CN114887076A - 一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有化疗‑免疫功能的混合三嵌段胶束及其制备方法和应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明设计了一种三嵌段有规聚合物‑药物偶联体并用其制备了可以顺序响应肿瘤微酸以及还原环境的混合聚合物纳米胶束用于共递送喜树碱(CPT)和Toll样7/8受体(TLR 7/8)激动剂IMDQ。经瘤内注射后，由于微肿瘤酸性环境，PEPEMA质子化并变为带正电荷的亲水片段，促进胶束分解为PCPT和PIMDQ，最终在近端瘤和远端肿瘤中引发了强烈的抗肿瘤免疫反应，从而为缓解肿瘤免疫抑制微环境、引发持久的抗肿瘤免疫反应、消除实体瘤的化学免疫治疗提供了一个有前景的平台，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
免疫疗法是一种很有前景的癌症治疗策略，它旨在利用人体自身的免疫系统引发针对各种恶性肿瘤的持久免疫反应。然而，在临床上，持久的抗肿瘤免疫反应仅在具备高CTL浸润和低免疫抑制细胞(Treg、M2巨噬细胞、MDSC)的“免疫原性表型”肿瘤中存在。因此，为产生持久的抗肿瘤免疫反应，免疫原性表型较低的肿瘤比如结直肠癌、乳腺癌等对免疫治疗的反应率亟需提高。
同时解除免疫抑制状态并增强肿瘤CTL浸润的策略具有广阔的发展前景。据报道，喜树碱(CPT)是一种常用的化疗药物，可通过降低Foxp3的表达来抑制Treg。对咪喹莫特的结构做了进一步的改进所得到的IMDQ，其不仅结构易于修饰而且具有激动TLR7/8、将促肿瘤的M2巨噬细胞复极化为抗肿瘤的M1巨噬细胞的作用。因此，CPT和IMDQ的联合应用，通过降低Treg和复极化M2巨噬细胞可以逆转肿瘤免疫抑制状态，为产生高免疫原性表型肿瘤提供了平台。尽管这些药物联合应用的治疗潜力巨大，但克服药物在肿瘤的深度渗透和按需释放等多重障碍，实现它们的精确递送，仍具有挑战性。针对上述障碍，有文献报道了电荷反转和粒径减小的策略可实现药物的深度肿瘤渗透。此外，通过在制剂中引入，如pH、GSH、MMP-2等肿瘤微环境刺激响应的设计，可实现药物的可控释放。其中，肿瘤细胞中的GSH浓度为2-10×10-3M远高于正常细胞内的GSH浓度。因此，仅在肿瘤细胞中可实现GSH响应的药物释放。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束及其制备方法和应用。本发明设计了一种三嵌段有规聚合物-药物偶联体并用其制备了可以顺序响应肿瘤微酸以及还原环境的混合聚合物纳米胶束(NanoPCPT+PIMDQ)用于共递送喜树碱(CPT)和Toll样7/8受体(TLR 7/8)激动剂IMDQ。NanoPCPT+PIMDQ由亲水段PEG外层，酸敏感EPEMA中间层以及药物核心组成。经瘤内注射后:i)NanoPCPT+PIMDQ响应酸性环境深入渗透并分解释放PIMDQ和PCPT；ii)DCs被PIMDQ激活以增加CTLs的浸润。iii)PIMDQ使M2巨噬细胞复极化为M1巨噬细胞，PCPT使Treg的比例降低，以上两者的联合作用逆转了癌症的免疫抑制状态。本发明NanoPCPT+PIMDQ通过以可控的方式递送CPT和TLR7/8激动剂，缓解了肿瘤免疫抑制状态，并增强了肿瘤CTL的浸润，为协同肿瘤化学免疫治疗提供了一个有前景的平台。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束(NanoPCPT +PIMDQ)，所述胶束包括：亲水性聚(乙二醇)(PEG)外层、疏水性聚(2-(N-乙基-N-丙基氨基)乙基甲基丙烯酸乙酯)(PEPEMA)中间层和疏水性药物内核。
其中，所述疏水性药物包括聚还原反应性喜树碱(CPT)前药(PCPT)和/或聚IMDQ(PIMDQ)。
当瘤内注射后，由于微肿瘤酸性环境，PEPEMA质子化并变为带正电荷的亲水片段，促进NanoPCPT+PIMDQ分解为PCPT和PIMDQ。PIMDQ激动TLR7/8从而激活树突细胞(DCs)并促进M2巨噬细胞重新极化为抗肿瘤的M1巨噬细胞。PCPT响应于肿瘤细胞内的GSH所释放出的游离喜树碱不仅导致了肿瘤细胞死亡而且降低了Treg上Foxp3的表达，最终在近端瘤和远端肿瘤中引发了强烈的抗肿瘤免疫反应。
所述胶束为纳米级胶束。
本发明的第二个方面，提供上述混合三嵌段胶束的制备方法，所述制备方法包括：
S1、合成聚乙二醇-4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(PEG-DCT)；
S2、合成2-(N-乙基-N-丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(EPEMA)单体；
S3、合成丙烯酰丙酮肟(AA)；
S4、合成还原响应喜树碱单体(OH-2S-CPT)；
S5、合成三嵌段聚合物-喜树碱偶联体(PEG-PEPEMA-PCPT)；
S6、合成三嵌段聚合物-IMDQ偶联体(PEG-PEPEMA-PIMDQ)。
本发明的第三个方面，提供上述混合三嵌段胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物其活性成分包含上述胶束。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
本发明的第五个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述胶束或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供设计了一种三嵌段有规聚合物-药物偶联体并用其制备了可以顺序响应肿瘤微酸以及还原环境的混合聚合物纳米胶束(NanoPCPT+PIMDQ)用于共递送喜树碱(CPT)和Toll样7/8受体(TLR 7/8)激动剂IMDQ。NanoPCPT+PIMDQ由亲水段PEG外层，酸敏感EPEMA中间层以及药物核心组成。经瘤内注射后，由于微肿瘤酸性环境，PEPEMA质子化并变为带正电荷的亲水片段，促进NanoPCPT+PIMDQ分解为PCPT和PIMDQ。PIMDQ激动TLR7/8从而激活树突细胞(DCs)并促进M2巨噬细胞重新极化为抗肿瘤的M1巨噬细胞。PCPT响应于肿瘤细胞内的GSH所释放出的游离喜树碱不仅导致了肿瘤细胞死亡而且降低了Treg上Foxp3的表达，最终在近端瘤和远端肿瘤中引发了强烈的抗肿瘤免疫反应，从而为缓解肿瘤免疫抑制微环境、引发持久的抗肿瘤免疫反应、消除实体瘤的化学免疫治疗提供了一个有前景的平台，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中EPEMA、AA、OH-2S-CPT单体的合成路线；
图2为本发明实施例中PEG-PEPEMA-PCPT、PEG-PEPEMA-PIMDQ的合成路线；
图3为本发明实施例中2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺的1H NMR；
图4为本发明实施例中EPEMA的1H-NMR谱；
图5为本发明实施例中AA的1H-NMR谱；
图6为本发明实施例中OH-2S-CPT的1H-NMR；
图7为本发明实施例中PEG-DCT的1H-NMR；
图8为本发明实施例中PEG-PEPEMA的1H-NMR；
图9为本发明实施例中PEG-PEPEMA-PAA的1H-NMR；
图10为本发明实施例中PEG-PEPEMA-PCPT的紫外分光光度图谱；
图11为本发明实施例中PEG-PEPEMA-PIMDQ的紫外分光光度图谱；
图12为本发明实施例中纳米胶束的表征；其中，a)NanoPCPT+PIMDQ的计数率(CountRate)及其在各种pH条件下的TEM图像(比例尺：100nm)。b)NanoPCPT+PIMDQ在各种pH条件下的Zeta电位。c)DTT触发的NanoPCPT体外CPT释放。
图13为本发明实施例中pH值对纳米胶束吸收的影响；纳米胶束具有肿瘤特异性药物释放特性；a)在不同pH值下肿瘤细胞对纳米胶束的体外摄取。b)CCK8用于检测与不同药物孵育后CT26细胞的活力(n＝6)。
图14为本发明实施例中纳米胶束对骨髓来源的树突细胞(BMDCs)和巨噬细胞有良好的免疫作用；a)NanoPIMDQ诱导的体外BMDCs成熟，通过流式细胞术对在CD11C+细胞门里的CD80、CD86进行定量(n＝3)。b)用RAW 264.7巨噬细胞研究体外M2巨噬细胞复极化为M1巨噬细胞的情况。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.00；
图15为本发明实施例中NanoPCPT+PIMDQ提高体内抗肿瘤活性；a)不同组PBS、CPT、NanoPCPT和NanoPCPT+PIMDQ对抑制BALB/c小鼠近端肿瘤生长的曲线(n＝6)。b)不同处理组小鼠远端肿瘤的生长曲线。数据显示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，免疫疗法在癌症中显示出优越的疗效。但由于免疫抑制型细胞，比如M2巨噬细胞、Treg的存在和细胞毒性T细胞(CTL)渗透不足所形成的肿瘤免疫抑制微环境(TIME)减弱了免疫疗法的疗效。此外，肿瘤内有限的药物渗透深度以及不可控制的药物释放进一步抑制了免疫疗法的结果。
有鉴于此，本发明设计一种肿瘤微环境级联响应的三嵌段混合纳米聚合物胶束(NanoPCPT+PIMDQ)。NanoPCPT+PIMDQ由亲水性聚(乙二醇)(PEG)外层、疏水性聚(2-(N-乙基-N-丙基氨基)乙基甲基丙烯酸乙酯)(PEPEMA)中间层和疏水性药物内核(聚还原反应性喜树碱(CPT)前药(PCPT)或聚IMDQ(PIMDQ))组成。NanoPCPT+PIMDQ级联响应pH和GSH后，可增加药物在肿瘤的深层渗透和按需释放，以可控的方式递送CPT和TLR7/8激动剂。瘤内注射后，由于微肿瘤酸性环境，PEPEMA质子化并变为带正电荷的亲水片段，促进NanoPCPT+PIMDQ分解为PCPT和PIMDQ。PIMDQ激动TLR7/8从而激活树突细胞(DCs)并促进M2巨噬细胞重新极化为抗肿瘤的M1巨噬细胞。PCPT响应于肿瘤细胞内的GSH所释放出的游离喜树碱不仅导致了肿瘤细胞死亡而且降低了Treg上Foxp3的表达，最终在近端瘤和远端肿瘤中引发了强烈的抗肿瘤免疫反应。所得结果表明，本发明的策略为缓解肿瘤免疫抑制微环境、引发持久的抗肿瘤免疫反应、消除实体瘤的化学免疫治疗提供了一个有前景的平台。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束(NanoPCPT+PIMDQ)，所述胶束包括：亲水性聚(乙二醇)(PEG)外层、疏水性聚(2-(N-乙基-N-丙基氨基)乙基甲基丙烯酸乙酯)(PEPEMA)中间层和疏水性药物内核。
其中，所述疏水性药物包括聚还原反应性喜树碱(CPT)前药(PCPT)和/或聚IMDQ(PIMDQ)。
当瘤内注射后，由于微肿瘤酸性环境，PEPEMA质子化并变为带正电荷的亲水片段，促进NanoPCPT+PIMDQ分解为PCPT和PIMDQ。PIMDQ激动TLR7/8从而激活树突细胞(DCs)并促进M2巨噬细胞重新极化为抗肿瘤的M1巨噬细胞。PCPT响应于肿瘤细胞内的GSH所释放出的游离喜树碱不仅导致了肿瘤细胞死亡而且降低了Treg上Foxp3的表达，最终在近端瘤和远端肿瘤中引发了强烈的抗肿瘤免疫反应。
本发明的又一具体实施方式中，所述胶束为纳米级胶束。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述混合三嵌段胶束的制备方法，所述制备方法包括：
S1、合成聚乙二醇-4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(PEG-DCT)；
S2、合成2-(N-乙基-N-丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(EPEMA)单体；
S3、合成丙烯酰丙酮肟(AA)；
S4、合成还原响应喜树碱单体(OH-2S-CPT)；
S5、合成三嵌段聚合物-喜树碱偶联体(PEG-PEPEMA-PCPT)；
S6、合成三嵌段聚合物-IMDQ偶联体(PEG-PEPEMA-PIMDQ)。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1具体方法包括：
将4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(DCT)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)溶解在无水二氯甲烷中进行室温搅拌得混合物；随后，将溶解在无水二氯甲烷中的聚乙二醇加入上述混合物；将反应液在室温下持续搅拌，过滤反应液，取滤液，析出纯化后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸、4-二甲氨基吡啶和N,N-二环已基碳二亚胺和聚乙二醇的摩尔比为0.1-1：0.1-1：0.1-1：0.1-0.5；优选为0.403：0.403：0.403：0.31；
本发明的又一具体实施方式中，所述析出纯化的具体步骤包括：
将浓缩后的滤液加入冷乙醚中析出沉淀；将离心所得的沉淀物用无水二氯甲烷复溶后，再加入冷乙醚中进行沉淀并离心，重复2-3次；最后将所得沉淀收集起来，干燥后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2具体方法包括：
将N-乙基乙醇胺、溴丙烷、Na2CO3溶于乙醇中，然后加热搅拌，过滤混合物，浓缩所得滤液，用无水二氯甲烷萃取，减压蒸发，即得2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺；然后将2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺、三乙胺溶于乙腈中，然后将此混合物置于低温搅拌得混合液；随后，将甲基丙烯酰氯加入上述混合液中；将所得混合物在低温下搅拌，再将其移至室温继续搅拌，过滤混合物，所得滤液用无水二氯甲烷萃取，旋蒸浓缩，得到单体EPEMA。
本发明的又一具体实施方式中，所述N-乙基乙醇胺、溴丙烷、Na2CO3的摩尔比为0.1-0.5:0.1-0.6：0.15-1.0，优选为0.3:0.36:0.45；
所述2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺、三乙胺和甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.1-1:0.1-1:0.1-1，优选为1:1:1；
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3具体方法包括：
将丙酮肟水溶液置于低温冷肼中搅拌；在低温条件下将丙烯酰氯缓慢加入上述溶液中；加毕，将此反应液移至室温继续搅拌；停止搅拌并静置反应液以分离水层和二氯甲烷层；将收集的水层用二氯甲烷萃取，合并所有收集的二氯甲烷层并对其进行旋蒸浓缩；浓缩后的有机相洗涤、干燥、纯化后即得。
其中，所述丙酮肟和丙烯酰氯的摩尔比为0.1-1:0.1-1，优选为0.544:0.552；所述有机相洗涤、干燥、纯化的具体步骤包括：浓缩后的有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤，有机相用Na2SO4干燥，旋蒸除去DCM，即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S4的具体方法包括：
将2-羟基乙基二硫化物、TEA溶于四氢呋喃并将此混合物冷却至低温；将甲基丙烯酰氯加入其中，将混合物在低温下搅拌并在室温下搅拌过夜；过滤混合物，所得滤液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得淡黄色油状液体；随后，将CPT、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三光气溶解在无水二氯甲烷中，于室温下持续搅拌；随后，缓慢加入溶解于无水二氯甲烷中的2-[(2-羟基乙基)二硫代]2-甲基-2-丙烯酸乙酯，并将反应溶液连续搅拌过夜；通过减压除去溶剂，硅胶柱色谱即得。
其中，2-羟基乙基二硫化物、TEA和甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.1-1:0.1-1:0.1-1，优选为1:1:1；
所述CPT、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三光气、2-[(2-羟基乙基)二硫代]2-甲基-2-丙烯酸乙酯的摩尔比为1-5:10-15:1-3:2-5，优选为2.87:11.48:1.15:3.157。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S5的具体方法包括：
首先，通过RAFT聚合反应合成PEG-PEPEMA两嵌段链转移剂，包括：将PEG-DCT、EPEMA、2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)溶解在1,4-二氧六环里，经冻融循环除氧后，将反应液置于高温中以引发聚合反应并搅拌，将反应液溶液冷却至室温停止反应，并用去离子水透析的方法对聚合物进行纯化即得；
然后，将PEG-PEPEMA、OH-2S-CPT、AIBN溶于1,4-二氧六环和二甲亚砜(DMSO)的混合溶液中，经冻融循环除氧后，将反应液置于高温中以引发聚合反应并搅拌，将反应液溶液冷却至室温停止反应，并通过在冷乙醚中沉淀纯化聚合物前药，将沉淀干燥后即得。
具体的，所述PEG-DCT、EPEMA、2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)的摩尔比为0.01-0.1:1-5:0.01-0.03，优选为0.05:2.51:0.015；
所述PEG-PEPEMA、OH-2S-CPT、AIBN的摩尔比为0.01-0.05:0.5-1:0.001-0.01，优选为0.024:0.725:0.007；
所述1,4-二氧六环和二甲亚砜的混合溶液中，二者体积比为0.5-5:1，优选为1:1；
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S6中，具体合成方法包括：
所述PEG-PEPEMA-PIMDQ经IMDQ取代PEG-PEPEMA-PAA聚合物上的AA部分得到；具体的，首先合成PEG-PEPEMA-PAA：将PEG-PEPEMA、AA、AIBN溶解于1,4-二氧六环里，经冻融循环除氧后，将反应液置于高温中以引发聚合反应并搅拌，并用去离子水透析的方法对聚合物进行纯化即得；
利用IMDQ上的氨基取代了PEG-PEPEMA-PAA上的PAA部分；具体的，将PEG-PEPEMA-PAA、IMDQ、TEA溶于1,4-二氧六环中，在惰性气体氛围下，升温搅拌；冷却反应液并用水透析过夜，冻干后即得。
其中，所述PEG-PEPEMA、AA和AIBN的摩尔比为0.01-0.1:1-2:0.01-0.05，优选为0.044:1.309:0.013；
所述PEG-PEPEMA-PAA、IMDQ和TEA的摩尔比为0.001-0.005:0.01-0.05:0.02-0.06，优选为0.00115:0.0125:0.0374。
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括：制备混合胶束，具体的，将步骤S5和S6制得的三嵌段聚合物-喜树碱偶联体和三嵌段聚合物-IMDQ偶联体溶于DMSO中，在超声状态下加入水中，超声处理得纳米胶束；进一步的，将纳米胶束反应液在水中透析，以去除DMSO。
其中，所述三嵌段聚合物-喜树碱偶联体和三嵌段聚合物-IMDQ偶联体的质量比为10-20:1-3，优选为11.25:1.7。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述混合三嵌段胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。优选为实体瘤，从而更有利实现药物的瘤内注射和/或瘤旁注射。实体瘤可以是骨、脑、膀胱、乳腺、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(包括甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头、颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、皮肤、输尿管、睾丸、胃、阴道以及外阴肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症。
此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。经本发明试验证明，本发明制得的肿瘤微环境级联响应的三嵌段混合纳米聚合物胶束可以在近端肿瘤和远端肿瘤中引发抗肿瘤免疫反应，从而为缓解肿瘤免疫抑制微环境、引发持久的抗肿瘤免疫反应、消除实体瘤的化学免疫治疗提供了一个有前景的平台。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物其活性成分包含上述胶束。
根据本发明，所述药物还可以包括其他至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上可接受的载体或辅料。所述药学上可接受的载体或辅料选自溶剂、崩解剂、稀释剂、表面活性剂、沉淀抑制剂、助流剂、粘合剂、分散剂、润滑剂、助悬剂、增稠剂、等渗剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、着色剂、吸收剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的至少一种。
而且，根据领域内通常的方法，所述药物可以制作成粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型等进行使用。
而且，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射(如瘤内注射)递送到感兴趣组织中。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。
本发明的又一具体实施方式中，药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述胶束或药物。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.聚合物的可逆加成-断裂链转移(RAFT)合成
1.1单体及链转移剂的合成
为了得到三嵌段-药物偶联体，我们首先合成了CTA和一系列的单体。
1.1.1合成PEG-DCT
具体操作如下，将4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(DCT)(162.68mg,0.403mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)(49.234mg,0.403mmol)、N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)(83.15mg,0.403mmol)溶解在无水二氯甲烷(DCM)(30mL)中进行室温搅拌。随后，将溶解在DCM(10mL)中的聚乙二醇(PEG)(1.55g，0.31mmol)滴入上述混合物。将该反应液在室温下持续搅拌36小时后，过滤反应液，取滤液，将浓缩后的滤液滴入冷乙醚中析出沉淀。将离心所得的沉淀物用DCM复溶后，再滴入冷乙醚中进行沉淀并离心，此过程重复三次。最后将所得沉淀收集起来，将其放置于真空干燥箱中过夜干燥以获得淡黄色的粉末PEG-DCT，通过1H-NMR表征其结果。
1.1.2 2-(N-乙基-N-丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(EPEMA)单体的合成
为得到EPEMA首先合成了2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺，具体操作如下，将N-乙基乙醇胺(27.42g,0.3mol)、溴丙烷(44.28g,0.36mol)、Na2CO3(47.7g,0.45mol)溶于乙醇(100mL)中，然后加热至80℃搅拌24h。过滤混合物，浓缩所得滤液，用DCM萃取，减压蒸发，得到产物，通过1H-NMR表征其结果。其次，将2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺(3g,22.9mmol)、三乙胺(TEA)(2.317g,22.9mmol)溶于乙腈(20mL)中，然后将此混合物置于0℃搅拌。随后，将甲基丙烯酰氯(2.394g,22.9mmol)滴加于上述混合液中。将混合物在0℃下搅拌2小时后，再将其移至室温继续搅拌12小时。过滤混合物，所得滤液用DCM萃取，旋蒸浓缩，得到单体EPEMA，通过1H-NMR表征其结果。
1.1.3丙烯酰丙酮肟(AA)的合成
首先将丙酮肟(3.98g，54.4mmol)溶解在MiliQ(32.5mL)中并将丙酮肟水溶液置于0℃的冷肼中搅拌。在0℃下，将丙烯酰氯(5g，55.2mmol)缓慢加入上述溶液中。加毕，将此反应液移至室温继续搅拌1小时。1小时后，停止搅拌并静置反应液以分离水层和DCM层。将收集的水层用DCM(3×50mL)萃取，合并所有收集的DCM层并对其进行旋蒸浓缩。浓缩后的有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液(3×50mL)和水(50mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥，旋蒸除去DCM，得到AA，通过1H-NMR表征其结果。
1.1.4还原响应喜树碱单体(OH-2S-CPT)的合成
OH-2S-CPT由两步合成得到。首先，将2-羟基乙基二硫化物(1290mg,8.36mmol)，TEA(845.9mg,8.36mmol)溶解于四氢呋喃(THF)(20mL)并将此混合物冷却至0℃。将甲基丙烯酰氯(873.87mg,8.36mmol)滴入上述溶液中，将混合物在0℃搅拌2小时并在室温搅拌过夜。过滤混合物，所得滤液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得淡黄色油状液体。其次，将CPT(1g,2.87mmol)、DMAP(1402.8mg,11.48mmol)、三光气(340.74mg,1.15mmol)溶解在无水DCM中，于室温下持续搅拌0.5h。随后，缓慢加入溶解于无水DCM中的2-[(2-羟基乙基)二硫代]2-甲基-2-丙烯酸乙酯(701.74mg,3.157mmol)，并将反应溶液连续搅拌过夜。通过减压除去溶剂，硅胶柱色谱得到目标产物，通过1H-NMR表征其结果。
2聚合物-药物偶联体的合成
2.1三嵌段聚合物-喜树碱偶联体(PEG-PEPEMA-PCPT)的合成
为得到PEG-PEPEMA-PCPT，需先通过RAFT聚合技术合成PEG-PEPEMA两嵌段链转移剂，具体操作如下：将PEG-DCT(270.24mg,0.050mmol)、EPEMA(500mg,2.51mmol)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)(2.47mg,0.015mmol)溶解在1,4-二氧六环里并置于Schlenk管中。在4次冻融循环除氧后，将反应液放于70℃的油浴中以引发聚合反应并搅拌36小时。将反应液溶液冷却至室温停止反应，并用去离子水透析的方法对聚合物进行纯化。冻干后得PEG-PEPEMA，通过1H-NMR表征其结果。
PEG-PEPEMA-PCPT也采用RAFT聚合技术制备，将PEG-PEPEMA(356mg,0.024mmol)、OH-2S-CPT(432.8mg,0.725mmol)、AIBN(1.2mg,0.007mmol)溶于1,4-二氧六环和二甲亚砜(DMSO)(v/v＝1:1)并将它们放入Schlenk管中。在4次冻融循环除氧后，将反应液移至80℃油浴中以引发聚合反应并搅拌48小时。将反应液溶液冷却至室温停止反应，并通过在冷乙醚中沉淀三次来纯化聚合物前药，将沉淀于真空干燥箱干燥后，得到聚合物前药。药物接枝率由UV-VIS测定。
2.2三嵌段聚合物-IMDQ偶联体(PEG-PEPEMA-PIMDQ)的合成
PEG-PEPEMA-PIMDQ经IMDQ取代PEG-PEPEMA-PAA聚合物上的AA部分得到。因此，首先合成了PEG-PEPEMA-PAA，具体操作如下,将PEG-PEPEMA(642mg,0.044mmol)、AA(166.4mg,1.309mmol)、AIBN(2.15mg,0.013mmol)溶解在1,4-二氧六环里并置于Schlenk管中。经过4次冻融循环后，将混合物加热至75℃以引发聚合反应并搅拌48小时。将溶液冷却并通过用去离子水透析的方法对其进行纯化。冻干后，得到PEG-PEPEMA-PAA，通过1H-NMR表征其结果。
为了连接IMDQ，我们利用IMDQ上的氨基取代了PEG-PEPEMA-PAA上的PAA部分。将PEG-PEPEMA-PAA(20mg,0.00115mmol)、IMDQ(5.4mg,0.0125mmol)、TEA(0.379mg,0.0374mmol)溶于1,4-二氧六环中，在N2保护下，50℃搅拌48小时。冷却反应液并用水透析过夜。冻干后得白色粉末。IMDQ接枝率通过UV-VIS测量。
3.混合胶束NanoPCPT+PIMDQ的制备
将PEG-PEPEMA-PCPT(11.25mg)和PEG-PEPEMA-PIMDQ(1.7mg)溶解在DMSO(0.3mL)中，然后将其在超声下滴加到Milli-Q水(3mL)中。将上述混合物超声30分钟以生成均一纳米胶束。为去除DMSO，将纳米胶束反应液在去离子水中透析过夜。透析完毕，用去离子水将纳米胶束稀释至3.2mg/ml，并于4℃下避光保存以备进一步实验用。
4.酸性对NanoPCPT+PIMDQ形态的影响
为研究酸性对胶束的影响，我们使用不同pH值的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释纳米胶束储存液至一定浓度。将上述纳米胶束在37℃下过夜孵育后，使用动态光散射仪zeta电位，并用透射电子显微镜观察不同pH值下纳米胶束的形态。
5.还原剂二硫苏糖醇(DTT)触发的CPT体外药物释放
将一定浓度的PEG-PEPEMA-PCPT胶束(NanoPCPT)放入透析袋(3,500Da，MWCO)中，然后将此透析袋分别放入盛有DTT(10mM)和无DTT的pH 7.4 PBS缓冲液的离心管里。随后将上述离心管置于37℃摇床里，在不同的时间段取出等份的外部介质并用等体积的新缓冲溶液代替。在365nm波长，用HPLC确定不同时间间隔所取释放介质中的CPT浓度。
7.酸性对CT26细胞体外摄取NanoPCPT+PIMDQ的影响
为方便观察CT 26对NanoPCPT+PIMDQ的摄取情况，我们使用TAMRA染料取代药物所制备的NanoRho代表NanoPCPT+PIMDQ。
CT26以10×104个细胞/孔的密度过夜接种到48孔板中，然后分别用含NanoRho的pH＝7.4和6.5的培养基孵育12小时。12小时后，去除上清液，收集细胞并重悬于PBS中，使用流式细胞仪测量样品，使用FlowJo处理软件。
8.体外细胞毒性
CT26细胞以5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中过夜。随后，将96孔板里的上清液更换为一系列用培养基稀释的不同浓度的游离CPT、NanoPCPT，再孵育24小时。24小时后，吸出含药培养基，换上新培养基，孵育至48小时。两天后每孔加入10μL CCK-8，孵育40分钟，在465nm处测量吸光度。
9.BMDCs体外成熟
从C57BL/6小鼠的骨髓腔中获得骨髓来源的树突细胞(BMDC)，并接种在含有GM-CSF(10ng·mL-1)和IL-4(5ng·mL-1)的RPMI-1640完全生长培养基中的6孔板中。培养一段时间后，将BMDCs转移至48孔板过夜，然后与不同浓度的IMDQ、NanoPIMDQ孵育24小时。FixableViability Dye eFluorTM 506先用于排除死细胞，然后用抗CD11c-FITC、抗CD86-BV650和抗CD80-APC对细胞进行染色，然后通过流式细胞仪进行分析。
10.巨噬细胞复极化
将巨噬细胞-RAW264.7细胞以5×105细胞/孔的密度接种在12孔中过夜。加入IL-4诱导巨噬细胞变为M2型巨噬细胞。随后，加入不同浓度的IMDQ、NanoPIMDQ孵育上述细胞24h。收集细胞并用抗F4/80、抗CD200R和抗iNOS染色，通过流式仪确定特异性巨噬细胞复极化标志物的表达。
11.体内抗肿瘤治疗反应
为了评价制剂的抗肿瘤效果，我们建立了携带结直肠癌的雄性BALB/c小鼠模型。当原发肿瘤长到50-60mm3时，对携带CT26肿瘤的小鼠分为五组不同的药物：1)PBS,2)freeCPT,3)NanoPCPT,4)NanoPIMDQ,5)NanoPCPT+PIMDQ。CPT的剂量为10mg/kg，而IMDQ的剂量为0.5mg/kg。这些小鼠连续接受四次治疗，每隔两天给药一次。每两天记录一次体重和肿瘤体积，由下式计算肿瘤体积(V)：V＝LW2/2(L＝肿瘤的长度；W＝肿瘤的宽度)。并在整个实验过程中密切监测小鼠的存活情况。
实验结果
EPEMA、AA、OH-2S-CPT单体的合成路线以及PEG-PEPEMA-PCPT、PEG-PEPEMA-PIMDQ的RAFT聚合反应路线分别见图1、图2，合成方法中制备获得的各化合物的结构均通过核磁进行验证(见图3-9)；如图10所示，UV-vis光谱分析结果表明，PEG-PEPEMA-PCPT与CPT的峰形一致，并且图11中PEG-PEPEMA-PIMDQ与IMDQ的峰形也一致，说明PEG-PEPEMA-PCPT、PEG-PEPEMA-PIMDQ合成成功，并且聚合物修饰后药物的紫外吸收无明显变化。
如图12a所示，通过动态光散射(DLS)确定的NanoPCPT+PIMDQ在pH值分别为7.4、6.5和6.0的透射电子显微镜(TEM)图像表明NanoPCPT+PIMDQ的形态在pH 7.4时呈球形，在pH 6.5时趋于不规则，在pH 6.0时完全塌陷，进一步验证了pH依赖性的形态变化。NanoPCPT+PIMDQ在pH值分别为7.4、6.5和6.0中的平均散射强度的计数率随着pH值的降低而变小，尤其是在pH值6.0时，表明NanoPCPT+PIMDQ在酸性条件下会分解。并且NanoPCPT+PIMDQ的zeta电位从pH 7.4的-5.95±0.87mV反转到pH 6.5的10.87±0.40mV和pH 6.0的24.53±1.17mV(图12b)，说明NanoPCPT+PIMDQ发生了电荷翻转。如图12c，在含有10mM DTT的7.4 PBS缓冲液中，CPT在72小时内从NanoPCPT的累积释放量为77.04±2.70％。然而，在同一时间范围内，在没有GSH的情况下，NanoPCPT未释放CPT。以上表明NanoPCPT+PIMDQ具有pH/还原顺序响应性，为我们后续的研究奠定了基础。
如图13a所示，用罗丹明代替CPT或IMDQ来标记三嵌段聚合物胶束所此制备的NanoRho在pH＝6.5下与CT26细胞孵育12h后，显示出比在pH＝7.4条件下更强的细胞吸收效率(**p<0.01)。图13b不同浓度的NanoPCPT对CT26细胞的毒性结果表明：细胞活力呈剂量依赖性，NanoPCPT组的IC50值确定为CPT等效浓度为15nM。结果表明载体三嵌段聚合物具有较高的生物相容性，NanoPCPT对癌细胞而非正常细胞具有优异的GSH诱导药物释放性能。
由图14可知，NanoPIMDQ可促进小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的成熟和巨噬细胞的复极化。
由图15可知，相对PBS组各制剂组均有抑制肿瘤的效果，其中NanoPCPT+PIMDQ抑制近端和远端肿瘤的效果最佳。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有化疗-免疫功能的混合三嵌段胶束，其特征在于，所述胶束包括：亲水性聚(乙二醇)外层、疏水性聚(2-(N-乙基-N-丙基氨基)乙基甲基丙烯酸乙酯)中间层和疏水性药物内核。
2.如权利要求1所述的混合三嵌段胶束，其特征在于，所述疏水性药物包括聚还原反应性喜树碱前药和/或聚IMDQ。
3.如权利要求1所述的混合三嵌段胶束，其特征在于，所述胶束为纳米级胶束。
4.权利要求1-3任一项所述混合三嵌段胶束的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、合成聚乙二醇-4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(PEG-DCT)；
S2、合成2-(N-乙基-N-丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(EPEMA)单体；
S3、合成丙烯酰丙酮肟(AA)；
S4、合成还原响应喜树碱单体(OH-2S-CPT)；
S5、合成三嵌段聚合物-喜树碱偶联体(PEG-PEPEMA-PCPT)；
S6、合成三嵌段聚合物-IMDQ偶联体(PEG-PEPEMA-PIMDQ)。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤S1具体方法包括：
将4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(DCT)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)溶解在无水二氯甲烷中进行室温搅拌得混合物；随后，将溶解在无水二氯甲烷中的聚乙二醇加入上述混合物；将反应液在室温下持续搅拌，过滤反应液，取滤液，析出纯化后即得；
优选的，所述4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸、4-二甲氨基吡啶和N,N-二环已基碳二亚胺和聚乙二醇的摩尔比为0.1-1：0.1-1：0.1-1：0.1-0.5；优选为0.403：0.403：0.403：0.31；
优选的，所述析出纯化的具体步骤包括：
将浓缩后的滤液加入冷乙醚中析出沉淀；将离心所得的沉淀物用无水二氯甲烷复溶后，再加入冷乙醚中进行沉淀并离心，重复2-3次；最后将所得沉淀收集起来，干燥后即得；或，
所述步骤S2具体方法包括：
将N-乙基乙醇胺、溴丙烷、Na2CO3溶于乙醇中，然后加热搅拌，过滤混合物，浓缩所得滤液，用无水二氯甲烷萃取，减压蒸发，即得2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺；然后将2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺、三乙胺溶于乙腈中，然后将此混合物置于低温搅拌得混合液；随后，将甲基丙烯酰氯加入上述混合液中；将所得混合物在低温下搅拌，再将其移至室温继续搅拌，过滤混合物，所得滤液用无水二氯甲烷萃取，旋蒸浓缩，得到单体EPEMA；
优选的，所述N-乙基乙醇胺、溴丙烷、Na2CO3的摩尔比为0.1-0.5:0.1-0.6：0.15-1.0，优选为0.3:0.36:0.45；
优选的，所述2-(N-乙基-N-丙基)乙醇胺、三乙胺和甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.1-1:0.1-1:0.1-1，优选为1:1:1。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤S3具体方法包括：
将丙酮肟水溶液置于低温冷肼中搅拌；在低温条件下将丙烯酰氯缓慢加入上述溶液中；加毕，将此反应液移至室温继续搅拌；停止搅拌并静置反应液以分离水层和二氯甲烷层；将收集的水层用二氯甲烷萃取，合并所有收集的二氯甲烷层并对其进行旋蒸浓缩；浓缩后的有机相洗涤、干燥、纯化后即得；
优选的，所述丙酮肟和丙烯酰氯的摩尔比为0.1-1:0.1-1，优选为0.544:0.552；所述有机相洗涤、干燥、纯化的具体步骤包括：浓缩后的有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤，有机相用Na2SO4干燥，旋蒸除去DCM，即得；或，
所述步骤S4的具体方法包括：
将2-羟基乙基二硫化物、TEA溶于四氢呋喃并将此混合物冷却至低温；将甲基丙烯酰氯加入其中，将混合物在低温下搅拌并在室温下搅拌过夜；过滤混合物，所得滤液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得淡黄色油状液体；随后，将CPT、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三光气溶解在无水二氯甲烷中，于室温下持续搅拌；随后，缓慢加入溶解于无水二氯甲烷中的2-[(2-羟基乙基)二硫代]2-甲基-2-丙烯酸乙酯，并将反应溶液连续搅拌过夜；通过减压除去溶剂，硅胶柱色谱即得；
优选的，2-羟基乙基二硫化物、TEA和甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.1-1:0.1-1:0.1-1，优选为1:1:1；
优选的，所述CPT、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三光气、2-[(2-羟基乙基)二硫代]2-甲基-2-丙烯酸乙酯的摩尔比为1-5:10-15:1-3:2-5，优选为2.87:11.48:1.15:3.157。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5的具体方法包括：
首先，通过RAFT聚合反应合成PEG-PEPEMA两嵌段链转移剂，包括：将PEG-DCT、EPEMA、2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)溶解在1,4-二氧六环里，经冻融循环除氧后，将反应液置于高温中以引发聚合反应并搅拌，将反应液溶液冷却至室温停止反应，并用去离子水透析的方法对聚合物进行纯化即得；
然后，将PEG-PEPEMA、OH-2S-CPT、AIBN溶于1,4-二氧六环和二甲亚砜(DMSO)的混合溶液中，经冻融循环除氧后，将反应液置于高温中以引发聚合反应并搅拌，将反应液溶液冷却至室温停止反应，并通过在冷乙醚中沉淀纯化聚合物前药，将沉淀干燥后即得；
优选的，所述PEG-DCT、EPEMA、2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)的摩尔比为0.01-0.1:1-5:0.01-0.03，优选为0.05:2.51:0.015；
优选的，所述PEG-PEPEMA、OH-2S-CPT、AIBN的摩尔比为0.01-0.05:0.5-1:0.001-0.01，优选为0.024:0.725:0.007；
优选的，所述1,4-二氧六环和二甲亚砜的混合溶液中，二者体积比为0.5-5:1，优选为1:1；或，
所述步骤S6中，具体合成方法包括：
所述PEG-PEPEMA-PIMDQ经IMDQ取代PEG-PEPEMA-PAA聚合物上的AA部分得到；具体的，首先合成PEG-PEPEMA-PAA：将PEG-PEPEMA、AA、AIBN溶解于1,4-二氧六环里，经冻融循环除氧后，将反应液置于高温中以引发聚合反应并搅拌，并用去离子水透析的方法对聚合物进行纯化即得；
利用IMDQ上的氨基取代了PEG-PEPEMA-PAA上的PAA部分；具体的，将PEG-PEPEMA-PAA、IMDQ、TEA溶于1,4-二氧六环中，在惰性气体氛围下，升温搅拌；冷却反应液并用水透析过夜，冻干后即得；
优选的，所述PEG-PEPEMA、AA和AIBN的摩尔比为0.01-0.1:1-2:0.01-0.05，优选为0.044:1.309:0.013；
优选的，所述PEG-PEPEMA-PAA、IMDQ和TEA的摩尔比为0.001-0.005:0.01-0.05:0.02-0.06，优选为0.00115:0.0125:0.0374。
8.如权利要求4的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：制备混合胶束，具体的，将步骤S5和S6制得的三嵌段聚合物-喜树碱偶联体和三嵌段聚合物-IMDQ偶联体溶于DMSO中，在超声状态下加入水中，超声处理得纳米胶束；优选的，将纳米胶束反应液在水中透析；
优选的，所述三嵌段聚合物-喜树碱偶联体和三嵌段聚合物-IMDQ偶联体的质量比为10-20:1-3，优选为11.25:1.7。
9.权利要求1-3任一项所述混合三嵌段胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物其活性成分包含权利要求1-3任一项所述混合三嵌段胶束。
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