CN114875136A - 人类ugt1a1基因多态性检测用标准品产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及了突变的人类UGT1A1基因多态性检测用标准品产品及其应用，将含UGT1A1基因*28位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系DNA作为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物经过Sanger测序验证，可获得UGT1A1基因多态性的定性标准品。本标准品均匀性良好，可用于UGT1A1基因多态性检测荧光PCR方法的方法验证和质量控制。

Description

人类UGT1A1基因多态性检测用标准品产品及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉一种人类UGT1A1基因多态性检测用标准品产品及其应用。
背景技术
伊立替康治疗成人晚期/转移性大肠癌患者，对肺癌/宫颈癌/卵巢癌亦有疗效。UGT1A1基因位于染色体2q37上，包括5个外显子。UGT1A1主要存在于肝脏，以插入、缺失和单核苷酸多态性等形式造成序列间很大的个体差异。已发现该基因的113个不同突变体。这些突变体可造成UGT1A1蛋白酶活提高或降低，甚至无活性或无正常的酶表型。目前，UGT1A1基因与结直肠癌、吉尔伯特综合征的发病及治疗之间的关系一直是人们研究的热点。所有伊立替康的代谢产物经ATP结合盒子(ABC)转运体排入胆汁，经胆汁肝、肠循环进入小肠，在小肠内经6-β羟化酶转化为SN-38，再由肠道内UGT1A1转化为SN-38G代谢至体外。在伊立替康的代谢过程中，血液和肠道中的SN-38水平过高可导致人体出现粒细胞减少和迟发性腹泻，即为伊立替康引发的两种最突出的剂量限制毒性。UGT1A1是伊立替康代谢过程的关键酶，因而UGT1A1基因的表达及其酶活性与伊立替康的不良反应密切相关。
目前很多临床研究支持UGT1A1*28多态性可以预测伊立替康引起的毒副反应，且NCCN临床指南也推荐接受伊立替康治疗的患者治疗前应完善UTG1A1基因检测以预测患者是否会发生严重的粒细胞缺乏或迟发性腹泻。若为UGT1A1*28纯合突变患者，建议伊立替康用药减量30％以避免引发严重不良反应。美国FDA在伊立替康使用说明书里增加了UGT1A1*28对伊立替康代谢和药物不良反应的内容。
人类UGT1A1基因多态性检测标准物质为细胞系质控品更接近于临床样本，由于重组质粒由于不同实验室间存在序列选取差异，不能适用于市场上所有试剂盒，且无法准确对市场上所有个体化用药基因检测试剂盒进行鉴别，细胞系质控品更优于重组质粒质控品。国内目前尚无人类UGT1A1基因多态性检测标准物质商品化产品，本项目研究对实验室内检测结果的失控状况及失控原因、了解不同医疗单位之间检验结果的差距具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类UGT1A1基因多态性检测用标准品产品及其应用，产品标准品准确度高、均匀度良好。
本发明首次建立了人类UGT1A1基因多态性检测用标准品产品及其应用，达到了上述发明目的。
本发明的技术方案如下：
(1)提取含有UGT1A1基因*28位点纯合野生、杂合突变型以纯合突变型的细胞系基因组DNA作为模板，通过Sanger测序对多态性位点进行验证；
(2)UGT1A1基因*28三位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系基因组DNA定量测定；
(3)量值测定通过测定标准物质核酸吸光度值，荧光PCR法以及Sanger测序法，采用实验内部多人员、多种方法进行定值。采用荧光定量PCR法进行基因分型验证，标准品均匀性验证。
其具体方法为：
采用Sanger测序方法以上述各基因型位点细胞系基因组DNA作为模板进行确认。测序结果见表1。提取DNA的纯度见表2。
表1 Sanger测序法验证结果
细胞系 位点 基因型 序列
GM16654 UGT1A1 UGT1A1*1/*1 见图1
GM12273 UGT1A1 UGT1A1*1/*28 见图2
GM17222 UGT1A1 UGT1A1*28/*28 见图3
表2提取DNA的纯度
样本 核酸浓度 OD260/OD280
GM16654 11.51 1.86
GM12273 12.16 1.80
GM17222 12.11 1.73
本发明的原理和有益效果在于：
提供了一种人类UGT1A1基因多态性检测标准品，细胞系质控品接近于临床样本，更好的模拟临检测，优于现有方法标准品，重组质粒由于不同实验室间存在序列选取差异，不能适用于市场上所有试剂盒，且无法准确对市场上所有个体化用药基因检测试剂盒进行鉴别。
定值精密度好。
附图说明
图1为Sanger测序法对UGT1A1*28位点UGT1A1*1/*1型的测序图。
图2为Sanger测序法对UGT1A1*28位点UGT1A1*1/*28型的测序图。
图3为Sanger测序法对UGT1A1*28位点UGT1A1*1/*28型的测序图。
图4为Sanger测序法对UGT1A1*28位点UGT1A1*28/*28型的测序图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1-UGT1A1基因多态性标准品的制备
1.细胞系和培养基
细胞系GM16654、GM12273、GM17222。细胞系购自美国卡瑞尔细胞库(CoriellInstitute)，所需的培养基及培养条件均参照说明书进行。培养基为1640+10％FBS，5％CO2，37℃度培养。
2.DNA提取及Sanger测序验证
采用江苏百世诺医疗科技有限公司的基因组纯化试剂盒提取3株细胞系的基因组DNA，采用Sanger测序对基因组DNA进行验证。
3.基因组纯度验证及定量
采用NanoDrop法微量紫外分光光度计测定基因组在260nm、280nm和230nm处的吸光值，用TE作为空白进行Blank，然后取2μL样品进行测定。并根据浓度计算基因组拷贝数对标准品进行定量。
4.荧光定量PCR法进行基因分型验证
以步骤2中3株细胞系的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系25μL，组分见下表3。扩增程序见表4。
表3 UGT1A1*28反应液组分表
组份 规格 用量
MasterBuffer 2× 12.5μL
上游引物 10μM 1.0μL
下游引物 10μM 1.0μL
内参上游引物 10μM 1.0μL
内参下游引物 10μM 1.0μL
FAM探针 10μM 0.3μL
HEX探针 10μM 0.5μL
酶混合液 - 0.5μL
DEPC水 补齐至20μL
表4扩增程序
Figure BDA0003439889680000031
5.对均匀性检验中的试验结果进行F检验
对样品随机选取15管，每管取样三次，因此共45份样品。取样量为200μL/次，通过人类全血基因组DNA提取试剂盒(江苏百世诺医疗科技有限公司)提取DNA后，利用测定核酸吸光度值方法进行分析，检测样品在瓶内以及瓶间的均匀性情况。
单元内方差的计算公式如下：
Figure BDA0003439889680000041
单元间方差的计算公式如下：
Figure BDA0003439889680000042
计算统计量F计算公式如下：
Figure BDA0003439889680000043
二、结果
1.DNA提取及Sanger测序验证结果
UGT1A1*28位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型Sanger测序鉴定结果见图1-4。检测结果为对应基因型。
2.基因组纯度验证及定量结果
提取后基因组在OD260/OD280在1.7～2.0之间。定值结果统计见表5，由不同人员进行定值，每人测定5管，每管重复测定3次，汇总的到全部原始数据，最终以共同测定数据经数理统计后的总均值11.86ng/μl为标准值。标准物质定值过程中带来的不确定度，计算为0.13。
表5定值结果统计
Figure BDA0003439889680000044
Figure BDA0003439889680000051
3.荧光定量PCR法进行基因分型验证
UGT1A1*28位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型标准品编号见下表，采用不同荧光定量PCR仪方法进行定性检测，CV值小于5.0％，结果见下表6-8。
表6 ABI7500荧光PCR仪检测结果
Figure BDA0003439889680000052
表7 Roche480荧光PCR仪检测结果
Figure BDA0003439889680000053
表8 MX3000P荧光PCR仪检测结果
Figure BDA0003439889680000054
4.对均匀性检验结果
利用方差分析法对瓶内以及瓶间的均匀性进行分析，均匀性检验结果见表9。均匀性方差检验结果表明，统计量F＜F0.05，(m-1)，m(n-1)样品在瓶内和瓶间无显著差异，样品均匀。
表9均匀性检验结果
Figure BDA0003439889680000061

Claims (3)

1.一种UGT1A1基因多态性检测标准品及其应用，包括以下步骤：
(1)提取含有UGT1A1基因*28点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系基因组DNA作为模板，通过Sanger测序对多态性位点进行验证；
(2)UGT1A1基因*28位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系基因组DNA定量测定；
(3)采用荧光定量PCR法进行基因分型验证，标准品均匀性验证。
2.根据权利要求1所述的UGT1A1基因*28位点基因多态性检测用标准品，其特征在于：所述(1)中，所选择的细胞系为可稳定传代的永生化细胞系GM16654、GM112273、GM17222。
3.根据权利要求任一项所述的UGT1A1基因*28位点基因多态性检测标准品的应用，其特征在于：各基因型基因拷贝数浓度确定方法为紫外分光光度法。
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