CN114907990A - 一种链格孢菌及其用于去除废硅藻土中蛋白质的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种链格孢菌及其用于去除废硅藻土中蛋白质的应用。所述格孢菌，菌株号为ZG‑2‑3‑2，分类命名为互隔交链孢霉（Alternaria alternata），保藏编号为CGMCC No.40150。所述链格孢菌筛选自啤酒过滤工艺产生的废硅藻土，可用于去除废硅藻土中蛋白质。本发明的优点：1）本发明利用筛选的真菌菌株去除硅藻土中的蛋白质，解决了热再生硅藻土能耗高、化学再生硅藻土会造成二次污染等问题。2）本发明的真菌，菌种来源于啤酒厂过滤工艺产生的废硅藻土，经过驯化获得，降低了由于环境差异而导致的应用时的适应过程。3）本发明的真菌在去除废硅藻土中蛋白质的过程中，表现出较高的去除率。

Description

一种链格孢菌及其用于去除废硅藻土中蛋白质的应用

技术领域

本发明属于利用真菌处理环境污染技术领域，具体涉及一种可以高效去除废硅藻土中蛋白质的真菌及其筛选方法和应用。

背景技术

硅藻土是一种重要的和不可再生的矿物资源，主要由二氧化硅（SiO₂）组成。硅藻土表面有许多气孔，大部分气孔较大。由于其稳定的化学性质和丰富的孔隙结构，常用于啤酒生产中作为助滤剂吸附溶液中的杂质（如燕麦渣、细菌、胶体沉淀、碳水化合物等）。工业生产中使用硅藻土助滤剂可显著提高过滤速度，提高滤液质量，提高澄清程度。但硅藻土在使用后，其中的孔被溶液中的大分子有机物堵塞，导致其吸附效率降低，不能够被再利用，硅藻土就会变成废土。

目前，大多数啤酒厂采用垃圾填埋法处理废硅藻土。由于废硅藻土中含有酵母、蛋白质等有机杂质，直接填埋处理会占用大量土地，并向大气中释放一氧化碳和二氧化碳。此外，填埋处理废硅藻土还会污染地下水。如果可以回收利用，则可以节约原材料和降低生产成本，从而提高啤酒企业在市场上的竞争力。因此，废硅藻土的处理受到越来越多的关注，开发环保、经济的再生方法也成为一项重要的目标。

目前，废硅藻土再生的方法主要有高温热再生法和化学再生（包括酸、碱、盐或酶再生）法。但两种方法都存在问题，前者耗能大，且再生后易使硅藻土结构单元崩解；而后者再生后产生的废液等会造成二次污染。相对而言，生物再生法具有良好的经济效益，可以为啤酒厂节省处理废硅藻土的资金，且不会造成环境污染。但目前关于生物再生的报道几乎没有。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于去除废硅藻土中蛋白质等杂质的链格孢菌，其能够快速、高效地去除废硅藻土中的蛋白质，并能够解决热再生硅藻土能耗高、化学再生硅藻土会造成二次污染等问题。

本发明筛选得到了一株链格孢菌，菌株号为ZG-2-3-2，分类命名为互隔交链孢霉（Alternaria alternata），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 40150，保藏日期为2022年3月22日。

上述的链格孢菌筛选自啤酒过滤工艺产生的废硅藻土。

上述用于去除废硅藻土中蛋白质等杂质的链格孢菌的筛选方法如下：

1）采集啤酒厂过滤工艺产生的废硅藻土为接种源，取一定量的废硅藻土加入到富集培养基中，连续富集培养二十天；

2）将步骤1）培养得到的菌悬液按比例稀释后均匀涂布到酪蛋白培养基中，培养得到蛋白质水解圈大的多株真菌；

3）将步骤2）中得到的多株真菌分别采用连续划线的方法接种到分离培养基中，进行纯化培养；

4）将步骤3）的中得到的各株纯化菌株接种于液体酪蛋白培养基（不加琼脂）中培养至对数期后，测定其各自的蛋白质降解能力，得出最优菌株；

5）将上述步骤4）中得到的最优菌株接种到富集培养基中，待细菌生长至对数期后即得到用于可以用于去除废硅藻土中蛋白质的链格孢菌。

上述各种培养基组成如下：

富集培养基：蛋白胨5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，无菌去离子水定容至1 L，调节pH至7.0。

分离培养基：向以上富集培养基中加入20 g琼脂。

PDA培养基：土豆200g熬煮后滤液1000ml，葡萄糖 20g，琼脂 15～20g，加热后加水定容至1L。

酪蛋白培养基：酪蛋白4 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KH₂PO₄ 0.36 g，Na₂HPO₄·10H₂O1.070 g，NaCl 0.16 g，CaCl₂ 0.002 g，FeSO₄·6H₂O 0.002 g，ZnCl₂ 0.014 g，琼脂20 g，无菌去离子水定容至1 L，调节pH至6.5~7.0。

以上培养基均在121 ℃、0.1 MPa条件下湿式灭菌20 min。

所筛选链格孢菌可在胞外中性金属蛋白酶、未封闭氨基肽酶、YPDF氨基肽酶、d -丙氨酸- d -丙氨酸羧肽酶、耐高温羧肽酶1和氨基肽酶PEPA的作用下降解蛋白质。这些酶从游离羧基端或游离氨基端水解肽，生成游离氨基酸。在蛋白质降解过程中，氨氮浓度在48h后达到最高水平，这说明该真菌将蛋白质水解，并得到氨或氨离子。

本发明的第二个目的是提供上述链格孢菌用于去除废硅藻土中蛋白质的应用。

本发明应用链格孢菌去除硅藻土中的蛋白质，具有以下优点：

1、本发明利用筛选的真菌菌株去除硅藻土中的蛋白质，解决了热再生硅藻土能耗高、化学再生硅藻土会造成二次污染等问题。

2、本发明的真菌，菌种来源于啤酒厂过滤工艺产生的废硅藻土，经过驯化获得，降低了由于环境差异而导致的应用时的适应过程。

3、本发明的真菌在去除废硅藻土中蛋白质的过程中，表现出较高的去除率。

附图说明

图1 是本发明真菌的系统发育树。

图2 是不同时间去除废硅藻土蛋白质的去除效率图。

图3 的不同硅藻土的扫描电镜图。

其中，a：新硅藻土；b：废硅藻土；c：生物再生硅藻土。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1：

1、用于去除废硅藻土中蛋白质等杂质的真菌的筛选

1）取5g硅藻土加入到有100ml富集培养基的锥形瓶中，将锥形瓶用铝箔封口后置于恒温摇床，30℃，120r/min振荡30min，使沉积物中的细菌充分释放出来。

振荡结束后静置30min，待沉积物重新沉淀，得到的上清液为菌悬液；将菌悬液重新加入到有100ml富集培养基的锥形瓶中有100ml富集培养基的锥形瓶中，将锥形瓶用铝箔封口后置于恒温摇床，30℃，120r/min振荡培养5天。5天后取9mL富集培养液加入到新的有100ml富集培养基的锥形瓶中，继续培养。连续重复四次，培养20天。

2）将筛选得到的富集液按照梯度稀释法均匀涂布到酪蛋固体培养基上，放置在30℃恒温培养箱中30℃培养，待菌落长出后，挑取蛋白质水解圈大的菌株采用连续划线法分离到分离培养基中，继续放置在恒温培养箱中30℃培养。

3）将分离得到的各株单菌分别挑取至有100ml相同浓度液体酪蛋白的锥形瓶中，将锥形瓶用铝箔封口后置于恒温摇床，30℃，120r/min振荡两天后。采用Bardford法测定培养基中剩余蛋白质的浓度；采用酶活试剂盒测定真菌的蛋白酶活性，综合比较从而得到一株能够高效降解蛋白质的真菌。

2、菌株的鉴定

实例1中步骤3）得到的真菌使用离心管于4℃，6000r/min离心10min，倒掉上清液，收集沉淀，采用 omega HP 真菌 DNA 提取试剂盒（货号 D3195）提取基因组的样品。DNA提取方法参考DNA提取试剂盒说明书。采用 TOYOBO 公司的高保真 PCR 聚合酶产品 KOD OneTM PCR Master Mix （货号 KMM-101）进行 PCR 实验。采用引物5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'与ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行PCR扩增。本实验的 PCR 产物条带理论大小约为 1500 bp 左右，采用双向引物测序，测序结果采用 DNAMAN 软件进行拼接处理。

采用ITS（Internal Transcribed Spacer）法对其进行系统鉴定，对真菌的ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列进行比较，从而获得所得真菌的种属信息。本实验采用 Sanger 法对 PCR 产物进行测序，设备为 ABI 3730XL 基因测序仪，其全序列如SEQ ID No：1所示。测序后，用GenBank中的BLAST程序搜索序列，确定相似菌株。采用BioEdit和Mega5.1软件进行序列分析，绘制细菌系统的系统发育树。该菌与Alternaria alternata strain ZG-2-3-2同源性最高。

对筛选得到的链格孢菌进行保藏，菌株号为ZG-2-3-2，分类命名为互隔交链孢霉（Alternaria alternata），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 40150，保藏日期为2022年3月22日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

实施例2：本发明菌株对废硅藻土中蛋白质的去除效果

将实施例1筛选得到的菌株接种于富集培养基中培养至对数期（OD600约为1.0），并使用0.85%无菌生理盐水制成菌悬液。向100 g经冻干处理的废硅藻土中加入5 mL 该菌悬液（含游离的菌株1×10¹⁰ cells左右，分为混合菌株和单菌株）。

每日测定废硅藻土中蛋白的含量，废硅藻土中的蛋白质采用碱法提取，用pH为12的氢氧化钠溶液为浸提溶剂：液固比为40/1 (v/w)、浸提温度70℃、浸提时间1h。提取完成后，浸提液经0.45μm滤膜过滤，采用Bradford法测定蛋白含量。

如图2所示，结果表明，废硅藻土中的蛋白浓度在前5天从14.00 mg/g急剧下降到8.55 mg/g，降幅约为40%。在本实验过程中，观察到真菌的菌丝(白色絮体)从硅藻土中生长出来，并覆盖在土的表面。这也证实了ZG-1在废硅藻土中生长效果良好，该蛋白可以通过菌株的生物降解被去除。5 天后，随着菌株代谢活性的增加，蛋白质降解效率下降。在第13、14天，废硅藻土的蛋白质含量达到最低。最终的去除率可达50%以上。

经过生物再生处理后，收集再生硅藻土样品，风干后置于干燥器中保存、备用。

对新硅藻土、废硅藻土、生物再生硅藻土进行特性表征，将三种硅藻土干燥研磨，过40目筛，采用扫描电子显微镜（Hitachi S-4800）观察其微观形态（如图3）；三种硅藻土的比表面积、总孔体积等结构特征采用比表面积分析仪（ASAP-2020）测定。结果表明，经过生物处理后，废硅藻土的比表面积由16.50增加到27.40 m²/g，增加了66.06%。本实验再生的硅藻土的结构保存的十分完整，且相对于废硅藻土来说，其大部分孔隙都被释放出来了。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种链格孢菌及其用于去除废硅藻土中蛋白质的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 547

<212> DNA

<213> 互隔交链孢霉(Alternaria alternata)

<400> 1

gtactgcgga gggatcatta cacaaatatg aaggcgggct ggaacctctc ggggttacag 60

ccttgctgaa ttattcaccc ttgtcttttg cgtacttctt gtttccttgg tgggttcgcc 120

caccactagg acaaacataa accttttgta attgcaatca gcgtcagtaa caaattaata 180

attacaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 240

cgataagtag tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg 300

ccctttggta ttccaaaggg catgcctgtt cgagcgtcat ttgtaccctc aagctttgct 360

tggtgttggg cgtcttgtct ctagctttgc tggagactcg ccttaaagta attggcagcc 420

ggcctactgg tttcggagcg cagcacaagt cgcactctct atcagcaaag gtctagcatc 480

cattaagcct ttttttcaac ttttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa 540

gcatatc 547

Claims (5)

1.一种链格孢菌，其特征在于，其菌株号为ZG-2-3-2，分类命名为互隔交链孢霉（Alternaria alternata），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 40150，保藏日期为2022年3月22日。

2.一种权利要求1所述链格孢菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）采集啤酒厂过滤工艺产生的废硅藻土为接种源，取一定量的废硅藻土加入到富集培养基中，连续富集培养二十天；

2）将步骤1）培养得到的菌悬液按比例稀释后均匀涂布到酪蛋白培养基中，培养得到蛋白质水解圈大的多株真菌；

3）将步骤2）中得到的多株真菌分别采用连续划线的方法接种到分离培养基中，进行纯化培养；

4）将步骤3）的中得到的各株纯化菌株接种于不加琼脂的液体酪蛋白培养基中培养至对数期后，测定其各自的蛋白质降解能力，得出最优菌株；

5）将上述步骤4）中得到的最优菌株接种到富集培养基中，待细菌生长至对数期后即得到用于可以用于去除废硅藻土中蛋白质的链格孢菌。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述富集培养基的组成：蛋白胨5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，无菌去离子水定容至1 L，调节pH至7.0。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述酪蛋白培养基的组成：酪蛋白4g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KH₂PO₄ 0.36 g，Na₂HPO₄·10H₂O 1.070 g，NaCl 0.16 g，CaCl₂ 0.002g，FeSO₄·6H₂O 0.002 g，ZnCl₂ 0.014 g，琼脂20 g，无菌去离子水定容至1 L，调节pH至6.5～7.0。

5.权利要求1所述链格孢菌用于去除废硅藻土中蛋白质的应用。

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