CN114917175A - 抗衰老的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗衰老的组合物，由下述成分组成：10％重量的珍珠发酵液；以及3％重量的精油，所述精油为当归精油与甘草精油1：1重量的混合物；其余为化妆品基质。本发明的组合物明显降低皮肤组织脂褐质含量，提高抗氧化能力，清除体内自由基，减轻脂质过氧化损伤，有延缓衰老的效果。

Description

抗衰老的组合物
技术领域
本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种由珍珠提取物和植物精油组成的组合物。
背景技术
抗衰老一直是化妆品领域的一个重要研究方向，衰老是大自然的规律，也是人类一直想要克服的难题。尤其在化妆品和保健品中，宣称抗衰老的产品深受消费者的欢迎和追捧。抗衰老机制大体可分为八大类：细胞外机制的调节、皮肤美白功能、改善角质层屏障功能、促细胞增殖、抵御细胞凋亡、抗炎作用以及抗氧化作用。八个机制相互作用，侧重点不同，目前在研究抗衰活性物的作用机制中都会选择其中的一种或者几种去证明其具备抗衰老作用。
珍珠具有美白、淡斑的功效，珍珠可直接磨粉制备化妆品，而珍珠中也含有抗衰老的成分。中国专利CN112569172A提供了一种珍珠制备品，其将珍珠磨粉，经弱酸处理后发酵，制得珍珠发酵液，冻干后获得珍珠制备品。该珍珠制备品能抑制炎症因子的表达，抑制活性氧、丙二醛的产生，同时促进谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的产出，有效修护衰老细胞，显示在抗衰老化妆品和保健品中的应用前景。
精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸汽蒸馏法、冷压榨法、脂吸法、二氧化碳超临界萃取等方法提炼出来的，具有高浓度芳香和挥发性的物质，由于是天然产物，且具有不良反应少、健康安全的优势，在医药、食品保健和化妆品行业被广泛应用。从中药当归、甘草中提取精油，促进了中医药资源的开发利用。精油的种类繁多，功效各样，使用和配伍方法也各不相同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗衰老的组合物，尤其是应用于化妆品的抗皮肤衰老的组合物。
为实现上述目的，本发明提供一种抗衰老的组合物，由下述成分组成：
10％重量的珍珠发酵液；以及
3％重量的精油，所述精油为当归精油与甘草精油1：1重量的混合物；
其余为化妆品基质；
其中，所述珍珠发酵液通过下述方法制得：
1)将珍珠粉碎，获得超微细珍珠粉；
2)将珍珠粉与水混合搅拌制成混合液；
3)将过量二氧化碳通入混合液底部；或添加10～30％重量的弱酸溶液加以溶解；
4)过滤后将获得的上清液中，接入1-10％重量的微生物扩培菌液，置于发酵罐中28-37℃，100-200rpm培养24-36小时；
5)将培养液灭活后，过滤膜获取无菌过滤液；
6)将过滤液与冻干保护剂混合，冻干，收获水分含量在2-5％重量的冻干粉；
所述当归精油为以当归(Angelica Sinensis)为原料，通过超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏提取得到的挥发油；在具体的一种实施方案中，可以通过下述方法制得：
将甘肃产的中药材当归按照10～20目进行粉碎，再用乙醇溶液提取、浓缩、真空干燥，制备当归浸泡物。浸提时采用乙醇，按照固液比1：3.5的比例浸提两次，第一次浸提3.5h，第二次浸提2.5h。用砂布袋装好已秤量好的药材粉，并装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器(浸在冰水浴中)，柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,预浸润10-15min,超临界CO2流体萃取。分离器I压力20-25Mpa、温度35-50℃，分离器II压力4.5～5.5MPa、温度45℃，二氧化碳流量35kg/h,萃取时间1.5-2h，所得的墨绿色当归精油膏状物。以当归膏状物为原料，用95.0％的乙醇，按当归膏状物和乙醇比例为1：9进行萃取。过滤除去部分蜡质，将滤液静置过夜。次日再过滤，将滤液在50℃、真空度-0.015MPa的条件下，用真空抽出乙醇，所得深棕色物为当归原精。采用分子蒸馏工艺对制得的当归原精进行精制，工艺条件：蒸馏温度115℃、真空度-0.015MPa、当归原精流量1.0ml/min、刮膜转速380r/min.冷却温度≤12℃，得当归精油。
所述甘草精油为以甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)为原料，通过超临界二氧化碳萃取提取得到的挥发油。在具体的一种实施方案中，可以通过下述方法制得：
将宁夏产的中药材甘草粉碎成过10～20目筛的粗粉，过一遍水，晒干，再粉碎75目待用。用砂布袋装好已秤量好的药材粗粉，装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器(浸在冰水浴中)，柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,预浸润10-15min,超临界CO2流体萃取。CO2流体流速1L/min，萃取温度30-35℃，萃取压力35-40MPa，分离温度50～60℃，分离压力4.5～5.5MPa，萃取时间2-3h，得带有甘草精油的膏状物。以甘草膏状物为原料，用95.0％的乙醇，按甘草膏状物和乙醇的比例为1：9进行萃取，过滤除去部分蜡质，将滤液静置过夜，次日再过滤，将滤液在50℃、真空度-0.015MPa的条件下，用真空抽出乙醇，得甘草精油。
本发明所述的组合物，其中步骤3)所述的弱酸溶液为选自乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸中的一种或多种；优选为乳酸、乙酸或柠檬酸；步骤4)所述的微生物为选自啤酒酵母、葡萄汁酵母或、鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的一种或多种，优选为啤酒酵母、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
本发明所述的组合物，优选的是，所述珍珠发酵液通过下述方法制得：
i)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
ii)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5-20的质量比混合在30-70℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50-100rpm速度下搅拌；
iii)同时将过量二氧化碳通入混合液底部0.5-1.5小时；或添加10～30％重量的弱酸溶液加以溶解；
iv)将过滤获得的上清液中，接入1-10％重量的微生物扩培菌液，置于发酵罐中28-37℃，100-200rpm培养24-36小时。
v)在85-100℃下搅拌20-50min的灭活后，通过0.22μ.的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
vi)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5～2(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-70-85℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12-20h，最终收获水分含量在2-5％重量的冻干粉；
vii)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行1-10℃内进行储存。
根据本发明的另一方面，提供一种化妆品，其含有本发明所述的组合物。优选的是，所述化妆品基质为乳膏基质，以适于涂抹的乳膏方式提供。
根据本发明的再一方面，提供本发明所述的组合物在制备抗衰老功效化妆品中的用途。优选地，所述的抗衰老功效为提高皮肤抗氧化能力、降低皮肤脂褐质含量、清除体内自由基和/或减轻脂质过氧化损伤。
本发明通过选择了一组具有消炎抗菌、美白抗衰作用的中药植物所萃取精油，进行体外总抗氧化能力检测实验。根据检测结果排序确定了总抗氧化能力数据最好的当归精油、甘草精油。进一步选择了一组临床应用上具有消炎抗菌、美白抗衰作用的中药植物所萃取精油，进行体外DPPH自由基清除实验。实验结果显示当归精油和甘草精油具有清除自由基作用，且呈剂量依赖型。
中药当归活血补血、主血虚诸证，甘草健脾益气、能调和诸药。两者合用，符合中医药方剂配伍理论。当归精油和甘草精油合用，是原创性的配方组合，有相互增效的作用。而有些精油组合在一起会产生功效抑制。
本发明选择使用的当归精油和甘草精油，没有选择中药当归和甘草的水提取物，也未选择采用中药甘草和当归的油浸泡物。同时，所选用当归精油和甘草精油均通过超临界CO2萃取所得，萃取过程中未添加其他溶剂，确保了当归精油和甘草精油的成分稳定，不受溶剂干扰，能真实反映当归精油和甘草精油的功效。
将珍珠经弱酸处理和发酵后获得的珍珠发酵液与当归精油和甘草精油混合制成的抗衰老组合物显示出比单独的珍珠发酵液和单独的精油有更好的抗衰效果，并且10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)比其他配比组合更明显降低皮肤组织脂褐质含量，提高抗氧化能力，清除体内自由基，减轻脂质过氧化损伤，达到最佳延缓衰老的效果。
附图简述
图1为不同精油的总抗氧化能力研究结果
1：当归精油；2：艾叶精油；3：红花精油；4：红景天精油；5：人参精油；6：金银花精油；7：川芎精油；8：积雪草精油；9：甘草精油；10：连翘精油；11：白茶精油；
图2为化妆品原料制成乳膏对衰老模型小鼠皮肤外观的影响
图3为各组模型小鼠的皮肤脂褐质含量。*p<0.05vs各处理组。
图4为各组模型小鼠的皮肤的总抗氧化能力。*p<0.05vs各处理组。
具体实施方式
以下通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
下述实施例中所使用的材料如无特别说明均为市售购买。
【实施例1】抗衰老组合物制备
1、珍珠发酵液
样品1
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时将过量二氧化碳通入混合液底部0.5小时；或添加20％的弱酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的酿酒酵母扩培菌液，置于发酵罐中28℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品2
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时添加20％的乙酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的酿酒酵母扩培菌液，置于发酵罐中28℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品3
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时添加20％的乳酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的酿酒酵母扩培菌液，置于发酵罐中28℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品4
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时将过量二氧化碳通入混合液底部0.5小时；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的乳酸菌扩培菌液，置于发酵罐中37℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品5
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时添加20％的乙酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的乳酸菌扩培菌液，置于发酵罐中37℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品6
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时添加20％的乳酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的乳酸菌扩培菌液，置于发酵罐中37℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品7
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时将过量二氧化碳通入混合液底部0.5小时；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的枯草芽孢杆菌扩培菌液，置于发酵罐中37℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品8
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时添加20％的乙酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的枯草芽孢杆菌扩培菌液，置于发酵罐中37℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
样品9
步骤1)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
步骤2)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5的质量比混合在30℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50rpm速度下搅拌；
步骤3)同时添加20％的乳酸溶液加以溶解；
步骤4)将过滤获得的上清液中，接入5％的枯草芽孢杆菌扩培菌液，置于发酵罐中37℃，114rpm培养36小时。
步骤4)在85℃下搅拌20min的灭活后，通过0.22μm的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-80℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12h。最终收获得冻干粉。
步骤6)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行4℃内进行储存。
以上方法获得的珍珠抗衰提取物冻干粉样品1-9属于一次溶解和生物分解的组合，其优势在于：
1.通过弱酸溶解温和方式无损提取珍珠中部分溶液成分，进行有选择性的无损分离提取；
2.提高吸收率和活性，本发明考虑到提取物分子量大，通过微生物分解的方式加以降解，在微生物的作用下获得更为丰富的活性混合物；
3.所获得的珍珠抗衰活性物因多种微生物代谢产物的复配，自带抑菌肽，能够保证珍珠抗衰提取物后期不用添加防腐剂；
4.获取的珍珠抗衰提取物能够有效抑制炎症因子bcl-2,caspase-3and caspase-9的产生，并且抑制活性氧、丙二醛的产生，并且同时促进谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的产生。通过线粒体抗衰途径，有效修护衰老细胞，延长细胞活性。
2、当归精油
从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号：JY010201。
当归精油是从植物当归(Angelica Sinensis)中提取得到的挥发油，也可通过下述方法制备：
超临界二氧化碳流体萃取+分子蒸馏萃取当归精油：将甘肃产的中药材当归按照10～20目进行粉碎，再用乙醇溶液提取、浓缩、真空干燥，制备当归浸泡物。浸提时采用乙醇，按照固液比1：3.5的比例浸提两次，第一次浸提3.5h，第二次浸提2.5h。用砂布袋装好已秤量好的药材粉，并装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器(浸在冰水浴中)，柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,预浸润10-15min,超临界CO2流体萃取。分离器I压力20-25Mpa、温度35-50℃，分离器II压力4.5～5.5MPa、温度45℃，二氧化碳流量35kg/h,萃取时间1.5-2h，所得的墨绿色当归精油膏状物。以当归膏状物为原料，用95.0％的乙醇，按当归膏状物和乙醇比例为1：9进行萃取。过滤除去部分蜡质，将滤液静置过夜。次日再过滤，将滤液在50℃、真空度-0.015MPa的条件下，用真空抽出乙醇，所得深棕色物为当归原精。采用分子蒸馏工艺对制得的当归原精进行精制，工艺条件：蒸馏温度115℃、真空度-0.015MPa、当归原精流量1.0ml/min、刮膜转速380r/min.冷却温度≤12℃，得当归精油。
3、甘草精油
从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号：XYJY005501。
甘草精油是从植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)中提取得到的挥发油，也可通过下述方法制备：
超临界二氧化碳流体萃取甘草精油：将宁夏产的中药材甘草粉碎成过10～20目筛的粗粉，过一遍水，晒干，再粉碎75目待用。用砂布袋装好已秤量好的药材粗粉，装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器(浸在冰水浴中)，柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,预浸润10-15min,超临界CO2流体萃取。CO2流体流速1L/min，萃取温度30-35℃，萃取压力35-40MPa，分离温度50～60℃，分离压力4.5～5.5MPa，萃取时间2-3h，得带有甘草精油的膏状物。以甘草膏状物为原料，用95.0％的乙醇，按甘草膏状物和乙醇的比例为1：9进行萃取，过滤除去部分蜡质，将滤液静置过夜，次日再过滤，将滤液在50℃、真空度-0.015MPa的条件下，用真空抽出乙醇，得甘草精油。
【实施例2】精油体外总抗氧化能力检测实验研究
样品来源：实验所用各种精油从牧九野(上海)科技有限公司采购，当归精油批号JY010201；甘草精油批号XYJY005501；艾叶精油批号JY0011；红花精油批号XYJY0057；红景天精油批号XYJY0048；人参精油批号JY0070；金银花精油批号XYJY0070；川芎精油批号XYJY0050；积雪草精油批号XYJY0056；连翘精油批号JY0109；白茶精油批号XYJY0037。
1研究内容和目的
1.1样品的体外抗氧化作用。
1.2样品在模型小鼠中的抗皮肤衰老作用。
目的：通过研究结果评价精油的抗皮肤衰老功效。
2研究结果
2.1各种精油的体外抗氧化作用
在检测的11种精油中，抗氧化能力较强的精油分别是：样品1(当归精油)总抗氧化能力是99.8mM，样品9(甘草精油)总抗氧化能力是61.2mM，样品8(积雪草精油)总抗氧化能力是52.69mM，其他精油总抗氧化能力低于50mM，结果见图1。
3研究方法
一、精油体外总抗氧化能力检测实验研究
1实验材料
1.1实验试剂
总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法，碧云天生物技术有限公司)
1.2仪器设备
名称 公司
Synergy2多功能酶标仪 美国，Bio-tek
电子精密天平 德国，Sartorius
1.3精油的配制
表1样品编号
Figure BDA0003657956290000111
Figure BDA0003657956290000121
2实验方法
2.1实验原理
活性氧(Reactive oxygen species,ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤。机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。
2.2实验步骤
2.2.1标准曲线制备：称取23.8mg FeSO4 7H2O用856μl DMSO稀释。分别稀释成50Mm、25mM、5mM、1mM。
2.2.2FRAP法测定总抗氧化能力：
a.96孔板的每个检测孔中加入180μl FRAP工作液。
b.空白对照孔中加入5μl蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5μl各种浓度的FeSO4标准溶液；样品检测孔内加入5μl待测样品，轻轻混匀。
c.37℃孵育3-5分钟后在波长593nm测定OD值。
d.根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
e.总抗氧化能力的表示方式：对于FRAP方法，总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示。值越大表明有抗氧化物质还原的越多，即抗氧化物质的抗氧化活性越强。
3实验数据
3.1标准品和样品分别在593nm测定OD值
表1-1标准品的OD值
Figure BDA0003657956290000131
表1-2样品的OD值
Figure BDA0003657956290000132
Figure BDA0003657956290000141
3.2根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力
标准曲线制备：y＝0.0227X+0.0649r＝0.999
表2样品总抗氧化能力检测结果
Figure BDA0003657956290000142
【实施例3】精油体外DPPH自由基清除实验研究
1实验材料
1.1试药与试剂
当归精油、艾叶精油、红花精油、红景天精油、人参精油、金银花精油、川芎精油、积雪草精油、甘草精油、连翘精油、白茶精油、L-Ascorbic acid(a92902-25G,购自SIGMA)、2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(D9132-5G,购自SIGMA)、95％乙醇
1.2仪器与设备
全自动酶标仪、万分之一天平、96孔板、一次性吸管、1000ul、200ul枪及枪头、2mlEP管。
2.实验方法
2.1 DPPH配制
精密称取12mgDPPH于100mL容量瓶，用95％乙醇定容，形成0.12mg/mL DPPH溶液。
2.2 Vc配制
精密称取20.6mg于100mL容量瓶用95％乙醇定容，形成206μg/mL母液。等倍稀释，分别得到103μg/mL、51.5μg/mL、25.75μg/mL、12.875μg/mL、6.4375μg/mL的Vc溶液。
2.3样品制备
Figure BDA0003657956290000151
将1-11号样品分别稀释5倍及25倍，形成10mg/ml及2mg/ml的溶液。
2.4检测
样品组：药物100μL+DPPH 100μL(每个浓度3副孔)
对照组：95％乙醇或水100μL+DPPH 100μL(每个浓度3副孔)
空白组：药物100μL+95％乙醇或水100μL(每个浓度3副孔)
(注：除13号样品用水溶解，其他均可用95％乙醇溶解)
清除率＝(1-(A样品-A空白)/A对照)*100％
3.实验结果
Figure BDA0003657956290000152
Figure BDA0003657956290000161
筛选出1号当归精油、7号川芎精油、9号甘草精油、11号白茶精油样品进一步实验：
Figure BDA0003657956290000162
Figure BDA0003657956290000171
4.实验结论
体外DPPH自由基清除实验显示：1号当归精油、7号川芎精油、9号甘草精油、11号白茶精油具有清除自由基作用，且呈剂量依赖型。
【实施例4】珍珠发酵液+当归甘草精油抗皮肤衰老功效实验研究
1研究内容和目的
样品在模型小鼠中的抗皮肤衰老作用。
目的：通过研究结果评价化妆品原料的抗皮肤衰老功效。
2研究结果
2.1化妆品原料对衰老模型小鼠皮肤外观的影响
模型小鼠的分组和样品编号如下：
表6
Figure BDA0003657956290000172
Figure BDA0003657956290000181
造模前小鼠皮肤光滑有弹性(图2之编号1)。经过D-半乳糖注射造模后，小鼠背部会增厚、弹性变差、出现皱纹，呈衰老之态(图2之编号2)。组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]有明显的抗衰老作用(图2之编号6)，可以较好地改善小鼠皮肤皱纹的现象，恢复皮肤弹性，效果优于10％维生素C乳膏的阳性对照组(图2之编号3),也优于组4[1％发酵液](图2之编号4)和和组5[10％发酵液(图2之编号5)]。同时，组6[10％发酵液与3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]，比组5[等量的10％发酵液]抗衰老效果好，也比组7[等量的3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]的抗衰老效果好(图2之编号2-7)。另外，相比于当归精油单独和发酵液复配的组8[等量的3％当归精油+10％发酵液](图2之编号8)，以及相比于甘草精油单独和发酵液复配的组9[等量的3％甘草精油+10％发酵液](图2之编号9)，两组精油混合后再和发酵液复配的组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]，产生了更加明显的抗衰老效果(图2之编号6)。组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]改善小鼠皮肤皱纹的功效优于组10[1％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)](图2之编号10)、组11[10％发酵液+2％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组12[15％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组13[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]。
2.2化妆品原料对衰老模型小鼠皮肤脂褐质含量的影响
从图3可看出，与空白组相比，组2[模型组]皮肤脂褐质含量显著上升(红线(上方线)为模型组皮肤脂褐质含量，蓝线(下方线)为空白组皮肤脂褐质含量)，组6[10％发酵液+3％精油(当归精油：甘草精油＝1：1)]涂抹小鼠皮肤后显著降低了皮肤褐脂质含量(相比于其他各组p＜0.05)，优于组3[10％维生素C阳性对照组]，也优于组4[1％发酵液]和组5[10％发酵液]。同时，组6[10％发酵液与3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]，比只有发酵液的组5[等量的10％发酵液]效果好，也比只有精油的组7[等量的3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]效果好。另外，相比于当归精油单独和发酵液复配的组8[等量的3％当归精油+10％发酵液]，以及相比于甘草精油单独和发酵液复配的组9[等量的3％甘草精油+10％发酵液]，两种精油混合后再和发酵液复配的组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]可以显著地降低小鼠皮肤脂褐质含量。组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]降低小鼠皮肤脂褐质含量的效果，明显优于组10[1％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组11[10％发酵液+2％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组12[15％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组13[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]。
2.3化妆品原料对衰老模型小鼠皮肤总抗氧化能力的影响
从图4可以看出，与空白组相比，组2[模型组]小鼠皮肤的总抗氧化能力显著下降(红线(下方线)为模型组皮肤总抗氧化能力，蓝线(上方线)为空白组皮肤总抗氧化能力)。组6经样品[10％发酵液+3％精油(当归精油：甘草精油＝1：1)]涂抹后，明显提高了小鼠皮肤的总抗氧化能力，优于组3[10％维生素阳性对照组]，也优于组4[1％发酵液]和组5[10％发酵液]。同时，发酵液和精油复配组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]的总抗氧化能力，优于单独使用发酵液的组5[等量的10％发酵液]，也单独使用精油的组7[等量的3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]。另外，相比于当归精油单独和发酵液复配的组8[等量的3％当归精油+10％发酵液]，以及相比于甘草精油单独和发酵液复配的组9[等量的3％甘草精油+10％发酵液]，两种精油混合后再和发酵液复配的组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]可以显著地提升小鼠皮肤总抗氧化能力。组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]在提高小鼠皮肤的总抗氧化能力上，明显优于组10[1％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组11[10％发酵液+2％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组12[15％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]、组13[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]。
以上实验结果提示组6[10％发酵液+3％精油(当归精油:甘草精油＝1:1)]可比其他组合明显降低皮肤组织脂褐质含量，提高抗氧化能力，清除体内自由基，减轻脂质过氧化损伤，从而达到延缓衰老的效果。

Claims (8)

1.一种抗衰老的组合物，由下述成分组成：
10％重量的珍珠发酵液；
3％重量的精油，所述精油为当归精油与甘草精油1：1重量的混合物；
其余为化妆品基质；
其中，所述珍珠发酵液通过下述方法制得：
1)将珍珠粉碎，获得超微细珍珠粉；
2)将珍珠粉与水混合搅拌制成混合液；
3)将过量二氧化碳通入混合液底部；或添加10～30％重量的弱酸溶液加以溶解；
4)过滤后将获得的上清液中，接入1-10％重量的微生物扩培菌液，置于发酵罐中28-37℃，100-200rpm培养24-36小时；
5)将培养液灭活后，过滤膜获取无菌过滤液；
6)将过滤液与冻干保护剂混合，冻干，收获水分含量在2-5％重量的冻干粉；
所述当归精油为以当归(Angelica Sinensis)为原料，通过超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏提取得到的挥发油；
所述甘草精油为以甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)为原料，通过超临界二氧化碳萃取提取得到的挥发油。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于步骤3)所述的弱酸溶液为选自乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸中的一种或多种；步骤4)所述的微生物为选自啤酒酵母、葡萄汁酵母或鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述弱酸溶液为乳酸、乙酸或柠檬酸，所述微生物为啤酒酵母、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其特征在于所述珍珠发酵液通过下述方法制得：
i)将珍珠清洗干净，晒干粉碎后，过气流粉碎机，获得超微细珍珠粉；
ii)将1kg珍珠粉与去离子水按1:5-20的质量比混合在30-70℃下通过内部搅拌转子或者搅拌叶50-100rpm速度下搅拌；
iii)同时将过量二氧化碳通入混合液底部0.5-1.5小时；或添加10～30％重量的弱酸溶液加以溶解；
iv)将过滤获得的上清液中，接入1-10％重量的微生物扩培菌液，置于发酵罐中28-37℃，100-200rpm培养24-36小时；
v)在85-100℃下搅拌20-50min的灭活后，通过0.22μ.的过滤膜压滤获取无菌过滤液；
vi)过滤液与冻干保护剂进行100：0.5～2(体积/质量)比例的混合，进行液氮或者-70-85℃进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12-20h，最终收获水分含量在2-5％重量的冻干粉；
vii)将冻干粉罐装于棕色的西林瓶中进行1-10℃内进行储存。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述化妆品基质为乳膏基质。
6.权利要求1所述的组合物在制备抗衰老功效化妆品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的抗衰老功效为提高皮肤抗氧化能力、降低皮肤脂褐质含量、清除体内自由基和/或减轻脂质过氧化损伤。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述当归精油通过下述方法制得：
先将中药材当归按照10～20目进行粉碎，再用乙醇溶液提取、浓缩、真空干燥，制备当归浸泡物，浸提时采用乙醇，按照固液比1：3.5的比例浸提两次，第一次浸提3.5h，第二次浸提2.5h；
用砂布袋装好已秤量好的药材粉，并装入萃取器中，封好顶盖，开启恒温槽电源，打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器，柱塞泵，进入增压缓冲瓶，待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,预浸润10-15min,超临界CO2流体萃取；分离器I压力20-25Mpa、温度35-50℃，分离器II压力4.5～5.5MPa、温度45℃，二氧化碳流量35kg/h,萃取时间1.5-2h，所得的墨绿色当归精油膏状物；
以当归膏状物为原料，用95.0％的乙醇，按当归膏状物和乙醇重量比为1：9进行萃取，过滤除去部分蜡质，将滤液静置过夜，次日再过滤，将滤液在50℃、真空度-0.015MPa的条件下，用真空抽出乙醇，所得深棕色物为当归原精；
用分子蒸馏工艺对制得的当归原精进行精制，工艺条件：蒸馏温度115℃、真空度-0.015MPa、当归原精流量1.0ml/min、刮膜转速380r/min.冷却温度≤冷却℃，得当归精油；
所述甘草精油通过下述方法制得：
将中药材甘草粉碎成过10～20目筛的粗粉，过一遍水，晒干，再粉碎75目待用，用砂布袋装好已秤量好的药材粗粉，装入萃取器中，封好顶盖，开启恒温槽电源，打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器，柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,预浸润10-15min,超临界CO2流体萃取；CO2流体流速1L/min，萃取温度30-35℃，萃取压力35-40MPa，分离温度50～60℃，分离压力4.5～5.5MPa，萃取时间2-3h，得带有甘草精油的膏状物；
以甘草膏状物为原料，用95.0％的乙醇，按甘草膏状物和乙醇的重量比为1：9进行萃取，过滤除去部分蜡质，将滤液静置过夜，次日再过滤，将滤液在50℃、真空度-0.015MPa的条件下，用真空抽出乙醇，得甘草精油。
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