CN114908111A - 连续克隆长dna片段的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于构建长DNA片段的多核苷酸、核酸构建物、方法和系统，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点。
Description
技术领域
本发明涉及DNA克隆领域，具体涉及长DNA片段的连续克隆的方法和系统。
背景技术
全基因组测序信息表明不同生物基因组的大小差异很大，简单和低等的生物基因组相对较小，比如细菌基因组有1-10Mb，酵母基因组为12Mb，随着生物进化得越来越复杂，生物的基因组也变得越来越大，比如植物拟南芥基因组有120Mb，昆虫果蝇基因组有137Mb，小鼠基因组有2.6Gb，而人的基因组有3.0Gb。随着人类对生命科学探索的不断深入，人工合成生物基因组工作正在全球多个国家有序展开，我们对于基因组超大DNA片段的快速精准组装的需求日益迫切。此外，在复杂高等生物基因组中，功能相同或相关的基因常常聚集在一起，形成超大的功能基因簇，大小可达1Mb。而超大的DNA片段在操作过程中存在随机断裂、易降解、难以转移、耗时长等缺陷。发展超大DNA片段(≥1Mb)操作技术对人工生命体的创建以及复杂高等生物基因组功能的研究及应用都至关重要。
但是，目前已发展的经典分子生物学常用的克隆载体不能满足克隆基因组超大DNA片段的需求。比如来源于小质粒、噬菌体和粘粒的克隆载体通常只能容纳<40kb的外源DNA片段。细菌人工染色体(BAC)系统是一种常用的细菌克隆系统，常用于克隆100-300kb的DNA片段。BAC载体来自于大肠杆菌的单拷贝质粒F因子，且在宿主体内遗传复制稳定，使细菌人工染色体系统广泛应用于基因组文库构建。但是，传统的BAC克隆是一种环型形式的DNA，较大的环型DNA难以与大肠杆菌环型基因组分离、检测及纯化。酵母人工染色体(YAC)是酵母中常用来高等生物基因组文库的载体。虽然酵母人工染色体能够容纳大于1Mb的外源DNA片段，但长重复序列的DNA片段在宿主体内不稳定的，不稳定的YAC载体克隆会引发外源片段的重组丢失。另外，由于共连接或重组，YAC文库存在20-60％的嵌合体克隆，即包含多于2个非连续片段基因组区段，这极大限制了酵母人工染色体的应用。
大肠杆菌是最常用的遗产操作宿主，它比酵母生长更快，而且遗产操作也更容易。本发明仍需发展在大肠杆菌中连续克隆基因组超大片段DNA的新方法。
发明内容
本发明涉及新的克隆超大片段DNA的线型载体，并利用新载体建立了超大DNA片段的体内连续克隆拼接的新方法。利用本发明实现低成本短时间高效迭代无缝拼接组装出大于1Mb的超大DNA片段。
本发明第一方面提供一种多核苷酸，用于构建长DNA片段，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包含5’同源臂和3’同源臂。所述同源臂用于借助基因编辑系统使所述多核苷酸与目的片段整合(成环形)。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包括借助基因编辑系统通过5’同源臂和3’同源臂整合的目的片段。
在一个或多个实施方案中，所述5’同源臂和3’同源臂分别识别目的片段的3’端和5’端。
在一个或多个实施方案中，所述基因编辑系统选自CRISPR、ZFN、TALEN。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点，转移起始位点oriT和复制起点位于5’同源臂和3’同源臂之间。
在一个或多个实施方案中，5’同源臂长度为30-1000bp、50-900bp、100-800bp、200-700bp、300-600bp、400-500bp。
在一个或多个实施方案中，3’同源臂长度为30-1000bp、50-900bp、100-800bp、200-700bp、300-600bp、400-500bp。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点或其互补序列能被其切割酶切割。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点是tos位点。
在一个或多个实施方案中，tos位点来源于噬菌体N15。
在一个或多个实施方案中，tos位点序列包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列。
在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，例如大肠杆菌。
在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT来源于大肠杆菌BAC。
在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT来源于质粒pQX17。
在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT包含SEQ ID NO:2所示的序列。
在一个或多个实施方案中，复制起点来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌。
在一个或多个实施方案中，复制起点来源于大肠杆菌。
在一个或多个实施方案中，复制起点包含SEQ ID NO:3或4所示的序列。
在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT和复制起点的位置可互换。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于转移起始位点oriT和复制起点的5’端或3’端。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于转移起始位点oriT和复制起点之间。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于复制起点的5’端。此时切割和重组效率高于双链切割识别位点位于复制起点的3’端的情况。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸依次包含：
5’同源臂，复制起点，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，3’同源臂；
5’同源臂，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点，3’同源臂；
5’同源臂，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，复制起点，3’同源臂；
5’同源臂，复制起点，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，3’同源臂；
5’同源臂，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，3’同源臂；
5’同源臂，双链切割识别位点，复制起点，转移起始位点oriT，3’同源臂。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包含标记基因，例如抗生素抗性基因。
在一个或多个实施方案中，标记基因选自：壮观霉素筛选标记Spc、阿泊拉霉素筛选标记Apr、氨苄青霉素抗性筛选标记中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，标记基因位于5’同源臂和3’同源臂之间。
在一个或多个实施方案中，标记基因位于转移起始位点oriT和复制起点之间。
在一个或多个实施方案中，标记基因位于复制起点的3’端。
在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于标记基因的5’端或3’端。
本发明第二方面提供一种核酸构建物，包含本文任一实施方案所述的多核苷酸和目的片段，用于构建长DNA片段。
在一个或多个实施方案中，所述目的片段是长DNA片段的一部分。
在一个或多个实施方案中，所述长DNA片段的长度至少2kb，例如2kb-1.5Mb。在一个或多个实施方案中，所述长DNA片段的长度至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少200kb、至少300kb、至少400kb、至少500kb、至少600kb、至少700kb、至少800kb、至少900kb、至少1Mb、至少1.1Mb或上述任意两个数值之间的范围。
在一个或多个实施方案中，所述目的片段的长度至少1kb，例如为1kb-30kb，例如2kb-29kb、3kb-28kb、4kb-27kb、5kb-26kb、6kb-25kb、7kb-24kb、8kb-23kb、9kb-22kb或上述任意两个数值之间的范围。
在一个或多个实施方案中，所述目的片段位于所述多核苷酸之外。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是环形构建物。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割。
在一个或多个实施方案中，所述双链切割识别位点是tos位点，所述切割酶是TelN。
在一个或多个实施方案中，tos位点来源于噬菌体N15。
在一个或多个实施方案中，tos位点序列包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列。
在一个或多个实施方案中，TelN的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含：
(1)第一核酸构建物，其具有本文任一实施方案所述的多核苷酸和第一目的片段，
(2)第二核酸构建物，其具有本文任一实施方案所述的多核苷酸和第二目的片段，
其中第一目的片段的3’端与第二目的片段的5’端具有1kb-200kb的重叠区域。
在一个或多个实施方案中，所述重叠区域为2kb-150kb、3kb-140kb、4kb-130kb、5kb-120kb、5kb-100kb、5kb-80kb、或5kb-60kb。
在一个或多个实施方案中，第一核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割。
在一个或多个实施方案中，第二核酸构建物是环形构建物。
在一个或多个实施方案中，第一核酸构建物与第二核酸构建物分别具有标记基因，例如抗生素抗性基因。
在一个或多个实施方案中，第一核酸构建物具有一种或两种标记基因，且满足以下条件：(1)至少一种标记基因位于第一目的片段的5’端，并且任选地(2)双链切割识别位点位于所述至少一种标记基因的5’端。优选地，所述两种标记基因不同。在一个或多个实施方案中，两种标记基因分别位于第一目的片段的5’端和3’端。
在一个或多个实施方案中，第二核酸构建物的标记基因位于第二目的片段的3’端，并且双链切割识别位点位于所述标记基因的3’端。
在一个或多个实施方案中，第一核酸构建物与第二核酸构建物中的标记基因均不相同。
在一个或多个实施方案中，标记基因选自：壮观霉素筛选标记Spc、阿泊拉霉素筛选标记Apr、氨苄青霉素抗性筛选标记中的一种或多种。
本发明还提供宿主细胞，包含本文第二方面所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是环形构建物，并且所述宿主细胞不表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。任选地，所述宿主细胞还包含接合转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是线性构建物，并且所述宿主细胞表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。
本发明第三方面提供一种核酸构建物或包含该核酸构建物的宿主细胞，所述核酸构建物包含与启动子操作性连接的TelN的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述启动子是组成型启动子，例如J23100启动子。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。
本发明还提供一种构建长DNA片段或使目的片段整合成较长片段的方法，包括：
(1)在使宿主细胞发生接合转移的条件下使受体宿主细胞和供体宿主细胞接触，其中，
所述受体宿主细胞包含本文第二方面中所述的第一核酸构建物，所述核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割，
所述供体宿主细胞包含本文第二方面中所述的第二核酸构建物，所述核酸构建物是环形构建物；
(2)孵育受体宿主细胞，所述第一目的片段和所述第二目的片段发生同源重组，所述同源重组获得具有第一目的片段和第二目的片段的第三核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述受体宿主细胞表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。
在一个或多个实施方案中，所述供体宿主细胞不表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。
在一个或多个实施方案中，所述供体宿主细胞还包含接合转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002。
在一个或多个实施方案中，所述第一核酸构建物和/或所述第二核酸构建物的其他特征如本文第二方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括
(0.1)利用5’同源臂和3’同源臂将本文所述的多核苷酸与第一目的片段整合，获得包含所述第一核酸构建物的受体宿主细胞，
(0.2)利用5’同源臂和3’同源臂将本文所述的多核苷酸与第二目的片段整合，获得包含所述第二核酸构建物的供体宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，(0.1)还包括在所述受体宿主细胞表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。例如在所述受体宿主细胞中转入含有所述切割酶的编码序列的核酸构建物，优选表达载体或整合载体。
在一个或多个实施方案中，(0.2)还包括在所述供体宿主细胞中转入接合转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002。
在一个或多个实施方案中，所述5’同源臂和3’同源臂分别识别目的片段的3’端和5’端。
在一个或多个实施方案中，所述整合是通过基因编辑系统将所述多核苷酸与目的片段连接成环。
在一个或多个实施方案中，所述基因编辑系统选自CRISPR、ZFN、TALEN。
在一个或多个实施方案中，所述使宿主细胞发生接合转移的条件包括：
供体宿主细胞和/或受体宿主细胞处于指数生长期；
供体宿主细胞与受体宿主细胞的总浓度为108个/mL；
供体宿主细胞与受体宿主细胞的比例为10:1-1:10，例如5:1-1:1，优选4:1；
培养温度25-40℃，优选30-34℃；
培养时间至少0.5小时。
在一个或多个实施方案中，(2)所述孵育的温度为25-40℃，优选30-34℃。
本发明还提供一种用于构建长DNA片段或使目的片段整合成较长片段的系统，包含本文任一实施方案所述的多核苷酸、核酸构建物、或供体和受体宿主细胞。
本发明优点：
1、对高等动植物复杂基因组超大功能基因簇功能及人工改造等研究亟需发展超大DNA(>1Mb)的克隆拼接技术。本发明的克隆拼接技术可以避免体外操作DNA大片段的困难，快速高效拼接组装出＞1Mb的超大DNA片段。
2、本发明构建一种TelN/tos系统，可以将传统的环型质粒DNA转换成线型质粒DNA。在不破坏大肠杆菌MDS42各基因的正常功能前提下，通过CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌基因组中插入组成型启动子带动的TelN组件。另外将环型质粒DNA上引入tos位点，再将该环型质粒DNA转化进组成型表达TelN蛋白的宿主体内，端粒酶TelN将结合在tos位点，先切开后封住缺口，形成2个闭合末端发夹结构。在TelN/tos系统转换成线型形式存在后，线型质粒DNA之间拼接只需要1次单交换，而环型质粒DNA之间拼接需要交换2次，因此，采用线型形式质粒DNA的拼接效率更高。
3、本发明中我们引入了大肠杆菌的IV型分泌系统(T4SS)4，巧妙的避免了DNA大片段体外操作的困难。即在供体菌的质粒上引入了转移起始位点oriT，在额外转入质粒pUZ8002的辅助下，供体菌环型质粒以单链形式接合转移到受体菌中。这种设计一方面避免了从供体菌中提取大质粒和再电击转化受体菌株的复杂操作，另一方面极大的降低了拼接组装成本和时间消耗。
4、本发明通过利用3个高效元件创建了新型的可容纳>1Mb超大DNA的线型克隆载体，并由此发展了可在原核模式菌大肠杆菌体内实现克隆超过1Mb外源DNA超大片段的新方法。相比现有方法，本发明避免了大片段DNA的复杂低效体外操作，极大降低了拼接组装成本和时间消耗；另一方面，与现有方法需要进行两个位点的重组交换不同，本发明的克隆方法仅需要通过单次重组交换即可，DNA大片段克隆拼接效率更为高效。我们利用该方法成功克隆拼接了完整的人免疫球蛋白重链可变区(1.07Mb)的超大DNA片段。本发明将在高等生物复杂基因组的克隆和拼接组装中有广泛应用。
附图说明
图1是质粒p1的构建示意图。将融合PCR获得的打靶组件与质粒S4-gRNA同时电击转化转入菌株MDS42中，再借助于CRISPR/Cas9系统替换目标区域，完成环型质粒p1的构建。
图2是质粒p2的构建示意图。将融合PCR获得的打靶组件与质粒SCK-gRNA同时电击转化转入菌株MDS42中，再借助于CRISPR/Cas9系统替换目标区域，完成环型质粒p2的构建。
图3是质粒p3的构建示意图。将融合PCR获得的打靶组件与质粒SC-gRNA同时电击转化转入菌株MDS42中，再借助于CRISPR/Cas9系统替换目标区域，完成环型质粒p3的构建。
图4是一种实施方案的接合转移拼接组装示意图。①将供体菌MDS42的环型质粒p2通过接合转移方式转入受体菌MT中；②在不稳定oriC复制区的压力下，线性化的质粒p2与线型质粒p1会发生1次单交换；③在2种抗生素的筛选压力下，如果拼接组装成功，会生成线型质粒pA。其中，字母T为oriT元件，R1为抗性筛选标记1，R2为抗性筛选标记2。
图5是一种实施方案的接合转移拼接组装示意图。①将供体菌MDS42的环型质粒p4通过接合转移方式转入受体菌MT中；②在相同复制区质粒不相容的压力下，线性化的质粒p4与线型质粒pB会发生1次单交换；③在2种抗生素的筛选压力下，如果拼接组装成功，会生成线型质粒pC。其中，字母T为oriT元件，R1为抗性筛选标记1，R2为抗性筛选标记2，R3为抗性筛选标记3。
图6显示一种实施方案的脉冲场电泳验证拼接组装结果。用PFGE琼脂糖制作浓度为1％的凝胶，电泳缓冲液为0.5xTBE，温度为12℃，转换时间为10-60s，角度为120°，运行时间为17h，电压梯度为6V/cm。
图7显示一种实施方案的脉冲场电泳验证拼接组装结果。用PFGE琼脂糖制作浓度为1％的凝胶，电泳缓冲液为0.5xTBE，温度为12℃，转换时间为10-60s，角度为120°，运行时间为17h，电压梯度为6V/cm。
图8显示脉冲场电泳验证大片段拼接组装结果。图8A：用PFGE琼脂糖制作浓度为1％的凝胶，电泳缓冲液为0.5xTBE，温度为12℃，转换时间为10-60s，角度为120°，运行时间为17h，电压梯度为6V/cm。图8B：PFGE琼脂糖制作浓度为1％的凝胶，电泳缓冲液为0.5xTBE，温度为12℃，角度为120电压梯度为6V/cm。模块1的转换时间为60s，22h；模块2的转换时间为90s，12h。
具体实施方式
本发明利用大肠杆菌复制元件(例如大肠杆菌染色体的oriC复制元件或来源于大肠杆菌F因子的BAC复制元件)构建了新型克隆载体，该载体可通过切割酶(例如原核端粒酶TelN蛋白)识别切割双链切割识别位点(例如tos位点)使载体DNA线性化，再借助于大肠杆菌自身的同源重组能力一步实现两个线型DNA大片段的拼接组装。此外，为了使含有两个线型DNA大片段同源重组，发明人引入了大肠杆菌的IV型分泌系统(T4SS)4，通过在供体菌的质粒上引入了转移起始位点oriT，巧妙的避免了DNA大片段体外操作的困难。
本发明所用术语“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。提到核酸时，本文所用术语“变体”可以是天然发生的等位变体或非天然发生的变体。这些核苷酸变体包括简并变体、取代变体、缺失变体和插入变体。如本领域所知的，等位变体是一个核酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。
本文所述“长DNA片段”或“超大DNA片段”的长度至少2kb，例如至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少200kb、至少300kb、至少400kb、至少500kb、至少600kb、至少700kb、至少800kb、至少900kb、至少1Mb、至少1.1Mb或上述任意两个数值之间的范围。
本文中，“双链切割识别位点”表示通过酶促或非酶促方法识别的核酸切割位点。任何双链切割识别位点及其对应的切割酶或同源序列均可用于本发明。有时，切割酶可以识别双链切割识别位点或其互补序列。在具体实施方案中，使用来源于噬菌体N15的由端粒酶TelN蛋白识别的tos位点。tos位点序列如SEQ ID NO:1或其互补序列所示。TelN的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本文中，“转移起始位点oriT”是细菌IV型分泌系统所需的组件。细菌IV型分泌系统是与细菌接合机制有关的一类分泌系统。IV型分泌系统可以转运DNA。具有含转移起始位点oriT的质粒的细菌可以在接合转移辅助组件的存在下于oriT处发生单链缺刻，并通过细菌接触将该质粒的单链拷贝导入邻近接触的细菌中，从而实现DNA的转运。任何可引导细菌接合转移的转移起始位点oriT均可用于本发明。在一些实施方案中，转移起始位点oriT来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，例如大肠杆菌。示例性地，转移起始位点oriT来源于大肠杆菌BAC(质粒pQX17)。在具体实施方案中，oriT序列如SEQ ID NO:2所示。
本文中，“移辅助组件”可以是接合转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002。
本文中，“复制起点”和“复制元件”可互换使用，是DNA复制的起始位置。本领域知晓用于原核或真核细胞的DNA复制的复制起点。在一些实施方案中，转移起始位点oriT来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，例如大肠杆菌。示例性的复制起点如SEQ ID NO:3或4所示。
本发明的新型克隆载体包含一段多核苷酸，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，并且任选在两端包含5’同源臂和3’同源臂。所述同源臂用于借助基因编辑系统使所述多核苷酸与含有目的片段的载体整合(成环形)。任何适用于原核或真核细胞的基因编辑系统均可用于本发明，例如CRISPR、ZFN、TALEN。
本文多核苷酸中的各组件可以任意方式排列，只要双链切割识别位点切割后的线性DNA可以在细胞中自我复制即可。通常，双链切割识别位点位于复制起点的5’端，转移起始位点位于双链切割识别位点的5’端或3’端。在优选实施方案中，双链切割识别位点位于转移起始位点oriT和复制起点之间。
不希望受任何理论的限制，在具体实施方案中，所述多核苷酸依次包含：5’同源臂，复制起点，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，3’同源臂；5’同源臂，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点，3’同源臂；5’同源臂，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，复制起点，3’同源臂；5’同源臂，复制起点，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，3’同源臂；5’同源臂，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，3’同源臂；或5’同源臂，双链切割识别位点，复制起点，转移起始位点oriT，3’同源臂。
为了实现对含有所述多核苷酸的细菌的筛选，本文所述多核苷酸还可以包含标记基因，例如抗生素抗性基因。实施例中的示例性标记基因包括：壮观霉素筛选标记Spc、阿泊拉霉素筛选标记Apr、氨苄青霉素抗性筛选标记。通常，标记基因位于5’同源臂和3’同源臂之间。在一个或多个实施方案中，标记基因位于转移起始位点oriT和复制起点之间。在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于标记基因的3’端或5’端。
本发明的核酸构建物(例如克隆载体)，包含本文任一实施方案所述的多核苷酸和目的片段，用于构建长DNA片段。所述目的片段是本文所述长DNA片段的一部分，长度可为1kb-30kb，例如2kb-29kb、3kb-28kb、4kb-27kb、5kb-26kb、6kb-25kb、7kb-24kb、8kb-23kb、9kb-22kb或上述任意两个数值之间的范围。
含有目的片段的载体可通过将目的片段克隆到所用载体中获得。例如，在知晓待克隆的长DNA片段后，可将其分为两个或多个长度为1kb-30kb的片段。然后，可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得这些片段。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列或包含其的载体。示例性含目的片段的载体包括pBeloBAC11、pBACe3.6、pBACGK1.1、pUC57-Brick。
通过两个同源臂，所述多核苷酸和目的片段可以顺序存在于核酸构建物中，即目的片段位于核酸构建物中所述多核苷酸之外的位置。示例性地，所述5’同源臂和3’同源臂分别识别目的片段的3’端和5’端。借助CRISPR、ZFN、TALEN等基因编辑系统，可将多核苷酸与目的片段或含目的片段的载体整合成环形质粒。在使用CRISPR的实施方案中，根据含目的片段的载体设计gRNA，使得所述多核苷酸与目的片段顺序连接，即插入目的片段的某一端。
通常，本文所述核酸构建物是环形构建物。但由于所述核酸构建物中的多核苷酸中含有双链切割识别位点(如tos位点)，因此在存在切割酶(如TelN)的情况下，所述核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割。
为了进行两个目的片段的连接整合操作，本发明提供一种系统，包含本文所述环形和线性核酸构建物和/或包含这些核酸构建物的宿主细胞。所述系统包含：(1)第一核酸构建物(线性构建物)，其具有本文任一实施方案所述的多核苷酸和第一目的片段，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割，(2)第二核酸构建物(环形构建物)，其具有本文任一实施方案所述的多核苷酸和第二目的片段。第一目的片段的3’端与第二目的片段的5’端具有1kb-200kb的重叠区域，用于同源重组。在一个或多个实施方案中，所述重叠区域为2kb-150kb、3kb-140kb、4kb-130kb、5kb-120kb、5kb-100kb、5kb-80kb、或5kb-60kb。
为了对含有核酸构建物的细胞进行筛选，第一核酸构建物与第二核酸构建物分别具有标记基因，例如上述抗生素抗性基因。在一些实施方案中，第一核酸构建物具有一种或两种标记基因，且至少有一种标记基因位于第一目的片段的5’端，并且任选地，双链切割识别位点位于所述至少一种标记基因的5’端；优选地，所述两种标记基因不同；优选地，两种标记基因分别位于第一目的片段的5’端和3’端。在一些实施方案中，第二核酸构建物的标记基因位于第二目的片段的3’端，并且双链切割识别位点位于所述标记基因的3’端。
本文所述宿主细胞包括革兰氏阳性菌酵母，例如肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本文宿主细胞包括供体宿主细胞和受体宿主细胞。
供体宿主细胞包含第一核酸构建物(线性构建物)，并且供体宿主细胞不表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。任选地，供体宿主细胞还包含接合转移辅助组件(例如转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002)。本领域知晓将转移辅助组件导入宿主细胞的方法，例如通过电转或感受态转化。所述供体宿主细胞不表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。
受体宿主细胞包含第二核酸构建物(环形构建物)，并且所述宿主细胞表达针对所述双链切割识别位点的切割酶。本领域知晓使宿主细胞表达所述切割酶的方法，例如通过电转或感受态转化将表达所述切割酶的表达框导入细胞。通常，表达蛋白的表达框包括与编码基因(例如TelN的编码基因)操作性连接的启动子(例如J23100，序列如SEQ ID NO:6所示)、终止子、增强子等。所述表达框可以通过重组载体整合到细胞基因组中或者通过表达载体以质粒形式存在于细胞质中。本领域任何重组载体和表达载体均可用于本发明。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
因此，本发明还提供一种构建长DNA片段或使目的片段整合成较长片段的方法，包括：(1)在使宿主细胞发生接合转移的条件下使受体宿主细胞和供体宿主细胞接触，其中，所述受体宿主细胞包含本文所述的第一核酸构建物，所述核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割；所述供体宿主细胞包含本文所述的第二核酸构建物，所述核酸构建物是环形构建物；(2)孵育受体宿主细胞，所述第一目的片段和所述第二目的片段发生同源重组，所述同源重组获得具有第一目的片段和第二目的片段的第三核酸构建物。本领域通常用于细菌(尤其是大肠杆菌)接合转移的条件均可用于本发明。在示例性实施方案中，供体宿主细胞和/或受体宿主细胞处于指数生长期；供体宿主细胞与受体宿主细胞的总浓度为108个/mL；供体宿主细胞与受体宿主细胞的比例为10:1-1:10，例如5:1-1:1，优选4:1；培养温度25-40℃，优选30-34℃；培养时间至少0.5小时。
举例而言，供体菌细胞含有环形的第二核酸构建物和转移辅助组件；受体菌细胞表达切割酶，其含有线性的第一核酸构建物。当供体菌细胞和受体菌细胞接触时，在转移辅助组件存在下，供体菌细胞的第二核酸构建物接合转移进入受体菌细胞。在受体菌细胞细胞中，在复制起点的压力下，线性化的第二核酸构建物通过重叠区域与第一核酸构建物直接同源重组完成拼接组装。如图4和5所示。在多种标记基因的筛选下，拼接组装成功可获得两个目的片段重组拼接的线型质粒。
在一个或多个实施方案中，所述方法在步骤(1)之前还包括(a)利用5’同源臂和3’同源臂将本文所述的多核苷酸与第一目的片段整合，获得包含所述第一核酸构建物的受体宿主细胞，(b)利用5’同源臂和3’同源臂将本文所述的多核苷酸与第二目的片段整合，获得包含所述第二核酸构建物的供体宿主细胞。
在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地解读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实施例1，质粒和菌株构建
质粒pCas9-Amp的构建：以质粒pSP72为模板聚合酶扩增氨苄青霉素筛选标记，诱导Red重组系统实现原pCas质粒筛选标记的替换。
质粒gRNA的构建：根据原质粒序列，选择合适的20bp的切割位点。以质粒ptargetF6为模板，设计具有20bp切割位点重叠区域序列引物进行反向聚合酶链式扩增，将该核酸片段通过化学转化方式转化入菌株DH10B中，构建环型质粒构建S0-gRNA、S4-gRNA和SC-gRNA。若需更改质粒抗性筛选标记为卡那霉素筛选标记，以SC-gRNA为模板扩增除了筛选标记以外的骨架区域，以质粒pCas9为模板聚合酶链式扩增卡那霉素筛选标记区域，将2个区域DNA片段通过Gibson等温拼接方法(Gibson,D.G.等，Nature Methods，2009)完成质粒SCK-gRNA的克隆构建。
表1，gRNA识别序列
| 名称 | 20bp序列 | PAM位点 |
| S0-gRNA识别位点 | aaaaagcccggcgtcatgcc | ggg |
| S4-gRNA识别位点 | ccgctgacgcgaaccccttg | cgg |
| SC-gRNA识别位点 | gaaactgccggaaatcgtcg | tgg |
| SCK-gRNA识别位点 | gaaactgccggaaatcgtcg | tgg |
菌株MT的构建：打靶融合组件是由3个片段融合而成。片段1：菌株MDS42左侧同源臂区域～500bp；片段2：由质粒pZJ431聚合酶链式扩增的TelN组件；片段3：菌株MDS42右侧同源臂区域～500bp。电击转化打靶融合组件和质粒S0-gRNA，借助于CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌MDS42基因组上引入DNA双链断裂，在菌株MDS42基因组位置3274965-3274969插入TelN组件，TelN序列选用经酵母表达优化后的N15噬菌体基因组序列NC001901的CDS_29(24995-26890bp,共1896bp)。启动子选择为组成型启动子J23100(http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Constitutive)。
受体菌质粒p1构建：将3个不同区域的片段进行融合PCR，从左到右的3个片段依次是片段1：质粒的左侧同源臂区域～500bp(HL)；片段2：tos位点区域(来源于金斯瑞公司化学合成519bp，噬菌体N15位置24471–24989bp)；片段3：质粒的右侧同源臂区域～500bp(HR)。每个片段之间的重叠区域为40bp。用Phanta Max DNA聚合酶一步融合得到目标组件，后将融合组件通过电击转化的方式转入大肠杆菌MDS42中，借助CRISPR/Cas9系统替换原质粒的目标区域，利用添加了氯霉素的LB培养基进行筛选，获得环型质粒改造成功的菌株。示意图如图1所示。
供体菌质粒p2打靶组件构建：将6个不同区域的片段进行融合PCR，从左到右的6个片段依次是片段1：质粒的左侧同源臂区域～500bp(HL)；片段2：tos位点区域(来源于金斯瑞公司化学合成519bp，噬菌体N15位置24471–24989bp)；片段3：oriT区域(来源于质粒pQX17)；段4：壮观霉素筛选标记Spc(来源于质粒gRNA)；片段5：oriC复制区(来源于菌株MDS42基因组位置3352912-3357362)；片片段6：质粒的右侧同源臂区域～500bp(HR)。每个片段之间的重叠区域为40bp。用Phanta Max DNA聚合酶一步融合得到目标组件，后将融合组件通过电击转化的方式转入大肠杆菌MDS42中，借助CRISPR/Cas9系统替换原质粒的目标区域，利用添加了壮观霉素的LB培养基进行筛选，获得环型质粒改造成功的菌株。示意图如图2所示。
供体菌质粒p3打靶组件构建：将6个不同区域的片段进行融合PCR，从左到右的6个片段依次是片段1：质粒的左侧同源臂区域～500bp(HL)；片段2：BAC复制区(来源于RP11-413L20)；片段3：tos位点区域(来源于金斯瑞公司化学合成519bp，噬菌体N15位置24471–24989bp)；片段4：阿泊拉霉素筛选标记Apr(来源于质粒pXX22)；片段5：oriT区域(来源于质粒pQX17)；片段6：质粒的右侧同源臂区域～500bp(HR)。每个片段之间的重叠区域为40bp。用Phanta Max DNA聚合酶一步融合得到目标组件，后将融合组件通过电击转化的方式转入大肠杆菌MDS42中，借助CRISPR/Cas9系统替换原质粒的目标区域，利用添加了阿泊拉霉素的LB培养基进行筛选，获得环型质粒改造成功的菌株。示意图如图3所示。
供体菌质粒p4打靶组件构建：与质粒p3构建过程相似，区别在于将阿泊拉霉素抗性筛选标记(Apr)更换成壮观霉素抗性筛选标记(Spc)。
供体菌质粒p5构建：与环型质粒p3构建过程相似，区别在于将抗性筛选标记和oriT区域进行了位置互换，其它各元件位置不变。
供体菌质粒p6构建：与环型质粒p4构建过程相似，区别在于将打靶组件的抗性筛选标记和oriT区域进行了位置互换，其它各元件位置不变。
供体菌质粒p7构建：与环型质粒p3构建过程相似，区别在于将打靶组件的抗性筛选标记和oriT区域进行了位置互换，其它各元件位置不变。
供体菌质粒p8-1构建：与环型质粒p4构建过程相似。区别在于将打靶组件的抗性筛选标记和oriT区域进行了位置互换，其它各元件位置不变。另外，元件中额外添加了氨苄青霉素抗性筛选标记。
供体菌质粒p8-2构建：与环型质粒p3构建过程相似。区别在于将打靶组件的抗性筛选标记和oriT区域进行了位置互换，其它各元件位置不变。
供体菌质粒p8-3构建：与环型质粒p4构建过程相似。区别在于将打靶组件的抗性筛选标记和oriT区域进行了位置互换，其它各元件位置不变。另外，该质粒是通过Gibson等温组装拼接获得。
表2，原质粒改造情况汇总
实施例2，目的片段的拼接组装
拼接组装方式1(BAC复制区与oriC复制区的线型质粒拼接)：供体菌株是在只含有环型质粒p2(oriC复制区)的菌株MDS42的基础上，电击转化辅助质粒pUZ8002后待用。受体菌株是基因组上携带组成型表达TelN蛋白的MDS42菌株，同时受体菌株体内只含有已经线性化的待组装线型质粒p1(BAC复制区)。然后将供体菌株的p2接合转移进入受体菌株，线性化质粒p2可通过32kb的同源区域与线型质粒p1直接拼接组装。示意图如图4所示。具体的接合转移步骤参照文献(Ma,N.J.等Nat Protoc.2014)如下操作：
1.在5mL的LB试管中独立培养供体菌和受体菌，等到菌株生长到指数后期；
2.按浓度OD600＝1.0，体积1mL来收集相应的细胞量，约含有大肠杆菌109个；
3.13500g室温离心1min，去除上清液，再用1mL新鲜的LB培养基洗涤细胞3次；
4.取100μL LB重悬细胞，再取10μL细胞悬液加入990μL LB,约含有大肠杆菌108个；
5.按供受体比例4:1混匀细胞，取80μL的供体细胞和20μL受体细胞混匀，约含有大肠杆菌107个；
6.在LB培养基平板上滴2个20μL的点和6个10μL的点，放置在30-34℃培养1h，如果转移质粒过大，可以考虑延长接合转移时间到2h；
7.用750μL LB洗涤平板上的细胞2次，转移细胞到1.5mL EP管中；
8.将细胞悬液涂布在添加了氯霉素和壮观霉素的培养基平板上。
待平板上长出可见克隆后，在供受体比例为80:10时，1/2体积涂布培养基平板，统计克隆数目为12个。另外在添加了氯霉素和壮观霉素的培养基平板上划线，准备制作菌株胶块，通过脉冲场电泳验证线型质粒拼接组装的阳性率。具体操作步骤如下所示：
1.将每个单克隆接种入5mL液体LB培养基，37℃过夜培养；
2.吸取1mL菌液转入1.5mL的EP管中，离心10000g，1min，去除上清液(体积1mL菌量可制作5个胶块)；
3.吸取1mL无菌水洗涤细胞1次，10000g，1min；
4.吸取1mL 50mM EDTA pH8.0洗涤细胞1次，10000g，1min；
5.吸取750μL细胞重悬缓冲液(10mM Tris·HCl pH7.2)洗涤细胞1次，10000g，1min，去除上清液；
6.向细胞沉淀再加入250μL细胞重悬缓冲液，取用100μL(因为后面需要制作2个胶块)，放置50℃水浴锅内平衡；
7.另外准备低熔点琼脂糖浓度2％的TE25S(TE25S配方：25mM Tris·HCl pH8.0，25mM EDTA pH 8.0，10.3％蔗糖；配置方法：加热溶解时注意放水中加热，防止爆沸，后放在50℃水浴锅中待取用)；
8.吸取100μL的琼脂糖溶液，加入到100μL预热的细胞悬液中，缓慢吹打均匀(此时琼脂糖胶浓度约为1％)，尽量减少气泡产生，缓慢注入洗净晾干的模具中，放冰箱4℃静置30min，让胶块凝固；
9.向2mL EP管中加入现配置好的蛋白酶K反应液(每1mL胶块加入5mL反应液，蛋白酶K反应液配置为：100mM EDTA pH8.0，0.2％脱氧胆酸钠盐，1％十二烷基基肌氨酸钠，1mg/mL蛋白酶K，配置前可以提前用无菌水配置10mg/mL蛋白酶K的母液)，50℃水浴锅中消化胶块36h，消化时间可以根据样品不同进行适度调整；
10.待胶块消化结束，胶块成透明状态，去除消化液，加入2mL Wash buffer(50mMEDTA pH8.0，20mM Tris·HCl pH8.0)洗涤胶块4次，每次洗涤时间为30-60min；
11.洗涤结束后，上样1/3体积胶块进行脉冲场凝胶电泳验证；
12.用PFGE琼脂糖制作浓度为1％的凝胶，电泳缓冲液为0.5xTBE，温度为12℃，转换时间为10-60s，角度为120°，运行时间为17h，电压梯度为6V/cm。
脉冲场电泳结果分析：受体菌MT中线型质粒p1大小为200576bp，供体菌MDS42中环型质粒p2大小为176639bp。若环型质粒p2通过接合转移方式进入受体菌株内，先经TelN/tos系统线性化后再与线型质粒p1拼接组装，若拼接组装成功，理论上会得到大小为343373bp的线型质粒pA，电泳条带位置符合我们的预期大小，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为11/11。结果如图6所示。
拼接组装方式2(BAC复制区与BAC复制区的线型质粒拼接)：供体菌株是在只含有环型质粒p4的菌株MDS42的基础上，电击转化辅助质粒pUZ8002后待用。受体菌株是基因组上携带组成型表达TelN蛋白的MDS42菌株，同时受体菌株体内只含有已经线性化的待组装线型质粒pB。然后将供体菌株的p4接合转移进入受体菌株，线性化质粒p4可通过36kb的同源区域与线型质粒pB直接拼接组装。示意图如图5所示。实验步骤参考“拼接组装方式1”的步骤。
待平板上长出可见克隆后，在供受体比例为4:1时，1/2体积涂布培养基平板，统计克隆数目为212个。另外在添加了氯霉素和壮观霉素的培养基平板上划线，准备制作菌株胶块，通过脉冲场电泳验证线型质粒拼接组装的阳性率。根据脉冲场电泳结果分析，受体菌MT中线型质粒pB大小为464352bp，供体菌MDS42中环型质粒p4大小为201291bp。若环型质粒p4通过接合转移方式进入受体菌株内，先经TelN/tos系统线性化后再与线型质粒pB拼接组装，若拼接组装成功，理论上会得到大小为621741bp的线型质粒pC，电泳条带位置符合我们的预期大小，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为7/7。结果如图7所示。
两种拼接组装方式比较：拼接组装方式1(BAC复制区与oriC复制区的线型质粒拼接)是利用复制区稳定性差异实现2个DNA片段的拼接组装，而拼接组装方式2(BAC复制区与BAC复制区的线型质粒拼接)是利用相同BAC复制区的排斥性压力完成2个DNA片段的拼接组装。拼接组装方式1中oriC复制区带动的质粒由于不含分配系统元件，所以该质粒是不稳定的。其宿主在不添加抗生素的培养基中培养传代过程中容易造成质粒丢失，且不易抽提检测菌株内环型质粒的大小。另外，oriC复制区带动的质粒接合组装效率较BAC复制区带动的质粒接合组装效率低，所以接下来的DNA大片段连续克隆拼接采用拼接组装方式2进行。
实施例3，大片段的连续拼接组装
人免疫球蛋白重链区域的连续拼接组装：从赛默飞公司购买BAC克隆文库CTD-2572O2、RP11-659B19、RP11-413L20、RP11-72N10、CTD-3074B5、CTD-2195P5、CTD-2366K3和CTD-3087C18；从睿铂赛公司购买BAC克隆文库CH17-314I7；从金斯瑞公司人工合成质粒pUC57-1。借助CRISPR/Cas9系统替换原质粒的目标区域，将BAC克隆文库各质粒依次在菌株MDS42中改造成环型质粒p1、p2、p3、p4、p5、p6、p6、p7、p8-2、p8-1和p8-3。通过连续的接合转移拼接组装方法依次获得DNA大片段组装成功的线型质粒pA、pB、pC、pD、pE、pF、p8和pG，其中p8是由质粒p8-1、p8-2和p8-3连续拼接组装得到，pG是由pF和p8拼接组转得到。
表3连续拼接组装数据统计
线型质粒的连续拼接组装：供体菌株是在只含有环型质粒的菌株MDS42的基础上，电击转化辅助质粒pUZ8002后待用。受体菌株是基因组上携带组成型表达TelN蛋白的MDS42菌株，同时受体菌株体内只含有已经线性化的待组装线型质粒。然后将供体菌株的环型质粒接合转移进入受体菌株，线性化质粒可通过同源区域与受体菌线型质粒直接拼接组装获得。
待平板上长出可见克隆后，准备制作菌株胶块，通过两种不同的脉冲场电泳条件验证线型质粒拼接组装的阳性率。根据脉冲场电泳结果分析，质粒p1和p2拼接得到大小为343373bp的线型质粒pA，这2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为11/11；质粒pA和p3拼接得到大小为464352bp的线型质粒pB，拼接成功的阳性率分别为8/8；质粒pB和p4拼接得到大小为621741bp的线型质粒pC，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为7/7；质粒pC和p5拼接得到大小为725323bp的线型质粒pD，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为5/6；质粒pD和p6拼接得到大小为850112bp的线型质粒pE，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为8/8；质粒pE和p7拼接得到大小为960384bp的线型质粒pF，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为3/5；质粒pF和p8拼接得到大小为1073650bp的线型质粒pG，2个线型质粒拼接成功的阳性率分别为3/5。结果如图8A和8B所示。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 连续克隆长DNA片段的方法和系统
<130> 209925
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tctaagcgca acggtattac ttacgttggt atatttaaaa cctaacttaa tgattttaaa 60
tgataataaa tcataccaat tgctatcaaa agttaagcga acatgctgat tttcacgctg 120
tttatacact ttgaggcatc tctatctctt ccgtctctat attgaaacac aatcaaagaa 180
catcaatcca tgtgacatcc cccactatct aagaacacca taacagaaca caacatagga 240
atgcaacatt aatgtatcaa taattcggaa catatgcact atatcatatc tcaattacgg 300
aacatatcag cacacaattg cccattatac gcgcgtataa tggactattg tgtgctgata 360
aggagaacat aagcgcagaa caatatgtat ctattccggt gttgtgttcc tttgttattc 420
tgctattatg ttctcttata gtgtgacgaa agcagcataa ttaatcgtca cttgttcttt 480
gattgtgtta cgatatccag agacttagaa acgggggaa 519
<210> 2
<211> 553
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga 60
ctcactatag ggcgaattcg agctcggtac ccggggatcc tctagagtcg acctgcaggc 120
atgcaagctt gatattccgg ggatccgtcg acctgcagtt cgaagttcct attctctaga 180
aagtatagga acttcgaagt tcccgccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg 240
ccaggtgcga ataagggaca gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac 300
ctatcctgcc cggctgacgc cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc 360
aaaatcctgt atatcgtgcg aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc 420
cgaagcaggg ttatgcagcg gaaaatgcag ctcacggtaa ctgatgccgt atttgcagta 480
ccagcgtacg gcccacagaa tgatgtcacg ctgaaaatgc cggcctttga atgggttcat 540
gtgcagctcc atc 553
<210> 3
<211> 5036
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgtcgacagc gacacacttg catcggatgc agcccggtta acgtgccggc acggcctggg 60
taaccaggta ttttgtccac ataaccgtgc gcaaaatgtt gtggataagc aggacacagc 120
agcaatccac agcaggcata caaccgcaca ccgaggttac tccgttctac aggttacgac 180
gacatgtcaa tacttgccct tgacaggcat tgatggaatc gtagtctcac gctgatagtc 240
tgatcgacaa tacaagtggg accgtggtcc cagaccgata atcagaccga caacacgagt 300
gggatcgtgg tcccagacta ataatcagac cgacgatacg agtgggaccg tggtcccaga 360
ctaataatca gaccgacgat acgagtggga ccgtggttcc agactaataa tcagaccgac 420
gatacgagtg ggaccgtggt cccagactaa taatcagacc gacgatacga gtgggaccat 480
ggtcccagac taataatcag accgacgata cgagtgggac cgtggtccca gtctgattat 540
cagaccgacg atacgagtgg gaccgtggtc ccagactaat aatcagaccg acgatacgag 600
tgggaccgtg gtcccagact aataatcaga ccgacgatac gagtgggacc gtggtcccag 660
tctgattatc agaccgacga tacaagtgga acagtgggcc cagagagaat attcaggcca 720
gttatgcttt ctggcctgta acaaaggaca ttaagtaaag acagataaac gtagactaaa 780
acgtggtcgc atcagggtgc tggcttttca agttccttaa gaatggcctc aattttctct 840
atacactcag ttggaacacg agacctgtcc aggttaagca ccattttatc gcccttatac 900
aatactgtcg ctccaggagc aaactgatgt cgtgagctta aactagttct tgatgcagat 960
gacgttttaa gcacagaagt taaaagagtg ataacttctt cagcttcaaa tatcacccca 1020
gcttttttct gctcatgaag gttagatgcc tgctgcttaa gtaattcctc tttatctgta 1080
aaggcttttt gaagtgcatc acctgaccgg gcagatagtt caccggggtg agaaaaaaga 1140
gcaacaactg atttaggcaa tttggcggtg ttgatacagc gggtaataat cttacgtgaa 1200
atattttccg catcagccag cgcagaaata tttccagcaa attcattctg caatcggctt 1260
gcataacgct gaccacgttc ataagcactt gttgggcgat aatcgttacc caatctggat 1320
aatgcagcca tctgctcatc atccagctcg ccaaccagaa cacgataatc actttcggta 1380
agtgcagcag ctttacgacg gcgactccca tcggcaattt ctatgacacc agatactctt 1440
cgaccgaacg ccggtgtctg ttgaccagtc agtagaaaag aagggatgag atcatccagt 1500
gcgtcctcag taagcagctc ctggtcacgt tcattacctg accatacccg agaggtcttc 1560
tcaacactat caccccggag cacttcaaga gtaaacttca catcccgacc acatacaggc 1620
aaagtaatgg cattaccgcg agccattact cctacgcgcg caattaacga atccaccatc 1680
ggggcagctg gtgtcgataa cgaagtatct tcaaccggtt gagtattgag cgtatgtttt 1740
ggaataacag gcgcacgctt cattatctaa tctcccagcg tggtttaatc agacgatcga 1800
aaatttcatt gcagacaggt tcccaaatag aaagagcatt tctccaggca ccagttgaag 1860
agcgttgatc aatggcctgt tcaaaaacag ttctcatccg gatctgacct ttaccaactt 1920
catccgtttc acgtacaaca ttttttagaa ccatgcttcc ccaggcatcc cgaatttgct 1980
cctccatcca cggggactga gagccattac tattgctgta tttggtaagc aaaatacgta 2040
catcaggctc gaacccttta agatcaacgt tcttgagcag atcacgaagc atatcgaaaa 2100
actgcagtgc ggaggtgtag tcaaacaact cagcaggcgt gggaacaatc agcacatcag 2160
cagcacatac gacattaatc gtgccgatac ccaggttagg cgcgctgtca ataactatga 2220
catcatagtc atgagcaaca gtttcaatgg ccagtcggag catcaggtgt ggatcggtgg 2280
gcagtttacc ttcatcaaat ttgcccatta actcagtttc aatacggtgc agagccagac 2340
aggaaggaat aatgtcaagc cccggccagc aagtgggctt tattgcataa gtgacatcgt 2400
ccttttcccc aagatagaaa ggcaggagag tgtcttctgc atgaatatga agatctggta 2460
cccatccgtg atacattgag gctgttccct gggggtcgtt accttccacg agcaaaacac 2520
gtagcccctt cagagccaga tcctgagcaa gatgaacaga aactgaggtt ttgtaaacgc 2580
cacctttatg ggcagcaacc ccgatcaccg gtggaaatac gtcttcagca cgtcgcaatc 2640
gcgtaccaaa cacatcacgc atatgattaa tttgttcaat tgtataacca acacgttgct 2700
caacccgtcc tcgaatttcc atatccgggt gcggtagtcg ccctgctttc tcggcatctc 2760
tgatagcctg agaagaaacc ccaactaaat ccgctgcttc acctattctc cagcgccggg 2820
ttattttcct cgcttccggg ctgtcatcat taaactgtgc aatggcgata gccttcgtca 2880
tttcatgacc agcgtttatg cactggttaa gtgtttccat gagtttcatt ctgaacatcc 2940
tttaatcatt gctttgcgtt tttttattaa atcttgcaat ttactgcaaa gcaacaacaa 3000
aatcgcaaag tcatcaaaaa accgcaaagt tgtttaaaat aagagcaaca ctacaaaagg 3060
agataagaag agcacatacc tcagtcactt attatcacta gcgctcgccg cagccgtgta 3120
accgagcata gcgagcgaac tggcgaggaa gcaaagaaga actgttctgt cagatagctc 3180
ttacgctcag cgcaagaaga aatatccacc gtgggaaaaa ctccaggtag aggtacacac 3240
gcggatagcc aattcagagt aataaactgt gataatcaac cctcatcaat gatgacgaac 3300
taacccccga tatcaggtca catgacgaag ggaaagagaa ggaaatcaac tgtgacaaac 3360
tgccctcaaa tttggcttcc ttaaaaatta cagttcaaaa agtatgagaa aatccatgca 3420
ggctgaagga aacagcaaaa ctgtgacaaa ttaccctcag taggtcagaa caaatgtgac 3480
gaaccaccct caaatctgtg acagataacc ctcagactat cctgtcgtca tggaagtgat 3540
atcgcggaag gaaaatacga tatgagtcgt ctggcggcct ttctttttct caatgtatga 3600
gaggcgcatt ggagttctgc tgttgatctc attaacacag acctgcagga agcggcggcg 3660
gaagtcaggc atacgctggt aactttgagg cagctggtaa cgctctatga tccagtcgat 3720
tttcagagag acgatgcctg agccatccgg cttacgatac tgacacaggg attcgtataa 3780
acgcatggca tacggattgg tgatttcttt tgtttcacta agccgaaact gcgtaaaccg 3840
gttctgtaac ccgataaaga agggaatgag atatgggttg atatgtacac tgtaaagccc 3900
tctggatgga ctgtgcgcac gtttgataaa ccaaggaaaa gattcatagc ctttttcatc 3960
gccggcatcc tcttcagggc gataaaaaac cacttccttc cccgcgaaac tcttcaatgc 4020
ctgccgtata tccttactgg cttccgcaga ggtcaatccg aatatttcag catatttagc 4080
aacatggatc tcgcagatac cgtcatgttc ctgtagggtg ccatcagatt ttctgatctg 4140
gtcaacgaac agatacagca tacgtttttg atcccgggag agactatatg ccgcctcagt 4200
gaggtcgttt gactggacga ttcgcgggct atttttacgt ttcttgtgat tgataaccgc 4260
tgtttccgcc atgacagatc catgtgaagt gtgacaagtt tttagattgt cacactaaat 4320
aaaaaagagt caataagcag ggataacttt gtgaaaaaac agcttcttct gagggcaatt 4380
tgtcacaggg ttaagggcaa tttgtcacag acaggactgt catttgaggg tgatttgtca 4440
cactgaaagg gcaatttgtc acaacacctt ctctagaacc agcatggata aaggcctaca 4500
aggcgctcta aaaaagaaga tctaaaaact ataaaaaaaa taattataaa aatatccccg 4560
tggataagtg gataacccca agggaagttt tttcaggcat cgtgtgtaag cagaatatat 4620
aagtgctgtt ccctggtgct tcctcgctca ctcgagggct tcgccctgtc gctcaactgc 4680
ggcgagcact actggctgta aaaggacaga ccacatcatg gttctgtgtt cattaggttg 4740
ttctgtccat tgctgacata atccgctcca cttcaacgta acaccgcacg aagatttcta 4800
ttgttcctga aggcatattc aaatcgtttt cgttaccgct tgcaggcatc atgacagaac 4860
actacttcct ataaacgcta cacaggctcc tgagattaat aatgcggatc tctacgataa 4920
tgggagattt tcccgactgt ttcgttcgct tctcagtgga taacagccag cttctctgtt 4980
taacagacaa aaacagcata tccactcagt tccacatttc catataaagg ccaagg 5036
<210> 4
<211> 4451
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgcgttgcc tggtaagcgg gtgcttacca ggcattttta atgcgttatg cgctacgacg 60
cagcataccc tgttttttca gccacaccag cagaatggag atggccgcag gcgtgacgcc 120
agaaatacgc gaagcttggc cgatagaggc tggtttgtga tcgttaagtt tggcgatcac 180
ttcgttagaa agaccggata cctggcggta atccagtgtc gcgggtagca gggtgttctc 240
gttacgcagc tgcttttcga tctcatcttg ctggcgcgcg atataacctt cgtatttaac 300
ctgaatctca acctgttccg ccgcctgttc gtctgtcaac gcaggggcaa acggcgtcag 360
cgtggttaat ttttcataag tcatttccgg acgacgcagc agatcttcac cactggcttc 420
acgggaaagc ggcgcagtca ggtgagcatt cacttcggct gcagcttccg ccgacggggt 480
tacccaggtc gatttcagac gctgacgctc acgctcgata ttctcaagtt tctcgttaaa 540
gcgcgcccaa cgttcgtcat ccaccaggcc cagttcacga ccgatttcag tcaaacgcag 600
atccgcatta tcttcgcgta gcatcagacg atattctgcg cgcgaagtaa acatacgata 660
cggttctttg gttcctaaag tgcacaggtc atcaactagt acgccgagat acgcctgaga 720
acgtgccgga gcccaacctt ctttgtcagc agacagacgg gcagcgttaa gaccggccag 780
caaaccttgc gcagcggctt cttcgtaacc ggtagtgccg ttaatctgac cagcaaagaa 840
cagcccctgg ataaacttgc tctccagcgt cggtttcagg tcgcgaggat cgaagaagtc 900
atactcaatg gcataacccg gacgcacgat cttcgcgttt tccatcccct gcatagagcg 960
gacgatttgc atctgcacat cgaacggcag gctggtggag ataccgttcg gataaatttc 1020
attagaggtc agtccttccg gttcaaggaa gatctgatgc tgatttctgt cggcgaagcg 1080
catgactttg tcttcgatcg acgggcagta gcgtgggccg acaccttcga tcacccctgc 1140
gtacattggg ctacgatcga ggttactgcg gatcacatca tgggttttct cgttggtatg 1200
agtgatataa cacggcacct gctggggatg ctgggacgca ttgcccataa acgagaatac 1260
cggcattggg ttatcgccat gctgttgcgc cagtacgcta aagtcgatgg ttcgagcatc 1320
aatacgcggt ggtgtcccgg ttttcagacg accaacgcgc agcggcagtt cacgcaaacg 1380
gcgagaaagc ggaatggacg gcggatcacc agcacggcca ccgctgtaat tatccagacc 1440
gatatgaatt ttaccgtcga ggaacgtccc aacggtgagc acgacggctt tggcacggaa 1500
cttcagtccc atttgggtaa cagcaccgac cacgcgatcg ttttcgacaa taagatcttc 1560
aaccgcctgc tggaagatca tcaggttcgg ttggttctcc agcgccgtac gtaccgcctg 1620
acggtagagc acacgatccg cctgagctcg ggtagcgcga accgccggtc ctttgcttgc 1680
gtttagtatc ctaaactgga tacccgcctg atcgatcgct ttcgccatca gaccgccgag 1740
tgcatccact tcttttacca gatgtccctt cccaataccg ccgatcgccg ggttgcagct 1800
catctgcccc agagtgtcga tattgtgtgt caaaagcaga gtctgttgac ccatacgcgc 1860
cgcggccatc gcggcctcgg tgcctgcatg acccccgcca atgatgatga cgtcaaaagg 1920
atccggataa aacatggtga ttgcctcgca taacgcggta tgaaaatgga ttgaagcccg 1980
ggccgtggat tctactcaac tttgtcggct tgagaaagac ctgggatcct gggtattaaa 2040
aagaagatct atttatttag agatctgttc tattgtgatc tcttattagg atcgcactgc 2100
cctgtggata acaaggatcc ggcttttaag atcaacaacc tggaaaggat cattaactgt 2160
gaatgatcgg tgatcctgga ccgtataagc tgggatcaga atgaggggtt atacacaact 2220
caaaaactga acaacagttg ttctttggat aactaccggt tgatccaagc ttcctgacag 2280
agttatccac agtagatcgc acgatctgta tacttatttg agtaaattaa cccacgatcc 2340
cagccattct tctgccggat cttccggaat gtcgtgatca agaatgttga tcttcagtgt 2400
ttcgcctgtc tgttttgcac cggaattttt gagttctgcc tcgagtttat cgatagcccc 2460
acaaaaggtg tcatattcac gactgccaat accgattgcg ccaaagcgga ctgcagaaag 2520
atcgggcttc tgttcctgca atgcttcata gaaaggagaa aggttgtccg gaatatctcc 2580
ggcaccgtgg gtggagctga taaccagcca gatccctgag gcaggtaaat cttctaacag 2640
cggaccgtgc agcgtttcgg tggtaaaacc cgcctcttcc agcttttcag ccaggtgttc 2700
tgctacatat tcggcaccgc cgagggtgct gccgctgata agagtgatat ctgccataaa 2760
ccgccacctt tattaagagt ggcgtattgt acgctgtgaa cgcgttggga tctacctgtg 2820
gaaaagtatg ggattaaaaa agccgatcag ggcttgatgg tacgcatgat cgggttttgc 2880
aggacgatca atgtctcggt ggactgaatt tcatcaattg tttggatctt gttgataagt 2940
acatgctgga gagcgtcgat cgaacggcac atcactttta taaagatgct gtagtggccg 3000
gttgtgtaat aggcttcagt gacttcatca aggctttcca gctttgccag cgcggaaggg 3060
tagtctttgg cgctctttaa tataatgccg ataaagcagc ctacgtcata accgagctgc 3120
ttcgggctga catcaatacg cgccccggta atgatccccg cctgcttcat tttctctact 3180
cgaacgtgaa tcgtccccgg actgacgcca aattgtttcg ccagttcggc gtaagcggtg 3240
cgcgcattgc ccattaatgc ttccaggatg ccacggtcca gattgtcgat cagataattt 3300
tccataggat tttcttatgc ggattgatga ttcattctat tttagccttc ttttttaatg 3360
aatcaaaagt gagttaggct ttttattgaa tgattattgc atgtgtgtcg gtttttgttg 3420
cttaatcata agcaacagga cgcaggagta taaaaaatga aaaccgctta cattgccaaa 3480
caacgtcaaa ttagcttcgt gaaatctcac ttttctcgtc aactggaaga acgtctgggg 3540
ctgatcgaag tccaggcgcc gattcttagc cgtgtggggg atggcacgca ggataacttg 3600
tcgggctgtg aaaaagcggt gcaggtaaaa gtgaaagctc tgcctgatgc ccagttcgaa 3660
gtggttcatt cactggcgaa gtggaaacgt cagaccttag ggcaacacga cttcagcgcg 3720
ggcgaagggc tgtacacgca catgaaagcc cttcgccccg atgaagaccg tctttctccg 3780
ttgcactcgg tctatgttga ccagtgggac tgggaacgcg taatgggcga cggtgagcgt 3840
caattctcga ctctgaaaag cacggtagag gcgatctggg cgggaattaa agcaaccgaa 3900
gctgcggtta gcgaagagtt tggcctggca ccgttcctgc cggatcagat ccacttcgta 3960
cacagccagg agttactgtc tcgttatccg gatcttgatg ccaaagggcg tgagcgggcg 4020
atagcgaaag atcttggcgc ggtattcctt gtcgggattg gcggcaagct gagcgatggt 4080
catcgccacg acgtgcgcgc accggattat gatgactgga gcaccccgtc agagctgggc 4140
catgcgggtc tgaacggcga tattctggtg tggaacccgg tactggaaga tgcgtttgag 4200
ctttcctcca tggggatccg tgtagatgcc gacacgctga agcatcaact ggcgctgacc 4260
ggtgacgaag atcgcctgga gctggagtgg catcaggcgc tgctgcgcgg tgaaatgccg 4320
cagaccatcg gcggcggtat cggccagtct cgtttgacta tgctgctgct gcaactgccg 4380
catatcggcc aggttcagtg tggagtatgg ccagctgctg ttcgcgagag cgtcccttct 4440
ctgctgtaat a 4451
<210> 5
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Met Ser Lys Val Lys Ile Gly Glu Leu Ile Asn Thr Leu Val Asn Glu
1 5 10 15
Val Glu Ala Ile Asp Ala Ser Asp Arg Pro Gln Gly Asp Lys Thr Lys
20 25 30
Arg Ile Lys Ala Ala Ala Ala Arg Tyr Lys Asn Ala Leu Phe Asn Asp
35 40 45
Lys Arg Lys Phe Arg Gly Lys Gly Leu Gln Lys Arg Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Thr Phe Asn Ala Tyr Met Ser Arg Ala Arg Lys Arg Phe Asp Asp Lys
65 70 75 80
Leu His His Ser Phe Asp Lys Asn Ile Asn Lys Leu Ser Glu Lys Tyr
85 90 95
Pro Leu Tyr Ser Glu Glu Leu Ser Ser Trp Leu Ser Met Pro Thr Ala
100 105 110
Asn Ile Arg Gln His Met Ser Ser Leu Gln Ser Lys Leu Lys Glu Ile
115 120 125
Met Pro Leu Ala Glu Glu Leu Ser Asn Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly
130 135 140
Ser Asp Ala Lys Ile Ala Arg Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Asp Trp Ser
145 150 155 160
Phe Ala Leu Ser Asp Leu Asn Ser Asp Asp Trp Lys Glu Arg Arg Asp
165 170 175
Tyr Leu Tyr Lys Leu Phe Gln Gln Gly Ser Ala Leu Leu Glu Glu Leu
180 185 190
His Gln Leu Lys Val Asn His Glu Val Leu Tyr His Leu Gln Leu Ser
195 200 205
Pro Ala Glu Arg Thr Ser Ile Gln Gln Arg Trp Ala Asp Val Leu Arg
210 215 220
Glu Lys Lys Arg Asn Val Val Val Ile Asp Tyr Pro Thr Tyr Met Gln
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Asp Ile Leu Asn Asn Pro Ala Thr Leu Phe Ser Leu Asn
245 250 255
Thr Arg Ser Gly Met Ala Pro Leu Ala Phe Ala Leu Ala Ala Val Ser
260 265 270
Gly Arg Arg Met Ile Glu Ile Met Phe Gln Gly Glu Phe Ala Val Ser
275 280 285
Gly Lys Tyr Thr Val Asn Phe Ser Gly Gln Ala Lys Lys Arg Ser Glu
290 295 300
Asp Lys Ser Val Thr Arg Thr Ile Tyr Thr Leu Cys Glu Ala Lys Leu
305 310 315 320
Phe Val Glu Leu Leu Thr Glu Leu Arg Ser Cys Ser Ala Ala Ser Asp
325 330 335
Phe Asp Glu Val Val Lys Gly Tyr Gly Lys Asp Asp Thr Arg Ser Glu
340 345 350
Asn Gly Arg Ile Asn Ala Ile Leu Ala Lys Ala Phe Asn Pro Trp Val
355 360 365
Lys Ser Phe Phe Gly Asp Asp Arg Arg Val Tyr Lys Asp Ser Arg Ala
370 375 380
Ile Tyr Ala Arg Ile Ala Tyr Glu Met Phe Phe Arg Val Asp Pro Arg
385 390 395 400
Trp Lys Asn Val Asp Glu Asp Val Phe Phe Met Glu Ile Leu Gly His
405 410 415
Asp Asp Glu Asn Thr Gln Leu His Tyr Lys Gln Phe Lys Leu Ala Asn
420 425 430
Phe Ser Arg Thr Trp Arg Pro Glu Val Gly Asp Glu Asn Thr Arg Leu
435 440 445
Val Ala Leu Gln Lys Leu Asp Asp Glu Met Pro Gly Phe Ala Arg Gly
450 455 460
Asp Ala Gly Val Arg Leu His Glu Thr Val Lys Gln Leu Val Glu Gln
465 470 475 480
Asp Pro Ser Ala Lys Ile Thr Asn Ser Thr Leu Arg Ala Phe Lys Phe
485 490 495
Ser Pro Thr Met Ile Ser Arg Tyr Leu Glu Phe Ala Ala Asp Ala Leu
500 505 510
Gly Gln Phe Val Gly Glu Asn Gly Gln Trp Gln Leu Lys Ile Glu Thr
515 520 525
Pro Ala Ile Val Leu Pro Asp Glu Glu Ser Val Glu Thr Ile Asp Glu
530 535 540
Pro Asp Asp Glu Ser Gln Asp Asp Glu Leu Asp Glu Asp Glu Ile Glu
545 550 555 560
Leu Asp Glu Gly Gly Gly Asp Glu Pro Thr Glu Glu Glu Gly Pro Glu
565 570 575
Glu His Gln Pro Thr Ala Leu Lys Pro Val Phe Lys Pro Ala Lys Asn
580 585 590
Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Lys Ile Glu Phe Glu Tyr Asp Gly Lys His
595 600 605
Tyr Ala Trp Ser Gly Pro Ala Asp Ser Pro Met Ala Ala Met Arg Ser
610 615 620
Ala Trp Glu Thr Tyr Tyr Ser
625 630
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagctacta gagaaagagg agaaatacta 60
g 61
Claims (10)
1.一种多核苷酸，用于构建长DNA片段，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点或其互补序列能被切割酶切割，
优选地，所述多核苷酸还包含用于整合目的片段的5’同源臂和3’同源臂，所述目的片段是所述长DNA片段的一部分；更优选地，所述双链切割识别位点、转移起始位点oriT和复制起点位于5’同源臂和3’同源臂之间。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述双链切割识别位点是tos位点，所述切割酶是TelN，
优选地，
tos位点来源于噬菌体N15，和/或
转移起始位点oriT来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，和/或
复制起点来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，和/或
所述多核苷酸还包含标记基因，和/或
转移起始位点oriT和复制起点的位置可互换；
更优选地，
tos位点序列包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列，和/或
转移起始位点oriT包含SEQ ID NO:2所示的序列，和/或
复制起点包含SEQ ID NO:3或4所示的序列，和/或
标记基因位于5’同源臂和3’同源臂之间，和/或
标记基因位于转移起始位点oriT和复制起点之间，和/或
标记基因位于复制起点的3’端，和/或
双链切割识别位点位于复制起点的5’端。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸依次包含：
5’同源臂，复制起点，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，3’同源臂；
5’同源臂，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点，3’同源臂；
5’同源臂，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，复制起点，3’同源臂；
5’同源臂，复制起点，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，3’同源臂；
5’同源臂，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，3’同源臂；或
5’同源臂，双链切割识别位点，复制起点，转移起始位点oriT，3’同源臂。
4.一种核酸构建物，包含权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸和目的片段，用于构建长DNA片段，
优选地，
所述目的片段是长DNA片段的一部分，和/或
所述长DNA片段的长度至少2kb，和/或
所述目的片段的长度为至少1kb，和/或
所述核酸构建物是环形构建物，或所述核酸构建物是线性构建物并且其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割。
5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含：(1)第一核酸构建物，其具有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸和第一目的片段，(2)第二核酸构建物，其具有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸和第二目的片段，其中第一目的片段的3’端与第二目的片段的5’端具有1kb-200kb的重叠区域，
优选地，第一核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割；第二核酸构建物是环形构建物。
6.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，第一核酸构建物与第二核酸构建物分别具有标记基因，其中，
第一核酸构建物具有一种或两种标记基因，且满足以下条件：(1)至少一种标记基因位于第一目的片段的5’端，并且任选地(2)双链切割识别位点位于所述至少一种标记基因的5’端；优选地，两种标记基因不同；更优选地，两种标记基因分别位于第一目的片段的5’端和3’端，
第二核酸构建物的标记基因位于第二目的片段的3’端，并且双链切割识别位点位于所述标记基因的3’端，
优选地，第一核酸构建物与第二核酸构建物中的标记基因均不相同。
7.一种宿主细胞，包含权利要求4-6中任一项所述的核酸构建物，
优选地，所述核酸构建物是环形构建物，并且所述宿主细胞不表达针对所述双链切割识别位点的切割酶，所述宿主细胞还任选包含接合转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002；或者，所述核酸构建物是线性构建物，并且所述宿主细胞表达针对所述双链切割识别位点的切割酶，
更优选地，所述宿主细胞是肠杆菌科细菌。
8.一种构建长DNA片段或使目的片段整合成较长片段的方法，包括：
(1)在使宿主细胞发生接合转移的条件下使受体宿主细胞和供体宿主细胞接触，其中，
所述受体宿主细胞包含权利要求5或6中所述的第一核酸构建物，所述核酸构建物是线性构建物，其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割，
所述供体宿主细胞包含权利要求5或6中所述的第二核酸构建物，所述核酸构建物是环形构建物；
(2)孵育受体宿主细胞，所述第一目的片段和所述第二目的片段发生同源重组，所述同源重组获得具有第一目的片段和第二目的片段的第三核酸构建物，
优选地，
所述受体宿主细胞表达针对所述双链切割识别位点的切割酶，和/或
所述供体宿主细胞不表达针对所述双链切割识别位点的切割酶，和/或
所述供体宿主细胞还包含接合转移辅助质粒或其具有引导接合转移的功能片段，例如pUZ8002，
更优选地，所述方法还包括
(0.1)利用5’同源臂和3’同源臂将权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸与第一目的片段整合，获得包含所述第一核酸构建物的受体宿主细胞，
(0.2)利用5’同源臂和3’同源臂将权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸与第二目的片段整合，获得包含所述第二核酸构建物的供体宿主细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述使宿主细胞发生接合转移的条件包括：
供体宿主细胞与受体宿主细胞的总浓度为108个/mL；和/或
供体宿主细胞与受体宿主细胞的比例为10:1-1:10；和/或
培养温度25-40℃。
10.一种用于构建长DNA片段或使目的片段整合成较长片段的系统，包含权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸、权利要求4-6中任一项所述的核酸构建物、或权利要求7所述的宿主细胞。
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| CN202110171187.1A CN114908111B (zh) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | 连续克隆长dna片段的方法和系统 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102876702B (zh) * | 2012-10-15 | 2014-08-20 | 中国科学院微生物研究所 | 一种具有广泛宿主的穿梭表达载体 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101016551A (zh) * | 2007-02-01 | 2007-08-15 | 南京师范大学 | 一种在dna载体中同时引入多个dna片段的方法 |
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