CN114901809A - 用于在血源性样品中产生免疫调节性细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：提供源自受试者的血液样品的样品，所述受试者已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状；向所述样品中添加光增敏剂；以及使所述样品经受照射，这优选地在所述样品中产生免疫调节性NK细胞。在各实施例中，所述光增敏剂是8‑甲氧基补骨脂素和/或所述照射是UVA照射。在另一方面，本发明涉及免疫调节性NK细胞，其从包括以下步骤的方法获得：提供源自受试者的所分离的血液样品的样品；向所述样品中添加光增敏剂；以及使所述样品经受照射。此外，本发明涵盖用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的irAE的免疫调节性NK细胞。

Description

用于在血源性样品中产生免疫调节性细胞的方法
说明
本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：提供源自受试者的血液样品的样品，所述受试者已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状；向所述样品中添加光增敏剂；以及使所述样品经受照射，这优选地在所述样品中产生免疫调节性NK细胞。在各实施例中，所述光增敏剂是8-甲氧基补骨脂素和/或所述照射是UVA照射。在另一方面，本发明涉及免疫调节性NK细胞，其从包括以下步骤的方法获得：提供源自受试者的所分离的血液样品的样品；向所述样品中添加光增敏剂；以及使所述样品经受照射。此外，本发明涵盖用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的irAE的免疫调节性NK细胞。
背景技术
免疫检查点是免疫系统的调节分子并且在维持免疫稳态和自身耐受性方面起着重要的作用。所鉴定的第一免疫检查点包含细胞毒性T淋巴细胞蛋白-4(CTLA-4)以及程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)。CTLA-4在T细胞的表面上表达，结合到抗原呈递细胞上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)分子，并且用作T细胞的负调节因子。PD-1还通过与其配体的相互作用而对T细胞活性具有负面作用，所述配体包含程序性死亡配体-1(PD-L1)和程序化死亡配体-2(PD-L2)。与CTLA-4不同，PD-1不仅可见于T细胞上，并且还在许多免疫细胞上广泛表达，所述免疫细胞包含B细胞和自然杀伤细胞。在健康的个体中，CTLA-4和PD-1的表面表达受到严格且动态地调节。
在癌症发展期间，恶性细胞通过活化免疫检查点来抑制免疫应答。先前的研究已经显示出PD-L1在各种癌症中表达。在肿瘤微环境中，由癌细胞表达的PD-L1与T细胞的表面上的PD-1相互作用以抑制T细胞的效应子功能。另外，许多研究已经证明PD-L1的高肿瘤表达与癌的不良预后显著相关。这些研究表明PD-1信号传导通路阻断对癌症有治疗效果。
最近的临床试验已经揭示出，若干种抗PD-1和抗PD-L1免疫检查点抑制剂(ICI)对各种癌症，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和头颈癌中有效。目前正在进行另外的临床试验以扩展ICI的适应症。迄今为止，美国食品与药物管理局(FDA)已经批准了用于治疗不同类型的癌症的三种抗PD-1抗体，即纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和西米普利单抗(cemiplimab)，以及三种抗PD-L1抑制剂，即阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。
随着ICI的使用增加，与此类别的药物相关的不良事件已经变成了重要问题。ICI具有与常规细胞毒性化学疗法相比不同的毒性谱。与ICI引起的免疫系统活性增加相关联的副作用称为免疫相关不良事件(irAE)，可以影响身体的多个器官，所述器官包含皮肤、肠胃道、内分泌系统、肝脏、肺、神经系统和骨骼肌系统。
例如利用抗CTLA4和抗PD-1抗体的组合免疫检查点抑制剂疗法是恶性黑色素瘤的有效一线治疗方法。然而，大约50％的患者会出现严重的免疫相关不良事件(irAE)1,2。在20％的病例中出现自身免疫性结肠炎并且可以变成皮质类固醇难治型3。
总之，尽管检查点抑制剂疗法，具体地利用抗CTLA4和抗PD-1抗体的检查点抑制剂疗法是多种形式的癌症，具体地恶性黑色素瘤的有效治疗方法，但是所述治疗方法会与可能由于因检查点抑制剂治疗引起的免疫系统活化导致的显著副作用相关。此类副作用可以导致自身免疫反应并且表现为不同临床症状并且可以概括为irAE。一个突出的irAE是自身免疫性结肠炎。所述治疗方法的副作用，如自身免疫反应，具体地自身免疫性结肠炎甚至在检查点抑制剂治疗已经停止之后还会持续存在。
因此，本领域需要用于治疗已经接受检查点抑制剂疗法的患者的如自身免疫反应以及具体地自身免疫性结肠炎等免疫相关不良事件的替代性或改善手段。
发明内容
鉴于现有技术，本发明潜在的技术问题是提供用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的患者的如自身免疫反应以及具体地自身免疫性结肠炎等免疫相关不良事件的改善或替代性手段。
此问题通过独立权利要求的特征得以解决。本发明的优选实施例由从属权利要求提供。
在第一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
-提供源自受试者的血液样品的样品，所述受试者已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状，
-向所述样品中添加光增敏剂，以及
-使所述样品经受照射。
本发明基于完全出人意料的发现，即例如由于癌性疾病而已经接受检查点抑制剂疗法，从而导致如具体地自身免疫性结肠炎等irAE的患者可以通过应用ECP得到有效治疗。在实例中使用的所述ECP基本上对应于将光增敏剂添加到irAE患者的血源性样品中并且使所述样品经受照射的方法。令人惊讶的是，发现对血液样品，如具体地包括单核细胞(MNC)的血液样品执行此方法使得在所述样品中产生免疫调节性NK细胞。在此上下文中，“产生”免疫调节性NK细胞被理解为在所述样品中诱导或诱导此类细胞的形成。换句话说，所述样品中包括的细胞分化成免疫调节性NK细胞或者采用免疫调节性NK细胞的表型。
所发现的是，由本发明的方法产生的样品以及具体地所述样品包括的所诱导的免疫调节性NK细胞可用于治疗irAE患者。可以令人惊讶地证明的是，向已经接受检查点抑制剂疗法的受试者施用经受本发明的方法的此类样品或此类样品中包括的细胞在预防irAE的发生并且甚至在治疗所述受试者中已经存在的irAE方面都是有效的。重要的是，可以对已经接受检查点抑制剂疗法的同一受试者的样品执行本发明的方法。因此，可以将由本发明的方法产生的所述细胞或所述样品施用于充当血液供体的同一受试者，并且因此所得样品可以表示自体细胞疗法。
如本文所使用的，术语“已经接受检查点抑制剂疗法的受试者”包含当前处于持续进行的检查点抑制剂疗法期间的受试者，或者已经接受检查点抑制剂疗法并且例如在irAE症状出现之后中止所述检查点抑制剂疗法的受试者。
完全出乎意料的是，使用由本发明的方法产生的样品或细胞的此类细胞疗法甚至对于对如类固醇或抗TNF抗体等其它免疫抑制疗法是难治的并且在中止检查点抑制剂治疗之后仍显示出irAE的症状或仍然遭受irAE的irAE患者也是有效的。
如实例中所示，施用经受本发明的方法的样品的积极效果和功效可以至少部分归因于所述样品中包括的所述NK细胞的NK细胞功能调节，其中所述调节是在存在光增敏剂的情况下照射的结果。因此，本发明还涵盖用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的免疫调节性NK细胞。优选地，所述免疫调节性NK细胞是通过使来自人，优选地已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现irAE的受试者的血液或MNC或NK细胞经受本发明的方法来产生的，并且随后用于治疗已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现irAE的受试者，优选地所述供体。
在另外的方面，本发明涉及免疫调节性NK细胞，其从包括以下步骤的方法获得：
-提供源自受试者的所分离的血液样品的样品，
-向所述样品中添加光增敏剂，以及
-使所述样品经受照射。
本发明的此方面基于以下观测结果：在添加光增敏后经受照射的血源性样品中包括的NK细胞采用免疫调节性表型，这在将所得细胞用于治疗和/或预防irAE时是有利的。在此上下文中，迄今为止还没有在任何其它NK细胞上观察到此类有利且有益的性质。
优选地，本发明的受试者是人。优选地，本发明的血液样品和细胞是人。
在优选实施例中，用于产生本发明的免疫调节性NK细胞的血液样品来自已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状的受试者。此实施例尤其有利，因为所述细胞对于所述患者是自体的，并且将不存在在异种细胞移植后会发生的不良事件。
本发明的另外的方面涉及用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的免疫调节性NK细胞。所述受试者包含当前处于持续进行的检查点抑制剂疗法期间的受试者，或者已经接受检查点抑制剂疗法并且例如在irAE症状出现之后中止所述检查点抑制剂疗法的受试者。
优选地，用于此类治疗或预防的所述免疫调节性NK细胞已经通过向源自人类受试者的血液样品的样品中添加光增敏剂并且使所述样品经受照射而产生。
向所述血源性样品中添加光增敏剂并且使所述样品经受照射在所述样品中产生或诱导免疫调节性NK细胞(的形成)。
在各实施例中，所述光增敏剂是8-甲氧基补骨脂素。此外，在各实施例中，所述照射是UVA照射。在优选实施例中，所述光增敏剂是8-甲氧基补骨脂素并且所述照射是UVA照射。
在本发明的上下文中，照射优选地是通过体外光分离置换法(ECP)系统来执行的。所述血液样品的照射可以使用技术人员已知的任何合适的系统或照射装置执行。
在各实施例中，本发明的方法是体外或离体执行的。如本文所使用的，术语体外和离体同义地使用。在本发明的上下文中，所述术语涉及一种对已经从人体中移除的血源性样品执行的方法，其中本发明的方法是在人体之外针对所述血源性样品执行的。为此，将供体受试者的血液从身体中取出，这意味着从生理循环系统中取出。如本文所使用的，“所分离的血液样品”是从供体的循环系统移除到人的身体之外的某一位置的血液(意味着一定体积的血液)的样品。
此所分离的血液样品可以经受或者引导到用于执行本发明的方法的至少某些步骤的体外光分离置换法(ECP)系统或单采术系统。其中，此类系统可以是与受试者的血液循环系统流体连接的在线系统。在可替代的实施例中，所述方法可以离线执行，其中经受照射的血源性样品与供体受试者的循环系统断开连接。
因此，在各实施例中，本发明的方法是体外方法。在本发明的方法的实施例中，所述血液样品是所分离的血液样品。在各实施例中，所述方法是体外方法并且所述血液样品是所分离的血液样品。
如本文所使用的，术语“血液样品”包括所有种类的血源性样品，包含如由血液产生的MNC样品等血细胞样品。
在本发明的实施例中，所述受试者(所述血液供体和/或细胞的受体)显示出irAE的症状或遭受irAE。在另外的实施例中，所述受试者已经接受检查点抑制剂疗法，但是在所述受试者中出现irAE的症状和/或表现形式之后中止所述检查点抑制剂疗法。在各实施例中，在中止检查点抑制剂疗法之后，受试者中出现irAE的症状和/或表现形式。在各实施例中，在中止检查点抑制剂疗法之后，irAE的症状和/或表现形式持续存在。
在本发明的实施例中，其中已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现irAE的症状的受试者充当血液供体，血液样品的提供和/或分离可以在以上实施例中描述的时间点中的任何时间点发生。例如，样品分离可以在出现irAE症状之前或之后发生。此外，样品分离可以在检查点抑制剂疗法期间或所述疗法中止之后发生。
在本发明的优选实施例中，在检查点抑制剂疗法持续进行的同时，将由本发明的方法产生的样品或根据本发明的供使用的NK细胞施用于受试者。
在优选实施例中，样品分离在持续进行的检查点抑制剂疗法期间，在irAE症状出现之前或之后发生。由所述实例的所述方法产生的所述样品或所述细胞可以通过在持续进行的检查点抑制剂疗法期间将所述样品/细胞施用于所述受试者来预防性或治疗性地使用。因此，在本发明的优选实施例中，已经接受检查点抑制剂疗法的受试者可以在检查点抑制剂疗法持续进行的同时接受免疫调节性NK细胞，所述免疫调节性NK细胞优选地是自体的并且已经通过根据本文所描述的方法照射血源性样品产生。此类实施例尤其有利，因为可以在患者接受本发明的细胞和/或由本发明的方法产生的细胞的同时维持如抗癌检查点抑制剂疗法等检查点抑制剂疗法。
因此，在此类实施例中，可以将检查点抑制剂疗法施用于受试者持续更长的时间段，因为施用所照射的细胞预防irAE的发生或者减轻irAE，使得检查点抑制剂疗法可以继续进行。可以令人惊讶地证明的是，施用由本发明的方法产生的此类细胞，具体地本发明的免疫调节性NK细胞不会干扰受试者对检查点抑制剂疗法的抗癌应答。与irAE的已知治疗/预防措施，具体地如皮质类固醇等免疫抑制药物的施用相比，这代表了重要的优势。结果令人惊讶地表明，执行ECP不会显著地改变检查点抑制剂疗法的抗癌效果，而糖皮质激素(皮质类固醇的特定类别)，具体地泼尼松龙(prednisolone)的并行施用使结果更差，这表明检查点抑制剂治疗的有效性降低。
此外，在其中将(人)血源性样品——所述样品经受一种向所述样品中添加光增敏剂并且使所述样品经受照射的方法——用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的irAE，而无论所述血源性样品的来源如何(自体或异种)的各实施例中，由此类方法产生的所述样品或所述细胞的施用可以例如在出现irAE症状之前或之后和/或在检查点抑制剂疗法期间或在中止检查点抑制剂疗法之后发生。
在本发明的实施例中，(血液供体和/或细胞的受体的)所述irAE包括自身免疫疾病的症状和/或是由自身免疫反应引起的。在优选实施例中，所述irAE包括自身免疫性结肠炎或者是自身免疫结肠炎。
在各实施例中，所述irAE包括选自包括以下的组的至少一个irAE：自身免疫性结肠炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎和自身免疫性皮炎。
在各实施例中，所述irAE包括选自包括以下的组的至少一个irAE：免疫检查点抑制剂相关结肠炎、免疫检查点抑制剂相关肝炎、免疫检查点抑制剂相关甲状腺炎和免疫检查点抑制剂相关皮炎。
在各实施例中，所述受试者(血液供体和/或细胞的受体)患有癌症，如恶性黑色素瘤或可通过检查点抑制剂疗法治疗的另一种癌症。
在各实施例中，所述受试者正在接受免疫抑制药物，如类固醇、皮质类固醇、环孢霉素和/或抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗(infliximab))和/或对免疫抑制药物是难治的。
完全出人意料的是，施用由本文所描述的方法产生的细胞，如免疫调节性NK细胞对于对为了治疗irAE症状而已经施用的免疫抑制药物是难治的irAE患者具有治疗效果。对于此类患者，没有可用于减轻irAE症状的有效治疗，并且因此本发明代表了治疗这些患者的irAE的完全意料之外的可能性。
在各实施例中，所述检查点抑制剂疗法包括施用抗CTLA4抗体和抗PD-1抗体中的至少一种。
在各实施例中，用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的irAE的所述免疫调节性NK细胞相对于所述受试者是自体的。在可替代的实施例中，所述NK细胞相对于所述受试者可以是异种的。
在各实施例中，在irAE症状出现后施用根据本发明的供使用的所述免疫调节性NK细胞。在各实施例中，在irAE症状出现后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、35周、40周、45周或50周施用所述细胞。在各实施例中，在检查点抑制剂疗法持续进行期间或检查点抑制剂疗法中止之后施用所述免疫调节性NK细胞。
在各实施例中，所述免疫调节性NK细胞至少一次，优选地至少两次，优选地连续数天施用施用于所述受试者。因此，所述受试者可以接受多于一剂的NK细胞，其中优选地每天施用不大于一剂。在另外的实施例中，所述受试者接受至少2、3、4或5剂的本发明的NK细胞。在各实施例中，本发明的免疫调节性NK细胞至少每8周，优选地每2-4周施用于所述受试者。
在本发明的一方面的上下文中公开或描述的本发明的每个任选或优选的特征也同此在本文所描述的本发明的其它方面的上下文中公开。
此外，本发明还涉及以下实施例：
1.一种用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的体外光分离置换法(ECP)系统，其中ECP优选地在施用8-甲氧基补骨脂素的情况下执行。
本发明基于完全出人意料的发现，即例如由于癌性疾病而已经接受检查点抑制剂疗法，从而导致如具体地自身免疫性结肠炎等irAE的患者可以通过应用ECP得到有效治疗。这甚至对于对如类固醇或抗TNF抗体等其它免疫抑制疗法是难治的并且在中止检查点抑制剂治疗之后仍显示出irAE的症状或仍然遭受irAE的患者也是适用的。
令人惊讶的是，已证实ECP治疗的积极效果和功效具体地是由于ECP之后NK细胞功能的调节引起的。因此，本发明还具体地涉及用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的免疫调节性NK细胞，其中所述免疫调节性NK细胞是通过使来自人，优选地本发明的受试者的血液或MNC或NK细胞经受ECP治疗来产生的。
2.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述ECP系统是在线ECP系统。
3.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述ECP系统是离线ECP系统。
4.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述受试者显示出irAE的症状或遭受irAE。
5.根据本发明的供使用的ECP系统，其中在所述受试者中出现irAE的症状和/或表现形式之后中止所述检查点抑制剂疗法。
6.根据本发明的供使用的ECP系统，其中在中止所述检查点抑制剂疗法之后出现irAE的症状和/或表现形式。
7.根据本发明的供使用的ECP系统，其中在中止所述检查点抑制剂疗法之后，irAE的症状和/或表现形式持续存在。
8.根据任一本发明的供使用的ECP系统，其中在irAE症状出现后开始所述ECP治疗。
9.根据本发明的供使用的ECP系统，其中在irAE症状出现后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、35周、40周、45周或50周开始所述ECP治疗。
10.根据本发明的供使用的ECP系统，其中在检查点抑制剂疗法持续进行期间或在所述检查点抑制剂疗法中止之后开始ECP治疗。
11.根据本发明的供使用的ECP系统，其中ECP治疗包括至少1个，优选地至少2个ECP周期，优选地连续数天。
12.根据本发明的供使用的ECP系统，其中ECP治疗执行至少2、3、4或5次。
13.根据本发明的供使用的ECP系统，其中ECP治疗至少每8周，优选地每2-4周执行一次。
14.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述irAE包括自身免疫疾病的症状。
15.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述irAE是由自身免疫反应引起的。
16.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述irAE包括选自包括以下的组的至少一个irAE：自身免疫性结肠炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎和自身免疫性皮炎。
17.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述irAE包括选自包括以下的组的至少一个irAE：免疫检查点抑制剂相关结肠炎、免疫检查点抑制剂相关肝炎、免疫检查点抑制剂相关甲状腺炎和免疫检查点抑制剂相关皮炎。
18.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述irAE包括自身免疫性结肠炎。
19.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述irAE是自身免疫性结肠炎。
20.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述受试者是人类。
21.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述受试者患有癌症，如恶性黑色素瘤或可通过检查点抑制剂疗法治疗的另一种癌症。
22.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述受试者正在接受免疫抑制药物，如类固醇、皮质类固醇、环孢霉素和/或抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗)。
23.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述受试者对免疫抑制药物，如类固醇、皮质类固醇、环孢霉素和/或抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗)是难治的。
24.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述检查点抑制剂疗法包括施用抗CTLA4抗体和抗PD-1抗体中的至少一种。
25.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述ECP系统用于执行血液照射疗法。
26.根据本发明的供使用的ECP系统，其中所述ECP系统包括免疫调节性分子，优选地与所述ECP系统的膜偶联的免疫调节性分子，其中所述免疫调节性分子接触所述受试者的免疫细胞。
27.一种体外方法，其包括以下步骤：
-提供源自受试者的所分离的血液样品的样品，所述受试者已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状，
-使所述样品经受体外光分离置换法。
28.一种治疗已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者经受体外光分离置换法(ECP)疗法(ECP)，如利用ECP系统的血液照射疗法。
29.一种用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的免疫调节性NK细胞。
30.根据本发明的供使用的免疫调节性NK细胞，其中所述免疫调节性NK细胞已经通过使人血液样品或人血液样品中包括的细胞经受体外光分离置换法来产生。
31.根据本发明的供使用的免疫调节性NK细胞，其中所述NK细胞相对于所述受试者是自体或异种的。
32.根据本发明的供使用的免疫调节性NK细胞，其中所述NK细胞静脉内地施用于所述受试者。
33.根据本发明的供使用的免疫调节性NK细胞，其中所述NK细胞是在经受体外光分离置换法之前或之后从所述人血液样品中分离的。
在用于治疗和/或预防已经接受本发明的检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的ECP系统的上下文中公开的所有特征还涉及用于治疗和/或预防已经接受本发明的检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的本发明的体外方法、本发明的治疗方法和NK细胞，并且因此也同此在所述体外方法、所述治疗方法和所述NK细胞的上下文中公开，并且反之亦然。
具体实施方式
专利和非专利文献的所有引用的文件通过引用以其整体特此并入。
本文公开了包括以下步骤的方法：提供源自受试者，优选地已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状的受试者的血液样品的样品；向所述样品中添加光增敏剂；以及使所述样品经受照射。所述血液样品的照射可以使用技术人员已知的任何合适的系统或照射装置执行。优选地，照射通过体外光分离置换法(ECP)系统执行。
本发明还涉及一种用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的体外光分离置换法(ECP)系统，其中ECP优选地在施用8-甲氧基补骨脂素的情况下执行。
照射和体外光分离置换法(ECP)
光分离置换法或体外光分离置换法或ECP是单采术和光动力疗法的一种形式，其中将血液用光增敏剂处理并且随后用指定波长的光照射以达到某一效果。例如，可以从全血中分离血沉棕黄层(WBC+血小板)，将所述血沉棕黄层用8-甲氧基补骨脂素(滴注到收集袋中或提前口服给予)化学处理，暴露于紫外线(UVA)，并且返回到患者。活化的8-甲氧基补骨脂素与暴露的细胞中的DNA交联，最终导致有核细胞凋亡。返回给患者的光化学受损的T细胞似乎诱导了对T细胞形成的细胞毒性作用。
在以下中首次描述了涉及8-甲氧基补骨脂素的光分离置换法：1987年的新英格兰医学杂志出版物(Edelson,R等人(1987).“通过体外光化学疗法治疗皮肤T细胞淋巴瘤：初步结果(Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporealphotochemotherapy.Preliminary results)”.《新英格兰医学杂志(New England Journalof Medicine)》.316(6):297–303.)。光分离置换法目前是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于皮肤T细胞淋巴瘤的标准疗法。有证据表明，此治疗可以有效治疗移植物抗宿主病。当所有其它治疗无效时，光分离置换法还已经成功用于治疗获得性大疱性表皮松解症。
如本文所使用的ECP包括血液照射疗法。在各实施例中，本发明的ECP和ECP系统涉及血液照射疗法和用于血液照射疗法的系统。在本发明的实施例中，ECP涉及除了血液照射疗法之外的ECP。
血液照射疗法是出于治疗原因而将血液暴露于低水平红光(通常是激光)的程序。血液照射疗法可以通过三种方式施用。在体外，抽出血液并对处于专用比色皿中的所述血液进行照射。此方法用于通过UV灯进行的紫外线(UV)血液照射(UVBI)。激光是单色的，即其波长使得允许光进入光纤并且通过静脉中的导管进行静脉内照射。此方法更简单有效。血液照射疗法还通过在大血管的突出部分上的皮肤在外部施用。
在假设任何治疗效果都将通过循环系统循环的情况下，静脉内或血管内激光血液照射(ILBI)涉及通过将由1-3mW氦氖激光器产生的波长为632.8nm的低水平激光馈送到血管通道，通常是前臂中的静脉中来在体内照射血液。大多数情况下使用365、405、525和635nm的波长和2.3mW的功率。所述技术目前在俄罗斯广泛使用，在亚洲使用较少，并且在世界其它地区未广泛使用。已经表明，ILBI改善了血流及其运输活动，因此，改善了组织营养作用，对免疫系统和细胞代谢具有积极作用。这个论点受到怀疑。已经有人呼吁增加对这一主题的研究。经皮疗法在具有大量血管的区域(如前臂)中的未破损皮肤上施加激光。由于充当血液的屏障的皮肤吸收低水平激光能量，所以激光的功率经常增大以进行补偿。所述问题可以通过使用脉冲矩阵激光光源来解决。体外照射仅用于紫外线血液照射，所述紫外线血液照射涉及通过静脉将血液抽出并在身体外部对所述血液进行照射。虽然被推广为癌症的治疗方法，但1952年发表在《美国医学会杂志(Journal of the American MedicalAssociation)》上的综述和1970年美国癌症学会(American Cancer Society)的另一篇综述得出结论：所述治疗是无效的。
体外光分离置换法(ECP)，还称为体外光免疫疗法或光化学疗法，是基于白细胞去除术的疗法，其最初用于患有皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的患者。具体地，为了治疗患有白血病变异体、赛泽里综合征(Sézary Syndrome)的疗法难治性CTCL患者，ECP于1988年获得FDA(美国食品和药物管理局)批准。在ECP期间，通过肘静脉或永久植入的导管收集患者的全血，以用于将白细胞与血浆和无核细胞分离。使用用于此程序的专门构建的装置，然后将所收集的白细胞，即所谓的血沉棕黄层，在存在光增敏剂8-甲氧基补骨脂素的情况下暴露于紫外线-A(UVA)照射，然后再输注给患者。
用于执行ECP程序的两种基本不同的方法已经由本发明描述并且包括在本发明内。所述两种方法在用于白细胞收集和UVA照射的装置方面有所不同：“封闭系统”和所谓的“开放系统”。封闭系统基于Edelson及其同事的原始设计并且是唯一获得FDA批准的系统。开放系统是并入有不同分离仪器的主要在美国境外使用的系统。尽管ECP是自30年以来的有效的治疗方法并且已经执行了超过200万次治疗，但没有关于负面细胞遗传学效应的报道。
自引入ECP以来，启动ECP的适应症不断扩大。ECP治疗通常被患者良好耐受并且几乎没有显著的不希望的副作用。总而言之，ECP将出色的安全特性与功效相组合。
体外光分离置换法(有时还称为体外光化学疗法)是包含以下的过程：(1)从患者收集单核细胞(MNC)；(2)对所收集的MNC细胞进行光活化处理；以及(3)将经处理的细胞(MNC)再输注回患者。更具体地，ECP涉及外周血单核细胞联合如8-甲氧基补骨脂素或“8-MOP”等光活性化合物的体外暴露，然后通过紫外线光活化，然后再输注经处理的单核细胞。据信，8-MOP和UV辐射的组合引起经ECP处理的T细胞的凋亡或程序性细胞死亡。
虽然ECP治疗(在不同的疾病状态下)中的确切作用机制尚不完全清楚，但根据早期理论，据信光活化使8-MOP不可逆地共价结合到T细胞的细胞核中含有的DNA链。当再输注光化学受损的T细胞时，诱导了细胞毒性效果。例如，细胞毒性T细胞或“CD8+细胞”在暴露于受感染或受损的细胞时释放细胞毒素或以其它方式攻击在表面上携带某些外来或异常分子的细胞。细胞毒素靶向受损细胞的膜并且进入靶细胞，这最终导致靶细胞的凋亡或程序性细胞死亡。换句话说，在经处理的单核细胞返回体内后，免疫系统识别垂死的异常细胞并且开始产生健康的淋巴细胞(T细胞)来对抗这些细胞。
除上述内容外，还从理论上认为，体外光分离置换法还诱导单核白细胞(一种单核细胞)分化成能够吞噬并加工凋亡T细胞抗原的树突细胞。当这些活化的树突细胞被再输注到体循环中时，所述活化的树突细胞可以如上所述的那样引起对所加工的凋亡T细胞抗原的全身细胞毒性CD8+T淋巴细胞介导的免疫应答。应理解的是，其它可能的作用机制可以涉及实现从单核细胞的ECP处理观察到的益处以及随后对接受基于ECP的疗法的患者的益处。
最近，据推测，ECP可以在患者中引起免疫耐受应答。例如，在移植物抗宿主病的情况下，输注凋亡细胞可以刺激调节性T细胞的产生，抑制炎性细胞因子的产生，引起有效T细胞的缺失并产生其它应答。参见Peritt,“造血干细胞移植中光分离置换法的潜在机制(Potential Mechanisms of Photopheresis in Hematopoietic Stem CellTransplantation)”,《血液与骨髓移植生物学(Biology of Blood and MarrowTransplantation)》12:7-12(2006)。虽然目前免疫耐受应答的理论似乎是主要解释之一，但还存在关于ECP相对于移植物抗宿主病以及其它疾病状态的作用机制的其它理论。
例如，用于执行ECP的系统包含UVAR XTS光分离置换法系统和CellEx光分离置换法系统，其可从宾夕法尼亚州埃克斯顿的Therakos公司(Therakos,Inc.,of Exton,Pa.)获得。例如，在Therakos系统上执行ECP的另外的细节可以在美国专利第5,984,887号中找到。
目前有两种常用的用于执行光分离置换法的方法-在线和离线系统和方法。
在在线方法中，如以上提及的Therakos装置等专用的光分离置换法装置用于执行整个疗法，包含经处理的MNC的再输注。此类装置是“专用”光分离置换法装置，所述装置被设计成仅用于执行光分离置换法，并且不能执行医院或血液处理环境中所需的其它收集方案，包含例如用于收集血小板、血浆、RBC、粒细胞的多功能单采术方案，和/或不能执行血浆/RBC交换方案。
在离线光分离置换法方法中，多功能单采术装置可以用于收集单核细胞。将通常包含在一个或多个收集容器中的所收集的MNC与收集期间使用的管组切断或以其它方式与所述管组分离，稍后在单独的照射或UVA光装置中对所收集的MNC进行处理，然后手动将经处理的细胞再输注给患者。然而，在此类离线方法期间，当将细胞从单采术装置转移到照射装置(所述装置可以位于另一个房间或实验室中)时，必须切断与供体的联系，并且相应地将细胞与供体脱离。因此，需要另外的可追溯性程序来确保经处理的MNC产物最终再输注到正确的供体中。
装置和所述装置中酶的固定：
在本发明的实施例中，ECP系统可以包括包含基质的装置，所述基质具有固定的免疫调节性分子或其它生物分子，如酶。优选地，在本发明的上下文中，具有偶联分子的基质暴露于血液或MNC。
因此，如本文所使用的“基质”是指血液处理装置内部的材料，所述材料提供血液或血浆通过其或在其上经过的内部材料或表面。如本发明的上下文中所使用的基质优选地包括固定的免疫调节性分子或其它生物分子结合到的支撑物。因此，所述支撑物充当固定的免疫调节性分子或其它生物分子的载体，但所述支撑物也可以履行其它功能。
如本文中所使用的“支撑物”是指基质中充当根据本发明的固定的免疫调节性分子或其它生物分子结合到的“底物”或“支撑物材料”的部分。此类支撑物或支撑物材料有时还被称为“吸附材料”或“吸附器”，如在“吸附柱”或“柱”或“吸附筒”中所使用的。根据本发明的合适的支撑物应该在相关的pH范围和温度下是均匀的、亲水的、物理上和化学上稳定的，在使用期间没有酶浸出或者酶浸出可忽略不计，对全血和/或血浆具有良好的流动特性，并且为酶附着提供了大的表面积。
例如，支撑物可以是树脂、膜或非织造材料。“非织造”材料是指广义上定义为通过物理、热或化学方式来缠结纤维或细丝(并且通过对膜进行穿孔)而非通过编织或编结而粘合在一起的片材、织物或网状结构的材料。“树脂”是指可以采取凝胶或凝胶珠或微孔珠或海绵的形式的不溶性材料。此类树脂可以是天然或生物聚合物、合成聚合物和无机材料。琼脂糖、右旋糖和纤维素珠是常用的天然支撑物。合成聚合物或有机支撑物主要基于丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯衍生物，而多孔二氧化硅和玻璃是一些常用的无机支撑物。
根据本发明的一个实施例，所述树脂包含：选自由以下组成的组的聚合物：海藻酸盐、壳聚糖、甲壳素、胶原、角叉菜胶、明胶、纤维素、淀粉、果胶和琼脂糖；选自由以下组成的组的无机材料：沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭和木炭；或选自由以下组成的组的合成聚合物：聚乙烯(PE)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙酸乙烯酯(PVA)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酸酯(PAA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚丙烯腈(PAN)、聚酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺、聚芳酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PEAS)、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、乙烯乙烯醇(EVOH)、聚酰胺亚胺、聚芳醚酮(PAEK)、聚丁二烯(PBD)、聚丁烯(PB)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚己内酯(PCL)、聚羟基烷酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚酰亚胺、聚乳酸(PLA)、聚甲基戊烯(PMP)、聚(对亚苯基醚)(PPE)、聚氨酯(PU)、苯乙烯丙烯腈(SAN)、聚丁烯酸、聚(4-烯丙基苯甲酸)、聚(丙烯酸缩水甘油酯)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚二乙烯基苯(PDVB)、聚(烯丙基缩水甘油醚)、聚(乙烯基缩水甘油醚)、聚(乙烯基缩水甘油氨基甲酸酯)、聚烯丙胺、聚乙烯胺、所述聚合物的共聚物以及通过引入官能团修饰的这些聚合物中的任何聚合物。
可以使用各种已知的方法将固定的免疫调节性分子或其它生物分子固定到根据本发明的支撑物和/或基质。此类固定优选地是特异性的或选择性的，因为其将酶固定，而存在于血液或血浆或其样品(体外)中的其它蛋白质和组分未显著地固定。
将固定的免疫调节性分子或其它生物分子的“固定”到用于提供可以用于根据本发明的装置中的基质的支撑物是指将两个分子保持在一起的非共价或共价相互作用。根据本发明的一个实施例，所述表达是指共价相互作用，即是指共价结合的固定的免疫调节性分子或其它生物分子。非共价相互作用包含但不限于氢键键合、带电基团之间的离子相互作用、范德华相互作用(van der Waals interaction)以及非极性基团之间的疏水相互作用。这些相互作用中的一种或多种相互作用可以介导两个分子彼此的结合。结合可以以其它方式是特异性的或选择性的或非特异性的。
根据一个实施例，固定的免疫调节性分子或其它生物分子包括用于将其固定在支撑物上的亲和标签。亲和标签可以用于在产生期间纯化蛋白质和/或将其固定在本发明的基质的支撑物上。亲和标签可以是作为与酶的融合配偶体共表达的短多肽序列或全蛋白。不同类型的亲和标签是本领域公知的，其中多组氨酸或His6标签、C-myc标签和FLAG标签被特别详细地描述，并且是用于将根据本发明的酶结合到支撑物材料的选项。生物素与链霉亲和素或亲和素的非共价连接还可以用于将固定的免疫调节性分子或其它生物分子固定到支撑物。
根据本发明的另一个实施例，固定的免疫调节性分子或其它生物分子共价连接到支撑物，如以下进一步详述和/或如现有技术所述。共价偶联通常包含蛋白质的共价非定点连接或蛋白质的定点连接。构成基质产生基础的支撑物必须提供或促进化学活化，从而允许固定的免疫调节性分子或其它生物分子的化学偶联。许多用于将固定的免疫调节性分子或其它生物分子固定的偶联方法是本领域公知的。
例如，活化化学在较宽的pH、缓冲条件和温度范围内应该是稳定的，从而使得酶的浸出可忽略不计。偶联方法应避免固定的免疫调节性分子或其它生物分子的定向不当、多位点连接或空间位阻。可以优化每体积基质的酶密度，以促进靶标可及性和反应。
共价偶联可以通过常见的官能团进行，所述官能团包含胺、醇、羧酸、醛和环氧基团。碳二亚胺化合物可以用于活化蛋白质的羧基，以用于通过酰胺键直接缀合到支撑物表面上的伯胺。最常用的碳二亚胺是用于水性交联的水溶性EDC(1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和用于非水性有机合成方法的水不溶性DCC(N',N'-二环己基碳二亚胺)。
可替代地，支撑物可以携带特定的官能团，所述官能团用于将接头和/或酶与其偶联。例如，官能化树脂是可商购获得的，并且为本领域技术人员所知。所述商业支撑物中可具有各种偶联化学物质，涉及伯胺、巯基、醛、羟基和羧酸。可商购获得的活化树脂的实例是CarboLink偶联树脂、ProfinityTM环氧树脂、Affi-Gel 10和15、环氧活化的SepharoseTM6B、三氟代乙烷磺酰氯活化的琼脂糖和用环氧基团官能化的
Figure BDA0003693636850000151
LifetechTM甲基丙烯酸酯聚合物。
根据本发明的一个实施例，所述支撑物材料应为多孔的，其中孔隙大小在10到200nm的范围内。根据本发明的另一个实施例，所述支撑物采取珠的形式。根据又另一实施例，根据本发明的支撑物包括磁珠。磁珠是通过将磁铁矿包埋在根据本发明的酶所固定于的琼脂糖或其它聚合物材料内来制备的。
根据本发明的另一个实施例，所述支撑物是膜。作为亲和基质的组分的膜由于其简单性、易于处理、与凝胶、树脂和珠相比表面积降低并且扩散限制更少而已被用于蛋白质纯化。膜可以采用中空纤维的物理形式，或者可替代地可以采用平片膜的物理形式。根据一个实施例，所述支撑物包括血液透析中空纤维膜透析器，其中过滤器为血液透析器。
用作根据本发明的装置中的支撑物的中空纤维或平片膜可以由以下构成：纤维素、纤维素酯(乙酸纤维素和三乙酸纤维素)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酰胺(PA)、其它含氮聚合物(聚苯并咪唑、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)或聚芳醚砜(PAES)。可以有利地用于提供根据本发明的装置的中空纤维膜的内径优选地在100到500μm的范围内。根据本发明的另一个实施例，具体地当膜支撑物是如上所述的血液透析膜时，中空纤维膜另外或可替代地在所述纤维的管腔侧用根据本发明的酶官能化，在所述管腔侧，所述酶可以直接与灌注中空纤维膜的管腔的血液或血浆中的目标代谢物相互作用。所述酶还可以或可替代地固定到膜的外部。
体外血液处理的方法：
本发明包含装置，所述装置被配置成位于患者血液通过的体外血液回路中并且包括用于以定义的流速将血液从患者的血管系统输送到血液处理装置并且然后将经处理的血液返回给患者的构件，并且其中所述装置被进一步配置成降低血液中ADMA和/或MMA的水平。此外，本发明还包含可以用于体外血液或血细胞处理的装置，其中所述装置可以与体外血液回路分开或断开连接或可与体外血液回路分开/脱离。
根据本发明，表达“体外血液净化”优选地是指通过在患者身体之外(体外)的转移回路中从流动的血液中清除物质来从体液中去除物质的过程。所述物质可以包含内源性毒素(即尿毒症毒素)、外源性毒物(即乙二醇或真菌毒素)、施用的药物、病毒、细菌、抗体、代谢物和蛋白质(即IMHA、重症肌无力)、异常细胞(即白血病)和过量的水。治疗程序包含血液透析，包含间歇性血液透析(HD、HDF、HF)和连续肾脏替代疗法(CRRT)；血液灌注；血浆交换和治疗性单采术。此类方法是技术人员已知的，并且可以相应地并入本发明的装置。
如本文所使用的表达“血液”是指含有生物体血液的所有组分的全血，所述组分包含悬浮在血浆中的红细胞、白细胞和血小板。表达“血浆”是指由约92％的水、7％的如白蛋白、γ球蛋白、纤维蛋白原、补体因子、凝血因子等蛋白质和1％的矿物盐、糖、脂肪、电解质、激素和维生素构成的流体，所述流体形成全血的一部分，但不再含有红细胞和白细胞以及血小板。在本发明的上下文中，表达“血浆(blood plasma或plasma)”是指以上在标准意义上定义的血浆的特定级分，例如血清。
根据一方面，体外血液净化回路中的血液流速介于20毫升/分钟与700毫升/分钟之间。除了根据本发明的血液处理装置之外还包括用于治疗肾衰竭的血液透析器或者在血液透析器另外被配置成使ADMA和/或MMA代谢的情况下的体外回路中的典型透析液流速在0,5升/小时到800毫升/分钟的范围内。
在治疗性单采术中，可以对全血进行处理或者例如通过离心或利用质膜或过滤器将血液分离成其组分级分，并且含有应被去除的溶质的级分在返回患者之前被专门处理。
本发明提供了单采术治疗，其中从患者流动的血液中去除全血或血浆(含有靶蛋白)，并且所述全血或血浆在与根据本发明的装置或基质接触后返回给患者。其中血液处理装置用全血或血浆灌注的体外回路中的典型血液或血浆流速分别在30毫升/分钟到200毫升/分钟或7毫升/分钟到50毫升/分钟的范围内。
根据一方面，根据本发明的体外血液回路被配置成执行血液透析。在这种情况下，根据本发明的装置是例如血液透析器，所述血液透析器已经另外被配置成固定根据本发明的靶蛋白。所述回路可以根据医疗需要以不同的治疗模式操作，包含血液透析、血液透析过滤、血液过滤模式。
免疫相关不良事件(irAE)
如本文所使用的，术语“免疫相关不良事件”(irAE)涉及在免疫检查点抑制剂治疗的背景下，例如在癌症疗法的背景下具体发生的任何具体副作用。irAE是独特的并且与传统癌症疗法背景下发生的不良事件不同，并且通常具有延迟的发作和延长的持续时间。irAE可以涉及任何器官或系统。这些影响通常是低级的并且是可治疗且可逆的；然而，一些不良反应可以是严重的并且导致永久性病症。治疗主要基于皮质类固醇和其它免疫调节性药剂，应谨慎开具处方，以减少短期和长期并发症的可能性。
所述术语具体包括自身免疫疾病的症状和自身免疫疾病，如(自身免疫性)结肠炎、(自身免疫性)肝炎、(自身免疫性)甲状腺炎和(自身免疫性)皮炎。
在本发明中由于施用检查点抑制剂疗法而引起的irAE没有特别限制。irAE被理解为假定与免疫相关的不良事件：irAE(参见例如，
Figure BDA0003693636850000171
静脉内输注20mg-100mg的药物访谈表格，于2016年4月修订(第9版)；抗CTLA-4抗体伊匹单抗(Ipilimumab)
Figure BDA0003693636850000172
的不良事件的性质和处理，日期为2015年8月24日，由日本皮肤病学协会恶性黑色素瘤新药安全委员会(Committee on Safety of New Drugs for Malignant Melanoma of theJapanese Dermatological Association)发布)。
本发明的irAE的具体实施例优选地包含间质性肺病、重症肌无力、肌炎、结肠炎、1型糖尿病、肝功能障碍(肝脏病症)、肺部病症如肝炎(例如，自身免疫性肺炎)、垂体机能障碍如垂体功能减退症或垂体炎、甲状腺功能障碍如甲状腺功能减退症、神经病变、肾病、脑炎、肾上腺病症如肾上腺功能不全、严重皮肤病症、静脉血栓栓塞、输注反应、牛皮癣、牛皮癣样皮疹、腹泻(例如，严重腹泻)、类风湿性关节炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎、滑囊炎、放射性皮炎加重、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(以下还称为脱髓鞘性多发性神经病)、胆道病症或肾炎以及垂体机能障碍。
已知免疫相关不良事件(IrAE)在例如施用后8周或8到12周出现。免疫相关不良事件可以通过“等级”或“IrAE评估”进行评估。在这里，“irAE评估”是表示疾病严重程度的指数并且由1到3表示。在irAE评估中，1表示“由于不需要因irAE而进行另外的治疗干预”的病状，2表示“由于irAE而需要药物干预等，但不需要住院治疗或不需要中断治疗”的病状，并且3表示“由于irAE而需要药物干预等以及住院并需要中断治疗”的病状。“irAE评估”与“等级”之间的对应关系因每种疾病而异。
免疫检查点分子和检查点调节剂
在本发明的上下文中，免疫检查点抑制剂是通过调节免疫检查点分子来活化免疫细胞的药物。
免疫检查点分子是免疫系统中的分子，所述分子增强信号(共刺激分子)或减弱提供给免疫效应细胞的信号。因此，免疫检查点分子可以细分为共刺激检查点分子或共抑制检查点分子。共刺激检查点分子包含共刺激淋巴细胞受体，所述共刺激淋巴细胞受体是可以引起淋巴细胞效应子功能的活化或刺激的淋巴细胞表面受体。共抑制检查点分子包含共抑制性淋巴细胞受体，所述共抑制性淋巴细胞受体是可以引起淋巴细胞效应子功能的抑制的淋巴细胞表面受体。
共刺激检查点分子包括但不限于HVEM、CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、CD28和ICOS。
在本发明的优选实施例中，术语共刺激淋巴细胞受体不是指CD122。
HVEM(疱疹病毒进入介质，CD270)还被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)，并且是可以与BTLA结合的TNF受体超家族的受体。
CD27支持原初T细胞的抗原特异性扩增，并且对T细胞记忆的产生至关重要，并且还是B细胞的记忆标志物。CD27的活性由其配体CD70在淋巴细胞和树突细胞上的瞬时可用性控制。已知CD27共刺激抑制Th17效应细胞功能。针对CD27的激动性单克隆抗体CDX-1127/伐立鲁单抗(Varlilumab)已被证明在动物模型中在T细胞受体刺激的背景下是有效的。
CD28在几乎所有人CD4+T细胞和大约一半的所有CD8 T细胞上组成型表达。例如在树突细胞上表达的其两种配体CD80和CD86之一的结合促进T细胞扩增。
CD40在多种免疫系统细胞上表达，包含抗原呈递细胞。CD40的配体称为CD40L，还称为CD154，并在活化的CD4+T细胞表面瞬时表达为其配体。已知CD40信号传导“许可”树突细胞成熟，并且从而触发T细胞活化和分化。
4-1BB(CD137)与CD137配体结合，从而引起T细胞增殖。还已知CD137介导的信号传导保护T细胞，并且具体地保护CD8+T细胞免受活化诱导的细胞死亡。全人IgG2激动性单克隆抗体乌托鲁单抗(Utomilumab)(PF-05082566)靶向4-1BB以刺激免疫系统对癌症的更强烈攻击。
OX40(CD134)以OX40L(CD252)作为其配体。OX40促进效应子和记忆T细胞的扩增，并且还因其抑制T调节细胞的分化和活性的能力而闻名。OX40在T细胞受体参与后瞬时表达，这就是为什么其仅在炎性病变内最近的抗原活化的T细胞上上调，这就是为什么OX40是有价值的药物靶标的原因。激动性抗OX40单克隆抗体已被证明在晚期癌症中具有临床效用。制药公司阿斯利康(AstraZeneca)正在开发三种靶向OX40的药物：MEDI0562是人源化的OX40激动剂；MEDI6469，鼠OX40激动剂；以及MEDI6383，OX40激动剂。
GITR(糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因)促进T细胞扩增。GITR的配体(GITRL)主要在抗原呈递细胞上表达。GITR的抗体已被证明通过丧失Treg谱系稳定性来促进抗肿瘤应答。
ICOS(诱导性T细胞共刺激因子，还称为CD278)在活化的T细胞上表达。其配体是主要在B细胞和树突细胞上表达的ICOSL。所述分子似乎在T细胞效应子功能中很重要。
共抑制检查点分子包括但不限于A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、TIGIT和VISTA。
A2AR(腺苷A2A受体)被认为是癌症疗法中的重要检查点，因为在引起A2a受体活化的免疫微环境中的腺苷是负免疫反馈回路，并且肿瘤微环境中的腺苷浓度相对较高。
B7-H3，还称为CD276，最初被认为是共刺激分子，但现在被认为是共抑制分子。MacroGenics正在研究MGA271(依诺妥珠单抗(Enoblituzumab))，其是靶向B7-H3的Fc优化的单克隆抗体。
B7-H4(或VTCN1)由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞表达，并且在肿瘤逃逸中发挥作用。
BTLA(B和T淋巴细胞衰减子，还称为CD272)是共抑制受体，其配体为HVEM(疱疹病毒进入介质)。在人CD8+T细胞从原初到效应细胞表型的分化期间，BTLA的表面表达逐渐下调，然而肿瘤特异性人CD8+T细胞表达高水平的BTLA。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，还称为CD152)在Treg细胞上表达，并且用于控制T细胞增殖。CTLA-4(CD152)是起免疫检查点作用的蛋白质受体，并且由活化的T细胞表达并向T细胞传输抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28同源，并且两种分子与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(分别为B7-1和B7-2)结合。CTLA-4对CD80和CD86具有比CD28更大的亲和力和亲合力。CTLA4将抑制信号传输给T细胞。针对CTLA4的拮抗性抗体包含伊匹单抗和曲美木单抗(tremelimumab)。
IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)是具有免疫抑制性质的色氨酸分解代谢酶。另一种重要的分子是TDO色氨酸2,3-双加氧酶。已知IDO抑制T细胞和NK细胞，产生并活化Treg和骨髓源性抑制细胞，并促进肿瘤血管生成。
KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)是自然杀伤细胞上MHC I类分子的受体。利瑞鲁单抗(Lirilumab)是针对KIR的单克隆抗体。
LAG-3(淋巴细胞活化基因-3)通过对Treg的作用以及对CD8+T细胞的直接作用来抑制免疫应答。
PD-1(程序性死亡1或CD279)是通过抑制T细胞炎性活性在下调免疫系统和促进自我耐受性方面起重要作用的细胞表面受体。PD-1具有两种配体PD-L1和PD-L2。靶向PD-1的优势是其可以恢复肿瘤微环境中的免疫功能。PD1的配体PD-L1在几种癌症中高度表达，并且可以导致T细胞抗癌免疫应答的抑制。已经开发了许多靶向PD-1受体的癌症免疫治疗剂，包含拮抗性抗体纳武单抗(欧狄沃(Opdivo)-百时美施贵宝(Bristol Myers Squibb))、派姆单抗(可瑞达(Keytruda)，MK-3475，默克公司(Merck))、匹地利珠单抗(Pidilizumab)(CT-011，Cure Tech)和BMS-936559(百时美施贵宝)。阿特珠单抗(MPDL3280A，瑞士罗氏(Roche))和阿维鲁单抗(德国达姆施塔特的默克集团(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)和辉瑞(Pfizer))都是针对PD-1的配体PD-L1的单克隆抗体。
TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)在活化的人CD4+T细胞上表达并且调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3通过在与其配体半乳糖凝素-9相互作用时触发细胞死亡来充当Th1/Th17功能的负调节因子。
VISTA(T细胞活化的V结构域Ig抑制因子)是主要在造血细胞上表达，使得在肿瘤内的白细胞上的VISTA的一致表达可以允许VISTA阻断在广泛范围的实体瘤中有效的蛋白质。
TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，还称为WUCAM和Vstm3)是存在于某些T细胞和自然杀伤细胞上的免疫受体，并且调节T细胞介导的免疫力。TIGIT可以以高亲和力与DC和巨噬细胞上的CD155结合，并且以较低的亲和力与CD112结合。
本发明的共抑制淋巴细胞受体包括PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、BTLA或VISTA。本发明的共刺激淋巴细胞受体包括OX40、4-1BB、GITR、CD27、HVEM、CD28或CD40。
受体的抑制剂阻止相应受体产生信号。因此，共抑制淋巴细胞受体的抑制剂是阻止相应受体活化并且从而阻止抑制信号产生的分子。相反，受体的活化剂诱导相应受体产生信号，并且共刺激淋巴细胞受体的活化剂引起刺激信号的产生。
检查点调节剂是通过刺激或抑制免疫检查点分子的活性来干扰免疫检查点分子活性的分子。
可溶性检查点调节剂是可以能够自由扩散的分子，并且例如不与细胞膜结合或不保持在细胞内。
本发明意义上的检查点抑制剂包括淋巴细胞刺激性检查点调节剂，所述淋巴细胞刺激性检查点调节剂是通过共刺激检查点分子的活化或通过共抑制检查点分子的抑制来引起淋巴细胞，优选地效应子T细胞的活化的分子。此外，可溶性淋巴细胞刺激性检查点调节剂包含干扰膜结合的免疫检查点分子的活化的分子，如可溶形式的相应免疫检查点分子。
检查点调节剂可以是天然存在的分子或经工程化的分子，所述分子具有相应的干扰或调节免疫检查点分子的活性的功能。检查点调节剂包含例如针对具有激动性或拮抗性的免疫检查点分子以及免疫检查点分子的配体或经修饰的配体的抗体或抗体片段活性。
免疫细胞：
如本文所描述的免疫细胞涉及参与受试者的免疫应答的生物细胞。免疫细胞优选地选自T细胞、B细胞、树突细胞、粒细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、巨核细胞、单核白细胞/巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、血小板、红细胞(RBC)和/或胸腺细胞。
术语“免疫细胞”包括血液中包括的MNC，所述MNC还可以称为外周血单核细胞(PBMC)。PBMC包括任何具有圆形细胞核的外周血细胞，并且主要由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核白细胞组成，而红细胞和血小板没有细胞核，并且粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)具有多叶核。在人类中，淋巴细胞占PBMC群的大部分，其次是单核白细胞，并且树突细胞只占一小部分。这些细胞可以使用水溶性聚蔗糖(ficoll)，即一种分离血液各层的亲水性多糖和梯度离心来从全血中提取，所述梯度离心将血液分离成顶层血浆，然后是一层PBMC和底部的多形核细胞(如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞级分。多形核细胞可以通过裂解红细胞进一步分离。嗜碱性粒细胞有时在密集级分和PBMC级分中均有发现。
T细胞或T淋巴细胞是一种在细胞介导的免疫中起核心作用的淋巴细胞(白细胞的亚型)类型。T细胞或T淋巴细胞可以通过细胞表面上T细胞受体的存在与如B细胞和自然杀伤细胞等其它淋巴细胞区分开。T细胞的若干个亚群各自具有不同的功能。T细胞亚群包含但不限于1型辅助性T(Th1)细胞、2型辅助性T(Th2)细胞、9型辅助性T(Th9)细胞、17型辅助性T(Th17)细胞、22型辅助性T(Th22)细胞、滤泡辅助性T(Tfh)细胞、调节性T(Treg)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、γδT细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。T细胞的另外的非限制性实施例包含胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静息的T淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)或活化的T淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞通常是CD3和CD56阳性、非主要组织相容性复合物(MHC)限制性、自然杀伤(NK)样T淋巴细胞。T细胞可以是CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4 CD8 T细胞或任何其它T细胞亚群。
本发明具体地涉及优选地作为细胞疗法的用于治疗和/或预防已接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的免疫调节性NK细胞(immunoregulatory NKcell)(其还可以称为免疫调节性NK细胞(immunomodulatory NK cell))。
免疫调节性NK细胞是先天淋巴样细胞(ILC)的特定形式。ILC是一组先天免疫细胞，其属于淋巴细胞谱系(淋巴细胞)，但不以抗原特异性方式应答，因为其缺乏B或T细胞受体。此相对较近描述的一组细胞具有不同的生理功能，其中一些类似于辅助性T细胞，同时还包含细胞毒性NK细胞。因此，其在保护性免疫和调节稳态和炎症方面具有重要作用。自然杀伤(NK)细胞是类似于适应性免疫系统的细胞毒性T细胞的细胞毒性先天效应细胞。其分布在血液、器官和淋巴组织中，并且占外周血淋巴细胞的约15％。NK细胞在肿瘤监测和快速消除病毒感染的细胞方面发挥作用。其不需要MHC I类的缺失的“自我”信号，并且可以在没有抗体的情况下识别应激细胞，从而使其比适应性免疫系统反应得更快。自然杀伤(NK)细胞在宿主抗癌免疫中起着关键作用。作为应答，癌症发展出逃避NK细胞攻击或诱导缺陷型NK细胞的机制(Cheng M等人《细胞与分子免疫学(Cell Mol Immunol)》.2013年5月；10(3):230-52.doi:10.1038/cmi.2013.10.Epub 2013年4月22日.)。
本发明的免疫调节性NK细胞的特征优选地在于具体地CD56弱NK细胞上的低表达(或下调表达)或CD16。CD16是FcRγIII，其是一种可以诱导强烈的细胞因子产生的活化NK细胞受体。CD16的脱落/下调可以是NK细胞用于预防自身免疫的免疫调节机制。CD16下调调节NK细胞应答并且有助于维持抗体和T细胞依赖性通路的免疫稳态。此外，本发明的免疫调节性NK细胞可以显示GM-CSF、IFN-γ、TNF和/或IL-2的低表达。
在各实施例中，在样品中产生或诱导免疫调节性NK细胞可以通过比较在执行本发明的方法之前和之后的样品中NK细胞表型和NK细胞的群体分布来进行测量，例如通过流式细胞术、基因表达和/或蛋白质丰度的质谱分析。例如，在照射后从CD16-高到CD16-低NK细胞的转变指示免疫调节性表型的诱导。此外，NK细胞群中GM-CSF、IFN-γ、TNF和/或IL-2表达的降低还表明免疫调节性NK细胞的诱导。技术人员知道鉴定样品中的不同NK细胞群的合适方法和方案。例如，在血源性样品中，总NK细胞群可以优选地通过流式细胞术被定义并鉴定为CD45阳性、CD14阴性、CD3阴性、CD19阴性和CD56阳性细胞群。在此群体内，可以例如通过确定CD16、GM-CSF、IFN-γ、TNF和/或IL-2表达来执行免疫调节性NK细胞的进一步鉴定和定量。免疫调节性NK细胞对于CD56优选地呈阳性，但显示出的CD56表达水平相当低(“弱”表达)。
免疫调节性NK细胞的另外的特性和定义在本领域是熟知的并且是已知的多项研究和综述文章的主题或者可以由技术人员鉴定。
术语“免疫调节功能”涉及分子或细胞的功能或性质，所述功能或性质诱导免疫系统的任何组分的功能、动作或状态的变化或调节。
细胞疗法通常涉及施用从患者血液中分离的免疫细胞。可以以此方式使用的细胞类型是但不限于自然杀伤细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞、细胞毒性T细胞、单核白细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突细胞。树突细胞疗法通过使树突细胞呈递肿瘤抗原来引发抗肿瘤应答。树突细胞向淋巴细胞呈递抗原，这会使淋巴细胞活化，从而致敏淋巴细胞以杀死其它呈递抗原的细胞。
本发明的治疗应用
如本文所使用的，术语“受试者”是指被选择用于治疗或疗法的人或非人动物。如需要治疗或预防的受试者等受试者或患者可以是动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠(例如，小鼠)、犬(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、灵长类动物、猿猴(例如，猴子或猿)、猴子(例如，狨猴、狒狒)、猿(例如，大猩猩、黑猩猩、褐猿、长臂猿)或人类。术语“动物”、“哺乳动物”等的含义在本领域是众所周知的，并且例如可以从Wehner und Gehring(1995；蒂墨出版社(Thieme Verlag))推断。在本发明的上下文中，特别设想要对在经济上、农艺学或科学上具有重要意义的动物进行治疗。优选地，受试者/患者是哺乳动物。更优选地，受试者/患者是人类。
在本发明的实施例中，已经接受检查点抑制剂疗法的受试者患有癌症，如恶性黑色素瘤或可通过检查点抑制剂疗法治疗的另一种癌症。
在本发明的上下文中，术语“癌症”涉及所有种类的癌症的治疗，与癌症是否与实体瘤的形成无关或者与癌细胞是否不形成实体瘤无关，如某些白血病就是这种情况。
癌症包括一组可以影响身体任何部位的疾病，并且是由异常的细胞生长和增殖引起的。这些增殖细胞有可能侵入周围组织和/或扩散到身体的其它部位，在那里其形成转移。2012年，全世界有1400万例癌症新发病例和820万例癌症相关死亡(2014年世界癌症报告(World Cancer Report 2014))。大多数癌症是由涉及烟草使用、肥胖和感染等环境信号引起的，而大约5-10％是遗传病例。癌症可以基于起源细胞被分类为子类别。最常见的子类别是来自上皮细胞的癌、来自结缔组织的肉瘤以及来自造血细胞的淋巴瘤和白血病。癌症与许多种局部和全身症状相关，并且在许多情况下无法治愈。鉴于新癌症患者和癌症相关死亡人数众多，需要新的治疗策略。
根据本发明的癌症是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包含白血病、肉瘤、黑色素瘤和癌。可以治疗实体瘤和/或液体肿瘤(如白血病或淋巴瘤)。
黑色素瘤包含但不限于包含例如肢端雀斑样痣黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈丁-帕西黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
白血病包含但不限于急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病(aleukemic leukemia)、非白血病性白血病(a leukocythemic leukemia)、嗜碱细胞性白血病(basophylic leukemia)、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸细胞性白血病、格罗斯白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblasticleukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴原性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞白血病(micromyeloblastic leukemia)、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、内格利型白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、李德尔氏细胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏性白血病(Schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病和未分化细胞白血病。
肉瘤包含但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西肉瘤(Abernethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软部分肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯氏瘤肉瘤(Wilms'tumorsarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、恶性间皮瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯氏肉瘤(Rous sarcoma)、浆液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤和毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
癌包含但不限于腺泡癌、腺泡状癌、腺性囊性癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞瘤、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮(carcinoma cutaneum)、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌(carcinoma exulcere)、纤维癌、胶状癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌(hematoidcarcinoma)、肝细胞癌、许特尔氏细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、玻质状癌(hyalinecarcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(Krompecher's carcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌(carcinomamucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液质癌(carcinoma mucosum)、粘液样癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨样癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinomascroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌(carcinoma spongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticurn)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、块状癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。
另外的癌症包含但不限于霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
在一些实施例中，“肿瘤”应包含但不限于前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、鳞状细胞癌、乳腺肿瘤、黑色素瘤、基底细胞癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、胶质细胞瘤或如多形性胶质母细胞瘤等恶性星形细胞瘤、结直肠肿瘤、子宫内膜癌、肺癌、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewingsarcoma)/PNET和恶性淋巴瘤。这些包含原发性肿瘤以及转移性肿瘤(血管化和非血管化)。
如本文所使用的，“治疗”或“疗法”通常是指获得期望的药理效果和/或生理效果。所述效果就例如通过降低受试者患有特定疾病或症状的风险来完全或部分地预防疾病和/或症状而言可以是预防性的，或者就部分或完全治愈疾病和/或所述疾病的不良作用而言可以是治疗性的。在本发明中，“疗法”包含对哺乳动物，具体地人类的疾病或病状的任意治疗，例如以下(a)到(c)的治疗：(a)预防患者中疾病、病状或症状的发作；(b)抑制病状的症状，即预防症状的进展；(c)减轻病状的症状，即诱导疾病或症状的消退。
如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者提供细胞或含有液体或组合物，并且包含但不限于由医务专业人员施用和自我施用。可以使用本领域技术人员已知的多种方法之一向受试者施用组合物、物质、化合物或药剂。例如，化合物或药剂可以静脉内地、动脉地、皮内地、肌肉内地、腹膜内地、皮下地、眼部地、舌下地、口服地(通过摄入)、鼻内地(通过吸入)、脊柱内地、脑内地和透皮地(通过吸收，例如通过皮肤导管)施用。化合物或药剂还可以通过可充电或可生物降解的聚合物装置或其它装置，例如贴片和泵，或提供化合物或药剂的延长、缓慢或受控释放的调配物来适当地引入。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内执行施用。
本发明涵盖通过将治疗有效量的细胞，具体地本发明的免疫调节性NK细胞引入受试者的血流中来治疗患者。如本文所使用的，将细胞“引入”“受试者的血流中”应包含但不限于通过注射将此类细胞引入受试者的静脉或动脉之一中。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内执行此类施用。优选单次注射，但是在一些情况下可能需要随时间推移重复注射(例如，每周、每月、每季度、每半年或每年)。此类施用还优选地使用CD34-阴性细胞和药学上可接受的载体的混合物来执行。药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的，并且包含但不限于0.01-0.1M和优选地0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水，以及常用的专有冷冻保存培养基。施用还可以例如通过注射到受试者身体的靠近有症状的器官或组织的区域中来局部地进行。
另外，此类药学上可接受的载体可以是水溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液，最优选地是水溶液。水性载体包含水、醇溶液/水溶液、乳液和悬浮液，包含盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖以及氯化钠、乳酸化林格氏液(lactated Ringer's)和固定油。静脉内媒剂包含流体和营养补充剂、如林格氏右旋糖、基于林格氏右旋糖的那些补充剂等电解质补充剂等。通常用于静脉内施用的流体可在例如《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》,第20版,第808页,利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(LippincottWilliams S-Wilkins)(2000)中找到。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
在一个实施例中，施用治疗有效量的细胞。这可以涉及本发明的NK细胞或作为组合免疫疗法的治疗性免疫细胞。如本文所使用的，“治疗有效量的细胞”包含但不限于以下量和量范围：(i)约1×102到约1×108个细胞/kg体重；(ii)约1×103到约1×107个细胞/kg体重；(iii)约1×104到约1×106个细胞/kg体重；(iv)约1×104到约1×105个细胞/kg体重；(v)约1×105到约1×106个细胞/kg体重；(vi)约5×104到约0.5×105个细胞/kg体重；(vii)约1×103个细胞/kg体重；(viii)约1×104个细胞/kg体重；(ix)约5×104个细胞/kg体重；(x)约1×105个细胞/kg体重；(xi)约5×105个细胞/kg体重；(xii)约1×106个细胞/kg体重；以及(xiii)约1×107个细胞/kg体重。设想的人体重包含但不限于约5kg、10kg、15kg、30kg、50kg、约60kg、约70kg、约80kg、约90kg、约100kg、约120kg和约150kg。这些数字基于临床前动物实验和人体试验以及CD34+造血干细胞移植的标准方案。单核细胞(包含CD34+细胞)通常含有1:23000到1:300000 CD34阴性细胞。这些细胞数可以应用于本发明的NK细胞。
本公开还包含试剂盒、数据包和多容器单元以及本文描述的ECP系统及其组件的其它材料以及用于执行本发明的体外方法和治疗方法以及用于制备和分离本发明的NK细胞的材料。
附图
通过以下附图进一步描述了本发明。这些附图不旨在限制本发明的范围，而是代表为更好地说明本文所描述的发明而提供的本发明的各方面的优选实施例。
附图说明：
图1：难治性自身免疫性结肠炎对引起免疫调节性NK细胞的扩增的ECP的应答。
(a)示出了在不同治疗的情况下根据常见毒性标准的患者的腹泻严重程度(y轴)随时间(x轴)的变化。
(b)来自免疫检查点抑制剂相关结肠炎的初始诊断的结肠镜检查图像(左小图)和H&E染色活检切片(右小图)显示出粘膜水肿和溃疡。
(c)在成功的ECP治疗之后的结肠镜检查图像(左小图)和H&E染色活检切片(右小图)未显示出自身免疫性结肠炎的迹象。结肠隐窝示出无粒细胞浸润、凋亡或隐窝损失的常规形态。
(d)开始ECP之前和开始ECP后8周可视化患者的外周淋巴细胞隔室的tSNE绘图。
(e)ECP治疗之前和之后的相关NK细胞数量。
(f)通过UMAP可视化的在ECP开始之后第53周和第75周时来自健康的、年龄匹配的供体(HD，n＝5)和患者的NK细胞(定义为单个/活/CD45阳性/CD14阴性/CD3阴性/CD19阴性/CD56阳性)上CD16、CD56和CD57的表达强度。FlowSOM聚类的NK细胞亚群覆盖在右边的两个绘图上。
(g)CD56弱成熟NK细胞上CD16的MFI(中位数标志物表达，值范围：0-1)。HD(n＝5)，箱形图的箱须表示HD数据集的最小值和最大值。
(h)在如补充附录中所描述的抗PD-1抗体诱导的irAE的模型中在使用或不使用NK细胞(每小鼠4×104或4×105的NK剂量)的情况下被注射T细胞(Tc)的小鼠的存活率。**p＝0.003，****p<0.0001。
图2：
(a)利用指示标志物的表达显示出每个时间点的1000个随机选择的CD45+淋巴细胞(由FSC/SSC定义的淋巴细胞)的tSNE绘图。
(b)示出了每个带注解的群体的中位数标志物表达(值范围：0-1)的热图。
(c)在ECP治疗之前和之后的NK细胞的绝对计数。
(d)在ECP治疗之前和之后的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4-CD8-T细胞的相对数量。
(e)在ECP治疗之前和之后的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4-CD8-T细胞的绝对计数。
(f)通过UMAP可视化的在第53周和第75周时来自HD(n＝5)和患者的NK细胞(定义为单个/活/CD45阳性/CD14阴性/CD3阴性/CD19阴性/CD56阳性)上指示标志物的表达强度。
(g)示出了由FlowSOM聚类定义的带注解的NK细胞亚群的中位数标志物表达(值范围：0-1)的热图。
(h-j)健康的、年龄匹配的供体(HD)和患者的CD56强CD16弱未成熟NK细胞、CD56弱成熟NK细胞和CD57弱终末分化NK细胞上指示标志物的MFI(中位数标志物表达，值范围：0-1)(在开始ECP之后第53周和第75周)。HD(n＝5)，箱形图的箱须表示HD数据集的最小值和最大值。
图3：
(a)-(d)健康的、年龄匹配的供体(HD)和患者的CD56强NK细胞、CD56弱NK细胞、CD4+记忆T细胞、CD4+原初细胞和CD8+T细胞内的细胞因子表达性细胞的百分比(在开始ECP之后第53周和第75周)。HD(n＝5)，箱形图的箱须表示HD数据集的最小值和最大值。
图4：
(a)将患者T细胞单独或者与NK细胞一起过继转移到Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中并且通过用抗PD-1抗体处理诱导免疫检查点抑制剂相关自身免疫的实验模型。
(b)在如(a)中所示注射患者T细胞和NK细胞之后第15天从Rag2-/-Il2rg-/-小鼠分离的肝脏、皮肤、肺和结肠的组织病理学嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润评分。
图5：
(a)在不注射患者源性细胞的情况下用抗PD-1抗体处理的Rag2-'-I！2rg-'-小鼠(阴性对照)的处理方案。
(b)在如(a)中所示开始处理之后第15天从Rag2-/-Il2rg-/-小鼠分离的肝脏、肺、皮肤和结肠的嗜中性粒细胞浸润评分。
(c)如(a)中所描述的那样进行处理的Rag2-/-Il2rg-/-小鼠的存活率。
图6：
(a)处理方案：如所指示的，用DSS(3％)、抗PD1和ECP处理小鼠。
(b)如所指示的，未经处理的或用DSS(3％)、抗PD1单独处理或与ECP组合处理的小鼠的重量曲线。
(c)在每组5个小鼠中定量结肠长度。组如小图B中所指示。
(d)每组一个小鼠的代表性结肠。组如小图B中所指示。
(e)如小图B中所指示的组的结肠的代表性HE染色切片。
(f)如小图B中所指示的组的结肠的组织病理学评分。
图7：
(a)处理方案：如所指示的，小鼠被静脉内注射B16黑色素瘤细胞并且随后用抗PD1、泼尼松龙或ECP处理。
(b)被静脉内注射B16黑色素瘤细胞并且随后用抗PD1、泼尼松龙或ECP处理的小鼠的存活率。
实例
在以下实例中进一步描述了本发明。这些附图不旨在限制本发明的范围，而是代表为更好地说明本文所描述的发明而提供的本发明的各方面的优选实施例。
这里报道了患有伊匹单抗/纳武单抗诱导的结肠炎、对多种免疫抑制药物是难治的患者在与免疫调节性自然杀伤(NK)细胞的扩增相一致的体外光分离置换法(ECP)之后实现了完全应答。
实例的结果
29岁的男性患者因转移性黑色素瘤而用伊匹单抗和纳武单抗进行治疗。在两次剂量之后，患者出现了皮炎、甲状腺炎、肝炎和结肠炎。结肠炎是基于在活检(图1a、b)中鉴定的肉眼可见的粘膜溃疡和上皮内细胞凋亡以及隐窝损失来诊断的。尽管在停止伊匹单抗/纳武单抗和皮质类固醇治疗之后皮炎、甲状腺炎和肝炎消退，但是患者在接下来的20周内经历了三次结肠炎发作(CTC-AE II-III°)。这些结肠炎阶段用皮质类固醇(在ECP之前共23周)、英夫利昔单抗(在ECP之前18周和15周的2次单个剂量)以及环孢霉素(在ECP之前14周，图1a和表1)进行治疗。
因为没有持久的应答，所以患者接受了ECP。在接下来的8个月期间，患者每2-4周连续数天经历2个ECP周期。ECP被良好耐受并且引起了完全应答(图1a)。免疫抑制逐渐减弱而没有出现症状反弹。通过结肠镜检查证实了结肠炎的持续缓解(图1c)。免疫检查点抑制剂治疗在首次出现irAE的表现形式之后中止并且从未重新开始。
分析了在ECP治疗之前和期间的多个时间点的外周血白细胞隔室。观察到具有免疫调节性表型(图1f、g)的NK细胞(图1d-e、图2a-j)增加了4倍。而且，与年龄匹配的健康供体相比，患者中的多种促炎性细胞因子更低(图3a-e)。从而支持了这一观点，即NK细胞调节自身免疫性，患者的NK细胞的过继转移预防鼠irAE模型中由人T细胞和抗PD-1抗体治疗以剂量依赖性方式触发的irAE(图1h和图4a、b)。对照实验证实了发病率是由患者源性T细胞介导的(图5)。
ECP是用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的确立已久的疗法4并且引起GVHD患者中NK细胞的增加5。迄今为止一直缺乏关于ECP用于irAE治疗的安全性和功效的数据。此病例报告表明ECP通过扩增保护性NK细胞群而可以是用于难治性检查点抑制剂相关结肠炎的有效疗法。
ECP在不阻断抗黑色素瘤作用的情况下减少了免疫介导的不良事件
基于以上呈现的表明体外光分离置换法(ECP)减少了因转移性黑色素瘤而已经用组合的免疫疗法(纳武单抗、伊匹单抗)治疗的患者的免疫相关结肠炎的结果(图1-5)，接下来计划在用于irAE的体内模型中测试此结果。为了诱导结肠炎，根据先前的报告用3％DSS和抗PD1(图6A)对小鼠进行处理(19)。所述处理降低了小鼠的体重，这与结肠炎的发展相一致，并且通过ECP处理减少了重量损失(图6B)。与仅用抗PD1处理的组相比，ECP处理还增加了结肠长度(图6C、D)。结肠长度据报道是免疫疗法诱导的结肠炎的严重程度的替代参数(19)。与减轻的结肠炎严重程度相一致，观察到与仅用抗PD1处理的组相比，在用ECP处理的小鼠的结肠壁中嗜中性粒细胞的浸润降低(图6E、F)。这些发现表明ECP减轻了小鼠的抗PD1诱导的结肠炎。
为了理解ECP的免疫调节效果是否与抗肿瘤活性的损失相关，接下来单独使用或与糖皮质激素泼尼松龙或ECP组合使用抗PD1来对携带黑色素瘤的小鼠进行处理(图7A)。观察到与仅用抗PD1处理的组相比，泼尼松龙降低了携带黑色素瘤的小鼠的存活率(图7B)。相比之下，用抗PD和ECP处理的组具有与仅用抗PD1处理的组相当的结果(图7B)。这些发现表明ECP不干扰由抗PD1处理诱导的抗黑色素瘤应答。
实例的讨论
机制的讨论：NK细胞发挥了包含抗炎活性的各种异型免疫学功能。在GVHD的鼠模型中，NK细胞的转移改善了存活率，这取决于完整TGF-β信号传导6。在另一个临床前GVHD研究中，NK细胞诱导了穿孔素和Fas配体介导的同种异体反应T细胞增殖降低并且增加了T细胞凋亡7。c-Kit-CD27-CD11b+群体被鉴定为能够控制GVHD而不干扰移植物抗白血病(GVL)效果的特定效应子NK细胞亚群8。在人类中，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)在GVH方向上的单倍型相合同种异体HCT中的不匹配降低了由NK细胞介导的GVHD的风险9。
ECP是GVHD的有效治疗方法。先前已经观察到用于广泛慢性GVHD的ECP期间NK细胞的增加10。患有急性GVHD的患者具有更高频率的NKG2D和CD62L表达更强的CD56明NK亚群11。在同一研究中，具有更高CD57和CD11b表达的CD56-CD16+NK细胞在患有慢性cGVHD的患者中增加。ECP在保护专门的抗病毒和抗白血病CD57+NKG2C+CD56弱亚群的情况下使NK细胞群体朝更具免疫调节性的表型转变11。假设类似的机制可以是NK细胞针对irAE的保护效果的原因。当将患者的NK细胞隔室与年龄和性别匹配的健康对照的NK细胞隔室进行比较时，观察到CD16表达，具体地CD56弱NK细胞上的所述表达的下调。CD16是FcRγIII，其是一种可以诱导强烈的细胞因子产生的活化NK细胞受体。先前的研究表明，CD16的脱落可以是用于预防自身免疫的免疫调节机制12。CD16下调调节NK细胞应答并且有助于维持抗体和T细胞依赖性通路的免疫稳态13。支持此假设的是，当与对照组相比时，在患者的NK细胞中GM-CSF、IFN-γ、TNF和IL-2的表达更低。
实例中采用的方法
ECP程序：
在施用甲氧沙林(Methoxsalen)
Figure BDA0003693636850000321
的情况下在Therakos CellEx光分离置换法系统上进行体外光分离置换法。连续数天执行两次程序，其中每次程序期间处理1500ml血液。在德国弗莱堡阿尔伯特路德维希大学(the Albert Ludwigs University,Freiburg,Germany)伦理委员会批准(协议号300/16)后并在根据《赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)》获得书面知情同意后，收集所有人类样品。
irAE的鼠模型
根据制造商的说明，使用Pan T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec))使用阴性选择从患者的外周血中分离T细胞。根据制造商的说明，使用人类NK细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司)从患者的外周血中分离NK细胞。在使用或不使用4×104或4×105个NK细胞的情况下向Rag2-/-Il2rg-/-小鼠静脉内注射3×105个T细胞。从注射后的第1天到第22天，小鼠每周用8mg/kg体重抗PD-1抗体(克隆J43)处理两次，并且每周用1mg/kg体重LPS处理一次，均通过腹膜内注射施加(图4a)。将在人T细胞注射后第15天收集的皮肤、肝脏、结肠和肺的切片用苏木精-曙红染色，并由经验丰富的病理学家基于人irAE的组织病理学表征来进行评分，所述组织病理学表征包含淋巴细胞和嗜中性粒细胞浸润、隐窝脓肿和凋亡细胞14,15。所有动物研究均已获得德国弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学的实验动物的使用和护理大学机构审查委员会的批准(协议批准号：G17-049、X13-07J、X15-10A)。
流式细胞术
为了在ECP疗法期间和之后监测淋巴细胞谱系群，分离了患者的外周血淋巴细胞并将所述外周血淋巴细胞用针对CD45、CD19、CD3、CD4、CD8、CD16、CD56和HLA-DR的标准化抗体组进行染色，作为常规诊断的一部分。在FlowJo(V10)中对数据进行补偿，使用R环境(Renvironment)17导出淋巴细胞。如先前所述的那样执行tSNE和FlowSOM聚类16。
对于多参数NK细胞表型化和细胞因子分析，根据制造商的说明使用密度梯度培养基(Lymphoprep，STEMCELL技术(STEMCELL Technologies))分离外周血淋巴细胞。将解冻的外周血淋巴细胞用表S2中列出的抗体染色。Zombie Aqua可固定活力试剂盒(Zombie AquaFixable Viability kit)(百进生物公司(Biolegend))用于活/死的辨别。为了产生细胞因子，将细胞在存在GolgiPlug(BD生物科学公司(BD Biosciences))的情况下用50ng/ml PMA(Axon Lab)和500mg/ml离子霉素(西格玛(Sigma))刺激4小时。根据制造商的方案，使用BDCytofix/Cytoperm试剂盒(BD生物科学公司)执行细胞内染色。在Aurora流式细胞仪(Cytek)上采集数据，并使用FlowJo(Flowjo V10.6.1，LLC)软件对所述数据进行补偿。使用R环境17导出并分析图中指定的细胞群。如所描述的那样处理数据以用于FlowSOM聚类16。为了降维，使用了UMAP数据包18。
统计
使用GraphPad Prism Lab软件V7.0执行统计分析。通过双尾不配对学生t检验(two-tailed unpaired Student's t test)执行两个组的比较。使用Mantel Cox(对数秩)检验评估存活率(卡普兰-梅尔存活曲线(Kaplan-Meier survival curve))的差异。如果没有另有说明，则数据以平均值±SEM的形式呈现。p值<0.05被认为是显著的。
实例的表
表1：疾病和疗程。
Figure BDA0003693636850000331
患者在ECP开始前20周首次出现结肠炎发作。当时，已经因先前的免疫检查点抑制剂相关肝炎、甲状腺炎和皮炎而用类固醇治疗了3周。结肠炎在类固醇逐渐减量期间发生。因此，增加了类固醇剂量，并且由于应答不足，施用一次英夫利昔单抗5mg/kg BW。症状消退。在类固醇逐渐减量后，患者在ECP开始前16周经历了第二次结肠炎发作。接受了增加剂量的甲泼尼龙和第二剂英夫利昔单抗的治疗。腹泻对此疗法是难治的，并且因此添加了环孢霉素A。症状再次消退。随着环孢霉素A剂量的减少，患者出现了第三次结肠炎发作。在这里，开始ECP治疗。在ECP开始后两周，患者排泄频率正常。环孢霉素A治疗在ECP开始后8周中止，皮质类固醇治疗在ECP开始后12周中止，没有任何症状反弹。ECP共执行32周。在最后一次ECP后11个月的随访中，患者在irAE和黑色素瘤表现形式方面均保持完全缓解。
表2：用于利用人细胞的流式细胞术的抗体。
抗原 荧光染料 克隆 制造商
CD16 BUV495 3G BD
CD14 BUV563 M5E2 BD
CD45RO BUV615 UCHL1 BD
CD3 BUV661 UCHT1 BD
CD45 BUV805 HI-30 BD
NKp46 BV421 9E2 百进生物公司
CD56 BV480 NCAM16.2 BD
CD8 BV570 RPA-T8 百进生物公司
CD4 BV711 OKT4 百进生物公司
CD4 APC-Cy7 RPA-T4 BD
CD94 BV786 HP-3D9 BD
CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1 百进生物公司
TIGIT PE MBSA43 eBioscience
CD62L PE-Cy5 DREG-56 BD
KLRG1 PE-Cy7 13F12F2 赛默飞世尔科技(ThermoScientific)
NKG2D APC 1D11 百进生物公司
NKG2C AF488 134591 R&D
CD19 BUV737 SJ25C1 BD
CD19 APC-Vio770 REA675 美天旎公司(Miltenyi)
IL-2 BV711 MQ1-17H12 百进生物公司
TNF BV785 Mab11 百进生物公司
IFNγ PE-Cy7 4S.B3 eBioscience
GM-CSF PE BVD2-21C11 BD
参考文献
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Claims (15)

1.一种方法，其包括以下步骤：
-提供源自受试者的血液样品的样品，所述受试者已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状，
-向所述样品中添加光增敏剂，以及
-使所述样品经受照射。
2.根据权利要求1所述的方法，其中向所述样品中添加光增敏剂并且使所述样品经受照射在所述样品中产生或诱导免疫调节性NK细胞(的形成)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光增敏剂是8-甲氧基补骨脂素和/或所述照射是UVA照射。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者显示出irAE的症状或遭受irAE。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述受试者中出现irAE的症状和/或表现形式之后中止所述检查点抑制剂疗法，或者其中irAE的症状和/或表现形式在中止所述检查点抑制剂疗法之后出现，和/或其中irAE的症状和/或表现形式在中止所述检查点抑制剂疗法之后持续存在。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述irAE包括自身免疫疾病的症状和/或是由自身免疫反应引起的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述irAE包括自身免疫性结肠炎。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症，如恶性黑色素瘤或能通过检查点抑制剂疗法治疗的另一种癌症。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者正在接受免疫抑制药物，如类固醇、皮质类固醇、环孢霉素和/或抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗(infliximab))和/或对免疫抑制药物是难治的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂疗法包括施用抗CTLA4抗体和抗PD-1抗体中的至少一种。
11.一种免疫调节性NK细胞，其从包括以下步骤的方法获得：
-提供源自受试者的所分离的血液样品的样品，
-向所述样品中添加光增敏剂，以及
-使所述样品经受照射。
12.根据前述权利要求所述的免疫调节性NK细胞，其中所述血液样品来自已经接受检查点抑制剂疗法并且怀疑出现或者已经出现免疫相关不良事件(irAE)的症状的受试者。
13.一种用于治疗和/或预防已经接受检查点抑制剂疗法的受试者的免疫相关不良事件(irAE)的免疫调节性NK细胞。
14.根据前述权利要求所述的供使用的免疫调节性NK细胞，其中所述免疫调节性NK细胞已经通过向源自人类受试者的血液样品的样品中添加光增敏剂并且使所述样品经受照射而产生。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的供使用的免疫调节性NK细胞，其中所述NK细胞相对于所述受试者是自体的，和/或其中在检查点抑制剂疗法持续进行的同时，将所述NK细胞施用于所述受试者。
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