CN114887057A - 一种Yolk-Shell型纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Yolk‑Shell型纳米粒子及其制备方法与应用。本发明方法包括如下步骤：1)将内油相、中间水相和外油相分别注入微流控芯片中进行乳化，得到核壳结构微乳液滴；内油相由磁性纳米粒子、含有仲胺基团的高分子聚合物和有机溶剂组成；中间水相为水溶性无机盐、小分子有机配体和聚乙烯醇的水溶液；外油相为表面活性剂的油溶液；2)将核壳结构微乳液滴膜乳化，得到核壳结构纳米级乳液滴；真空干燥，得到核壳结构纳米颗粒；3)使核壳结构纳米颗粒与NO气体反应，得到Yolk‑Shell型纳米粒子。本发明Yolk‑shell型纳米粒子基于NO和ROS时空控释清除细菌生物膜，是克服生物膜异质性从而有效清除生物膜的抗菌材料。

Description

一种Yolk-Shell型纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米抗生物膜技术领域(药物化学和生物可降解医用高分子领域)，具体涉及一种基于一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)时空控释清除细菌生物膜的Yolk-shell型纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
细菌感染严重威胁着人类的生命健康。美国疾控中心研究表明，人类大约80％的细菌感染和细菌生物膜相关，50％的医院感染与医疗器械上的细菌生物膜有关。生物膜造成的植入医用器械感染给患者带来身心痛苦和沉重的经济负担，浪费宝贵的医疗资源。细菌生物膜是细菌自身分泌的胞外聚合物(EPS)基质包裹的具有三维结构、协调性和功能性的复杂动态细菌群落。EPS基质由多糖、细胞外DNA和蛋白质等组成，硬度高，空间结构紧实致密，与杀菌物质的亲和力较弱。EPS基质以一种称为扩散反应抑制(包括螯合、酶促降解等)的形式隔离抗菌分子并限制它们对生物膜的渗透，使生物膜内的细菌对抗生素的耐药性比浮游细菌提高了10-1000倍。EPS基质层和内部细菌群落对杀菌物质具有不同的敏感性，这种生物膜异质性给细菌感染治疗带来持续性障碍。
目前常见的新型抗菌剂主要包括抗菌肽、阳离子抗菌高分子、群体感应抑制剂等。但是已有的这些新型抗菌剂存在以下几个问题：缺乏对生物膜靶向能力、副作用较大、EPS的阻碍(生物膜异质性)导致疗效较差等问题。细菌生物膜如果无法完全被根除，往往会导致持续感染。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的目的是提供一种Yolk-shell型纳米粒子及其制备方法与应用，该Yolk-shell型纳米粒子基于NO和ROS时空控释清除细菌生物膜，是克服生物膜异质性从而有效清除生物膜的抗菌材料，破坏细菌胞外聚合物基质的同时，深层释放抗生素，具有重要的科学意义和巨大应用价值。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
第一方面，本发明保护一种Yolk-Shell型纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)将内油相、中间水相和外油相分别注入微流控芯片中进行乳化，其中所述内油相和所述中间水相先混合，得到水相包裹的内油相，所述水相包裹的内油相再与所述外油相混合，得到核壳结构微乳液滴；
所述内油相由磁性纳米粒子、含有仲胺基团的高分子聚合物和有机溶剂组成；
所述中间水相为水溶性无机盐、小分子有机配体和聚乙烯醇的水溶液；
所述外油相为表面活性剂的油溶液；
2)将所述核壳结构微乳液滴进行膜乳化，得到核壳结构纳米级乳液滴；将所述核壳结构纳米级乳液滴真空干燥，得到核壳结构纳米颗粒；
3)使所述核壳结构纳米颗粒与NO气体反应，得到所述Yolk-Shell型纳米粒子。
上述的方法步骤1)中，构成所述磁性纳米粒子的材料为含有Fe、Co和Ni元素中至少一种的化合物或由Fe、Co和Ni元素中至少两种组成的合金，优选地，构成所述磁性纳米粒子的材料为FePt@Fe3O4、Fe3O4或Co3O4；
所述磁性纳米粒子的粒径为1～100纳米，优选5～20nm，更具体为8～12nm，如10nm；
所述含有仲胺基团的高分子聚合物选自聚乙烯亚胺、聚乙烯胺和聚丙烯酰胺中的任意一种；
所述含有仲胺基团的高分子聚合物的重均分子量为1000～500000，优选3000～300000，更具体为27000；
所述内油相中的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和二硫化碳中的至少一种；
所述磁性纳米粒子与所述内油相的有机溶剂的用量比为0.01～10mg：1mL，具体可为0.5～50mg：10ml，更具体可为1mg：10ml；
所述含有仲胺基团的高分子聚合物与所述内油相的有机溶剂的用量比为0.01～40mg：1mL，具体为2～20mg：10ml，更具体可为4mg：10ml。
上述的方法步骤1)中，所述水溶性无机盐为Fe2+、Fe3+、Cu+、Mn2+中的任意一种；
所述小分子有机配体为没食子酸、单宁酸、多巴胺、对苯二甲酸、均苯三甲酸、聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种；
所述水溶性无机盐在所述中间水相中的摩尔浓度可为0.1～1000mmol/L，具体可为6mmol/L；
所述小分子有机配体在所述中间水相中的摩尔浓度可为0.1～1000mmol/L，具体可为18mmol/L；
所述聚乙烯醇在所述中间水相中的质量百分含量可为0.01～10％，具体可为1％；
所述聚乙烯醇的分子量可为2000～200000。
上述的方法步骤1)中，所述外油相中的有机溶剂为氟化碳油、硅油、乙酸乙酯中的至少一种；
所述硅油的粘度为10～80cst，具体可为50cst；
所述表面活性剂选自Span80(司盘80)、十二烷基磺酸钠、聚乙烯醇、十六烷基三甲基溴化铵和Tween中的至少一种；
所述外油相中表面活性剂的质量百分含量为0.01～20％，具体可为0.2～10％，更具体为5％。
上述的方法步骤1)中，所述微流控芯片包括主流道，沿着流体流入的方向，所述主流道先后延伸出第一支流道和第二支流道；
所述主流道的入口端作为内油相流道；
所述第一支流道作为中间相流道，包括对称分布于所述主流道两侧的两个流道；
所述第二支流道作为外油相流道，包括对称分布于所述主流道两侧的两个流道；
所述主流道的出口端作为液滴收集端；
所述主流道的宽度和高度均为1μm～1000μm，如宽度为50μm且高度为60μm；
所述第一支流道的宽度和高度均为1μm～1000μm，如宽度为70μm且高度为60μm；
所述第二支流道的宽度和高度均为1μm～1000μm，如宽度为70μm且高度为60μm；
所述内油相的注入速率为10～1000μL/h，具体可为400μL/h、500μL/h、600μL/h；
所述中间水相的注入速率为0.01～1000mL/h，具体可为400μL/h、500μL/h、550μL/h、600μL/h；
所述外油相的注入速率为0.01～1000mL/h，如20mL/h；
所述微流控芯片的材质为聚二甲基硅氧烷、石英、玻璃或不锈钢。
上述的方法步骤1)结束后，所述核壳结构微乳液滴的粒径为1.0μm～1000μm。
上述的方法步骤2)中，所述膜乳化采用尺寸为0.2μm或0.45μm的膜过滤器。
上述的方法步骤2)结束后，所述核壳结构纳米级乳液滴的粒径为10nm～1000nm。
上述的方法步骤3)中，与NO反应步骤中，NO压力大小为10～2000psi(如80psi)，反应时间为1～10天(如3天)；和/或，
与NO反应步骤之前还包括用N2气体冲洗高压反应器，N2压力为1～100psi(如20psi)，冲洗时间为10min～3h(如15分钟)；和/或，
与NO反应步骤之前还包括排出NO并用N2气体冲洗高压反应器，N2压力为1～100psi(如20psi)，冲洗时间为10min～3h(如15分钟)；和/或，
与NO反应步骤之后该还包括用体积比为10：1～1：1(如2：1)的四氢呋喃和甲醇的混合物洗涤，用冷干醚沉淀，过滤后用冷干醚洗涤并真空干燥。
第二方面，本发明保护上述任一项所述的制备方法制备得到的Yolk-Shell型纳米粒子。
第三方面，本发明保护所述的Yolk-Shell型纳米粒子在清除细菌生物膜或制备用于清除细菌生物膜的抗菌剂中的应用。
第四方面，本发明保护一种体外或体内杀菌方法，包括如下步骤：将所述的Yolk-Shell型纳米粒子加入细菌生物膜中，施加磁场即可实现杀菌；
所述Yolk-Shell型纳米粒子在所述细菌生物膜中的浓度为1～100μg/mL，如20μg/mL；
所述磁场为交变磁场，强度为0.1～100mT(如20mT)，频率为1～500kHz(如100kHz)，每10秒～30分钟(如5分钟)开关一次，时长共10秒～50分钟(如30或40分钟)。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：
1、本发明方法新颖，工艺简单、设备常见，操控性好，功能强大。
2、本发明所制备纳米平台壳层结构酸敏感性可调，yolk与shell之间的空隙大小可调。
3、本发明针对生物膜“外硬内软，深入困难”的结构特点，基于yolk-shell型纳米平台发明了一种ROS和NO顺序可控释放的“以强克硬，以长治深”联合疗法：即先利用ROS的“强”氧化性，破坏坚“硬”的EPS壁垒，再以NO的“长”扩散距离，杀死生物膜“深”处的细菌。材料通过巧妙地结构设计，创新性实现ROS和NO时空有序可控释放，从而实现优势互补杀菌。
4、细菌生物膜微环境响应性能。NONOate/NP@GA-Fe MOF纳米平台壳层可在细菌生物膜弱酸性条件下降解，实现Fe3+的可控释放(并催化生物膜微环境中的H2O2生成氧化性强的ROS)，对于细菌生物膜具有特异性的识别能力，有助于减小细菌清除过程中对正常细胞的毒副作用。
5、细菌生物膜EPS降解性能。强氧化性的ROS可以无选择性地降解EPS中的多糖等组分，能够破坏生物膜的整体结构，减少其对后续杀菌试剂(即NO)的阻碍作用，有利于将细菌暴露在周围环境中，从而增强NO杀菌效果。
6、灵活可控的空间杀菌能力。通过施加磁场，NONOate/NP@GA-Fe纳米平台yolk中的核壳粒子产生磁热，控制NO释放。可以通过磁屏蔽实现人为定义的局部治疗。
7、本发明不含抗生素，通过ROS和NO的联合作用清除生物膜，不易产生细菌耐药问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中所用的微流控芯片的结构示意图。
图中各标记如下：1-主流道；2-第一支流道；3-第二支流道；4-液滴收集端。
图2为本发明实施例1中用微流控芯片进行乳化时的显微放大40倍的照片。
图3(a)(b)(c)分别为本发明实施例1、实施例2、实施例3中改变Fe3+/GA摩尔比，所制备的NONOate/NP@GA-Fe纳米平台的透射电子显微镜(TEM)照片(scale bar 100nm)。
图4为实施例1、实施例2、实施例3所制备的NONOate/NP@GA-Fe纳米平台的XRD图，其中1/3、1/2、1/1分别表示实施例1、实施例2和实施例3(scale bar 150nm)。
图5(a)(b)(c)分别为本发明实施例2、实施例4、实施例5中改变内油相和中间水相相对流速，所制备的所制备的NONOate/NP@GA-Fe纳米平台的透射电子显微镜(TEM)照片(scale bar 150nm)。
图6为本发明实施例2中所制备的NONOate/NP@GA-Fe纳米平台的元素映射分析照片。
图7为本发明实施例6中不同干预条件治疗后的生物膜的激光共聚焦(CLSM)照片。
图8为本发明实施例7中局部施加磁屏蔽NONOate/NP@GA-Fe纳米平台治疗后的生物膜的激光共聚焦(CLSM)照片(a)和明场照片(b)。
图9为本发明实施例8中不同干预条件治疗后的球形生物膜的激光共聚焦(CLSM)照片，PBS组(a)，NONOate/NP@GA-Fe MOF(AMF关闭)组(b)，NONOate/NP@GA-Fe MOF(AMF开启)组(c)。
具体实施方式
根据生物膜“外硬内软，深入困难”的异质性的结构特点，本发明提出了一种利用ROS和NO顺序可控释放的“以强克硬，以长治深”联合疗法，即利用ROS的“强”氧化性，破坏坚“硬”的EPS壁垒，以NO的“长”扩散距离，杀死生物膜“深”处的细菌。本发明利用两步乳化技术结合高压工艺，具体为采用微流控技术作为第一步乳化工艺，制备核壳结构微乳液滴，再采用膜乳化技术作为第二步乳化工艺，制备出纳米级乳液滴，随后通过溶剂挥发制备出的Yolk-Shell型纳米颗粒。在该纳米颗粒中，Fe3+加载到纳米颗粒的Shell中，再通过高压合成工艺，将抗菌剂(NO)加载到纳米材料的Yolk中。利用生物膜处酸性微环境，纳米材料Shell中的Fe3+响应刺激释放，诱导产生ROS，显著破坏EPS基质；再通过磁热效应，释放纳米材料Yolk中的NO，顺利穿透生物膜并到达细菌表面，起到杀菌作用。成功克服了生物膜外部EPS基质与内部细菌对抗菌物质敏感性不同的问题，即异质性问题。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
本发明Yolk-shell型纳米粒子，以下简写为NONOate/NP@GA-Fe MOF纳米平台。
实施例1-5为合成NONOate/NP@GA-Fe MOF纳米平台的具体实例；实施例6-8为NONOate/NP@GA-Fe MOF纳米平台抗细菌生物膜的具体实例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
FePt@Fe3O4纳米粒子按照文献“One-Pot Synthesis of High-QualityBimagnetic Core/Shell Nanocrystals with Diverse Exchange Coupling ChaiYahong”中公开的方法合成，具体步骤如下：将Pt(acac)2(0.5mmol)、1,2-十六烷二醇(1.5mmol)和1-十八烯(20ml)添加到装有磁力搅拌子的150mL三口烧瓶中，并在90℃下抽真空30分钟。在氮气流下加入油酸(0.5mmol)、油胺(0.5mmol)和Fe(acac)3(3mmol)。将混合物加热至300℃并回流30分钟，然后使其冷却至室温。产物用乙醇、环己烷反复洗涤3次，再分散于环己烷中置于4℃冰箱中备用。
低粘度硅油为日本信越硅油KF-96,粘度为50cst。
聚乙烯醇为阿拉丁的聚乙烯醇1788低粘度型，货号为P1051228-500g。
下述实施例中所用的微流控芯片的结构如图1所示，包括主流道1，沿着流体流入的方向，主流道1先后延伸出第一支流道2和第二支流道3；主流道1的入口端作为内油相流道；第一支流道2作为中间相流道，包括对称分布于主流道两侧的两个流道；第二支流道3作为外油相流道，包括对称分布于主流道两侧的两个流道；主流道的出口端作为液滴收集端4；主流道1的宽度为50μm，第一支流道2的宽度为70μm，第二支流道3的宽度为70μm，所有通道的高度为60μm；材质为聚二甲基硅氧烷。
下述实施例中的所有溶液和溶剂在实验之前均需要经过0.2μm膜(Anodisc或Whatman plc.)过滤。
下述实施例中膜乳化所用的膜过滤器中0.45μm的膜为聚碳酸酯膜，膜和配套的过滤器均为Avanti Polar Lipids的产品。
实施例1、合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台
按照如下步骤合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台
1)将粒径为10nm的PtFe@Fe3O4纳米粒子、重均分子量为27,000的聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷中，得到的混合溶液作为内油相，其中，FePt@Fe3O4纳米粒子的浓度为0.1mg/mL，聚乙烯亚胺的浓度为0.4mg/mL；将摩尔比为1:3的FeCl3·6H2O(6mmol/L)与没食子酸(GA)溶解在聚乙烯醇和Milli-Q水中，聚乙烯醇的质量百分含量为1％，并用作中间水相；外油相为低粘度硅油和SpanTM 80(司盘80质量百分含量为5％)。将内油相、中间水相和外油相分别注入微流控芯片的不同通道中，内油相的注入速率为400μL/h；中间水相的注入速率为600μL/h；外油相的注入速率为20mL/h。如图2所示，在微流控芯片中，内油相和中间水相先混合，得到水相包裹的内油相，然后水相包裹的内油相与外油相混合，被外油相剪切成高单分散双乳液滴(o/w/o乳液)即核壳结构微乳液滴(1.0μm-1000μm)。
2)待步骤1)所得核壳结构微乳液滴通过0.45μm膜的过滤器挤出，收集液滴，得到核壳结构纳米级乳液滴(10-1000nm)。最后，透析除杂质后，冷冻干燥得到PEI/NP@GA-Fe纳米颗粒，置于-4℃备用。
3)将步骤2)中合成的前驱体PEI/NP@GA-Fe置于PARR高压反应器中，用20psi N2气体冲洗15分钟，然后在80psi下充入NO气体3天，室温下。然后排出NO并用20psi N2气体冲洗反应器15分钟。用四氢呋喃(THF)和甲醇(体积比2:1)的混合物洗涤未反应的PEI，用冷干醚沉淀NONOate/NP@GA-Fe；通过过滤快速去除溶剂，产物用冷干醚洗涤并真空干燥，得到。即得到本发明提供的单分散的NONOate/NP@GA-Fe纳米平台。
由本实施例所制备的NONOate/NP@GA-Fe的透射电子显微镜(TEM)照片如图3(a)所示。由图可知，该纳米平台的粒径为450nm，单分散性良好。XRD图见图4。
实施例2、合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台
按照实施例1中的步骤合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台，仅将中间水相中FeCl3·6H2O(6mmol/L)与没食子酸(GA)的摩尔比调整为1：2。
由本实施例所制备的NONOate/NP@GA-Fe的透射电子显微镜(TEM)照片如图3(b)所示。由图可知，该纳米平台的粒径为560nm，单分散性良好。XRD图见图4。Shell壳层的结晶度低于实施例1中的纳米平台。元素映射分析照片见图6，证明N、Fe、Pt、O的成功引入。
实施例3、合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台
按照实施例1中的步骤合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台，仅将中间水相中FeCl3·6H2O(6mmol/L)与没食子酸(GA)的摩尔比调整为1：1。
由该实施例所制备的NONOate/NP@GA-Fe的透射电子显微镜(TEM)照片如图3(c)所示。由图可知，该纳米平台的粒径为500nm，单分散性良好。XRD图见图4。Shell壳层的结晶性低于实施例1和例2中的纳米平台。
通过对比实施例1-3制得的纳米平台的TEM图和XRD图可以看出，改变摩尔比，可以改变MOF外壳的结晶度。
实施例4、合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台
按照实施例2中的步骤合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台，仅将中间水相的注入速率调整为480μL/h。
由本实施例所制备的NONOate/NP@GA-Fe的透射电子显微镜(TEM)照片如图5(b)所示。由图可知，该纳米平台的粒径为460nm，Shell壳层的厚度约为100nm，单分散性良好。Yolk与Shell壳层的空隙(约为2nm)小于实施例2中的纳米平台(实施例2Yolk与Shell壳层的空隙约为3nm)。
实施例5、合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台
按照实施例2中的步骤合成NONOate/NP@GA-Fe纳米平台，仅将中间水相的注入速率调整为400μL/h。
由本实施例所制备的NONOate/NP@GA-Fe的透射电子显微镜(TEM)照片如图5(c)所示。由图可知，该纳米平台的粒径为450nm，Shell壳层的厚度约为100nm，单分散性良好。Yolk与Shell壳层的空隙(约为1.8nm)小于实施例2和实施例4中的纳米平台。
通过对比实施例2、4、5制得的纳米平台的TEM图可以看出，改变内油相和中间水相的流速比，可以改变yolk和shell之间的空隙大小。
实施例6、不同干预条件处理生物膜
为了研究空间控制的体外杀菌能力，抗生物膜实验选取了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为典型代表。以MRSA为例，取适量MRSA菌液，加入TSB培养基将菌液密度调整为108CFU/mL(吸光度OD630＝0.5)。在超净台中，使用移液枪在24孔板中加入400μL上述菌液。37℃下静止培养36h。孔内有淡黄色粘稠絮状物生成，形成细菌生物膜。然后，在超净台中吸除上清培养基，用500μL pH等于7.4的无菌PBS缓缓清洗孔板。加入200μL终浓度为20μg/mL的NONOate/NP@GA-Fe(实施例2NONOate/NP@GA-Fe纳米平台)(分散于无菌PBS中)。37℃培养，孵育大约30min。然后，用交变磁场照射混合溶液(20mT,100kHz；每5分钟开关一次，时长30分钟)。实验组命名为NONOate/NP@GA-Fe+AMF组；同时设置不经交变磁场处理的NONOate/NP@GA-Fe组和PBS空白对照组。于37℃恒温培养箱干预治疗。荧光染色后置于激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察并拍照。不同干预条件对金黄色葡萄球菌生物膜清除能力如图7所示。从图7中NONOate/NP@GA-Fe MOF(AMF关闭)组和NONOate/NP@GA-Fe MOF(AMF开启)组的生物膜相对含量来看，单独NONOate/NP@GA-Fe MOF对细菌生物膜损伤较小，厚度明显变薄，但仍可观察到团簇连接。而NONOate/NP@GA-Fe MOF组(AMF开启)组几乎消灭了NONOate/NP@GA-FeMOF组中的感染性生物膜，几乎见不到团簇连接，只观察到少量单菌，可以达到99.999％的杀菌率。
实施例7、磁场控制空间可控性
为了研究空间控制的体外杀菌能力，将2mL浓度为108CFU/mL(吸光度OD630＝0.5)的MRSA菌液置于无菌的20mm共聚焦玻璃底培养皿中，37℃条件下放置1.5小时，以使细菌粘附。接下来，用缓冲液小心清洗共聚焦培养皿三次，以去除浮游细菌。然后在培养皿中加入2mL TSB培养基，37℃孵育，每24小时更新培养基一次，使生物膜生长。48小时后，将生物膜与NONOate/NP@GA-Fe(20μg/mL)共培养于培养皿中，其中一半用自制的磁屏蔽装置保护。磁场刺激(20mT，100kHz；每5分钟开关一次)40分钟后，将有磁屏蔽保护的培养皿和没有磁屏蔽保护的培养皿用缓冲液冲洗三次。使用4％的多聚甲醛以固定生物膜。无菌PBS缓冲液漂洗三次。加入2mL FITC，室温下孵育染色，用无菌PBS清洗三次去除多余染料。再用CLSM观察绿色荧光生物膜的清除情况。
图8为本发明实施例7中局部施加磁屏蔽NONOate/NP@GA-Fe纳米平台治疗后的生物膜的激光共聚焦(CLSM)照片和明场照片。在磁场刺激40分钟后，受磁屏蔽保护的一半可以观察到大量活细菌，而未受磁屏蔽保护的另一半则没有显示荧光信号，表明细菌基本全部死亡。表明该纳米平台的抗菌药物生物膜微环境释放具有前所未有的空间分辨率和可自定义控制维度。
实施例8、体内球形生物膜渗透能力
为了达到高效清除细菌生物膜的作用，抗菌药物必须具有有效的渗透能力。目前关于抗菌渗透能力的研究大多集中在体外二维(2D)平面生物膜模型上。在生物膜渗透的背景下，建立三维(3D)球形生物膜模型，模拟生物膜在体内复杂的病理生理过程，以评价抗菌剂在生物膜中的渗透，是一项具有技术挑战性但很有意义的工作。为了分析NONOate/NP@GA-Fe MOF在体内对生物膜的渗透能力，我们培养了球形MRSA生物膜(生物膜球体，细菌和EPS的球形聚集体，反映了体内生物膜的许多特性，直径为123μm)。在10μm二氧化硅球上形成直径123μm的生物膜细菌球，研究NONOate/NP@GA-Fe的体内渗透性。首先，将10μm直径的硅胶球浸泡在浓度为108CFU/mL(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的纺丝培养器中在37℃培养箱中培养48小时，然后用TSB培养基洗涤3次，将球形生物膜埋于小鼠腹部皮下。腹腔注射PBS、NONOate/NP@GA-Fe MOF和NONOate/NP@GA-Fe MOF(20μg/mL,AFM作用下)。小鼠被保持在37摄氏度接受治疗。术后第2天，将球形生物膜从小鼠体内取出，在CLSM下拍摄生物膜图像。
图9为本发明实施例8中不同干预条件对球形生物膜清除能力的共聚焦显微镜(CLSM)照片。如图9所示，在PBS组的球形MRSA生物膜中，显示出很强的绿色荧光信号(图9(a))。而在NONOate/NP@GA-Fe MOF(关闭AMF)组中，生物膜在表面显示红色荧光信号，内层显示绿色荧光信号，表明表面细菌被杀死，但是内层剩余大量存活的细菌。这表明NONOate/NP@GA-Fe MOF的抗菌作用可能是由Fe3+诱导的ROS产生引起的，ROS扩散距离短，只能作用于球形生物膜表面的细菌，因此出现球形生物膜表层呈现红色荧光信号，内部呈现绿色荧光信号的现象(图9(b))。相比之下，在NONOate/NP@GA-Fe MOF(AMF开启)组中，球形生物膜通体呈现红色荧光信号，未观察到绿色荧光信号(图9(c))，表明在球形生物膜细菌球体的内层的细菌也受到了损伤。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种Yolk-Shell型纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)将内油相、中间水相和外油相分别注入微流控芯片中进行乳化，其中所述内油相和所述中间水相先混合，得到水相包裹的内油相，所述水相包裹的内油相再与所述外油相混合，得到核壳结构微乳液滴；
所述内油相由磁性纳米粒子、含有仲胺基团的高分子聚合物和有机溶剂组成；
所述中间水相为水溶性无机盐、小分子有机配体和聚乙烯醇的水溶液；
所述外油相为表面活性剂的油溶液；
2)将所述核壳结构微乳液滴进行膜乳化，得到核壳结构纳米级乳液滴；将所述核壳结构纳米级乳液滴真空干燥，得到核壳结构纳米颗粒；
3)使所述核壳结构纳米颗粒与NO气体反应，得到所述Yolk-Shell型纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，构成所述磁性纳米粒子的材料为含有Fe、Co和Ni元素中至少一种的化合物或由Fe、Co和Ni元素中至少两种组成的合金；
和/或，构成所述磁性纳米粒子的材料为FePt@Fe3O4、Fe3O4或Co3O4；
所述磁性纳米粒子的粒径为1～100纳米；
所述含有仲胺基团的高分子聚合物选自聚乙烯亚胺、聚乙烯胺和聚丙烯酰胺中的任意一种；
所述含有仲胺基团的高分子聚合物的重均分子量为1000～500000；
所述内油相中的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和二硫化碳中的至少一种；
所述磁性纳米粒子与所述内油相的有机溶剂的用量比为0.01～10mg：1mL；
所述含有仲胺基团的高分子聚合物与所述内油相的有机溶剂的用量比为0.01～40mg：1mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述水溶性无机盐为Fe2 +、Fe3+、Cu+、Mn2+中的任意一种；
所述小分子有机配体为没食子酸、单宁酸、多巴胺、对苯二甲酸、均苯三甲酸、聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种；
所述水溶性无机盐在所述中间水相中的摩尔浓度为0.1～1000mmol/L；
所述小分子有机配体在所述中间水相中的摩尔浓度为0.1～1000mmol/L；
所述聚乙烯醇在所述中间水相中的质量百分含量为0.01～10％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述外油相中的有机溶剂为氟化碳油、硅油、乙酸乙酯中的至少一种；
所述硅油的粘度为10～80cst；
所述表面活性剂选自Span80、十二烷基磺酸钠、聚乙烯醇、十六烷基三甲基溴化铵和Tween中的至少一种；
所述外油相中表面活性剂的质量百分含量为0.01～20％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述微流控芯片包括主流道，沿着流体流入的方向，所述主流道先后延伸出第一支流道和第二支流道；
所述主流道的入口端作为内油相流道；
所述第一支流道作为中间相流道，包括对称分布于所述主流道两侧的两个流道；
所述第二支流道作为外油相流道，包括对称分布于所述主流道两侧的两个流道；
所述主流道的出口端作为液滴收集端；
所述主流道的宽度和高度均为1μm～1000μm；
所述第一支流道的宽度和高度均为1μm～1000μm；
所述第二支流道的宽度和高度均为1μm～1000μm；
所述内油相的注入速率为10～1000μL/h；
所述中间水相的注入速率为0.01～1000mL/h；
所述外油相的注入速率为0.01～1000mL/h；
所述微流控芯片的材质为聚二甲基硅氧烷、石英、玻璃或不锈钢。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述膜乳化采用尺寸为0.2μm或0.45μm的膜过滤器。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，与NO反应步骤中，NO压力大小为10～2000psi，反应时间为1～10天；和/或，
与NO反应步骤之前还包括用N2气体冲洗高压反应器，N2压力为1～100psi，冲洗时间为10min～3h；和/或，
与NO反应步骤之前还包括排出NO并用N2气体冲洗高压反应器，N2压力为1～100psi，冲洗时间为10min～3h；和/或，
与NO反应步骤之后该还包括用体积比为10：1～1：1的四氢呋喃和甲醇的混合物洗涤，用冷干醚沉淀，过滤后用冷干醚洗涤并真空干燥。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的Yolk-Shell型纳米粒子。
9.权利要求8所述的Yolk-Shell型纳米粒子在清除细菌生物膜或制备用于清除细菌生物膜的抗菌剂中的应用。
10.一种体外或体内杀菌方法，包括如下步骤：将权利要求8所述的Yolk-Shell型纳米粒子加入细菌生物膜中，施加磁场即可实现杀菌；
所述Yolk-Shell型纳米粒子在所述细菌生物膜中的浓度为1～100μg/mL；
所述磁场为交变磁场，强度为0.1～100mT，频率为1～500kHz，每10秒～30分钟开关一次，时长共10秒～50分钟。
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