作用下K562的γ-H2AX凝胶电泳结果图；从图中得知：化合物9b(10μM)时间依赖的升高K562细胞中γ-H2AX蛋白水平。
图32为DMSO和不同浓度合物9b作用下化K562的caspase-8(韦半胱氨酸蛋白酶8)抗体、cleaved caspase-8抗体、bcl-2(B淋巴细胞瘤-2基因)凝胶电泳结果图；从图中得知：与空白对照组(DMSO)相比，化合物9b(10μM)可浓度依赖性的升高K562细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-8水平，同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平。
制剂实施例1：
按实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
制剂实施例2：
按实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐,将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
制剂实施例3：
将实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
制剂实施例4：
将实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
制剂实施例5：
将实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
制剂实施例6：
将实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
制剂实施例7：
将实施例1～10的方法先制得甲异靛PROTAC分子，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
综上所述，本发明提供了一种甲异靛衍生物(甲异靛PROTAC分子)，以其为活性成分的药物组合物，以及在制备ATM抑制剂中的应用，还提供了甲异靛衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，该衍生物通过抑制DNA双链损伤修复，将细胞周期阻滞在G0/G1期，从而发挥抗肿瘤作用。
上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (9)
1.一种甲异靛衍生物，其特征在于：结构式如下式Ⅰ或Ⅱ所示：
；
式Ⅰ和Ⅱ中R1为H；
式Ⅰ中R2、R3均独立选自H；
式Ⅰ和Ⅱ中R4均独立选自H或甲基；
式Ⅰ和Ⅱ中X均独立选自1,2-亚乙基或氧原子；
式Ⅰ和Ⅱ中m的取值为1或3；
式Ⅰ和Ⅱ中n的取值范围为1、2或3。
2.根据权利要求1所述的甲异靛衍生物，其特征在于：所述甲异靛衍生物为下式化合物6a~6f、9a~9d中的一种：
；
。
3.一种制备如权利要求1或2所述的甲异靛衍生物的方法，其特征在于：包括以下步骤：将式Ⅲ所示的化合物、叠氮化合物、铜催化剂、还原剂、碱和溶剂混合后反应；
所述叠氮化合物的结构式如式Ⅳ或式Ⅴ所示；
；
。
4.一种ATM降解剂，其特征在于：活性成分为如权利要求1或2所述的甲异靛衍生物或其药理学上容许的盐。
5.如权利要求1或2所述的甲异靛衍生物或其药理学上容许的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求1或2所述的甲异靛衍生物或其药理学上容许的盐在制备治疗白血病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述白血病为慢性髓细胞白血病。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述治疗白血病的药物，制备原料还包括药用载体。
9.一种白血病治疗药盒，其特征在于：所述药盒中包括如权利要求4所述的ATM降解剂。
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