CN114874290B - 一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片 - Google Patents

一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片，本发明以鲢鱼鱼排为原料，通过酶促水解得到鲢鱼排抗氧化肽，采用超滤技术将鲢鱼排酶解液分成<3kDa、3‑10kDa和>10kDa三个组分，然后以不同的抗氧化体系来对各组分多肽进行体外抗氧化活性评价，结果表明，<3kDa的组分具有最好的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和Cu2+螯合能力，说明其抗氧化性最好，本发明选择<3kDa的抗氧化肽组分进行LC‑MS/MS检测，通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析，得到其中丰度较高、氨基酸构成符合抗氧化肽特征的9条肽段，分别为GEPFLPMP、PYLIGQF、FSFHMHVNGANALVA、VIVYDOPF、TPIKFDOIVY、HTWTW、TAYYGPIPF、GPPGPPGP或GPPGPPGTPGPQ。

Description

一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片
技术领域
本发明涉及鲢鱼深加工技术领域，具体涉及一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片。
背景技术
我国淡水鱼资源丰富，淡水鱼养殖业近几年来发展迅速，2020年，全国水产品总产量6549.02万吨，其中鱼类总产量约为3521.03万吨，占水产品总量的53.76％，鲢鱼因其生长速度快，抗病性强，养殖成本低，而备受渔农青睐。2020年我国鲢鱼的养殖产量约381.29万吨，仅次于草鱼，但由于加工技术落后，目前我国水产品加工率仅31.93％左右，淡水产品的加工率更低，仅12.72％左右，远未达到世界加工和综合利用方面水平。
鲢鱼(学名:Hypophthalmichthys molitrix)，属于鲤科，它与鳙鱼、草鱼和青鱼一起，并称为中国四大鲤鱼种，鲢鱼在中国分布广泛，具有养殖产量大、生长速度快、加工性能优良、价格低廉等特点，具有良好的加工前景。鲢鱼的肉质白嫩、氨基酸种类丰富、蛋白质含量高，富含矿物质元素、不饱和脂肪酸和B族维生素，具有较高的营养价值，因此受到广大消费者的青睐，目前，以鲢鱼为原料的加工产品主要有鱼糜制品、冷冻鱼片、腌制或干制品等。
目前，鲢鱼加工过程中会产生大量的下脚料，如鱼鳞、鱼皮、鱼排等，这些下脚料中含有大量的蛋白质，直接丢弃不仅会造成资源浪费，还可能导致环境被污染，因此，对鲢鱼下脚料的综合研究利用在过去的几年里受到越来越多的重视，但是从鲢鱼排中提取具有高抗氧化活性的抗氧化肽目前还没有进行系统的研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片，开发了鲢鱼下脚料的新用途，得到的抗氧化肽具有清除自由基的功能。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种鲢鱼排抗氧化肽为GEPFLPMP或PYLIGQF或FSFHMHVNGANALVA或VIVYDQPF或TPIKFDQIVY或HTIIITW或TAYYGPIPF或GPPGPPGP或GPPGPPGTPGPQ。
本发明提供鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将收集到的鲢鱼排进行清洗，沥干，然后用绞肉机绞碎，封装冷藏，得到预处理鱼排；
(2)将步骤(1)得到的预处理鱼排配成底物液，加入碱性蛋白酶进行一次酶解，酶解结束后，高温灭酶，离心收集上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液中加入风味蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后，高温灭酶，离心收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液通过分子量为3kDa的超滤膜，从而获得蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液；
(5)通过LC-MS/MS技术对步骤(4)得到的蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液进行检测，通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析，得到氨基酸构成符合抗氧化肽特征的9条肽段，分别为GEPFLPMP或PYLIGQF或FSFHMHVNGANALVA或VIVYDQPF或TPIKFDQIVY或HTIIITW或TAYYGPIPF或GPPGPPGP或GPPGPPGTPGPQ。
优选的，步骤(2)中，底物液的固液比为1:4-10。
优选的，步骤(2)中，碱性蛋白酶的添加量为500-4500U/g。
优选的，步骤(2)中，一次酶解时，溶液的pH为7.8-8.2，酶解温度为50-60℃，酶解时间为3-5h。
优选的，步骤(3)中，风味蛋白酶的添加量为1000-2000U/g。
优选的，步骤(3)中，二次酶解时，溶液的pH为6.8-7.2，酶解温度为45-55℃，酶解时间为2-4h。
本发明提供上述分离方法在提取鲢鱼排抗氧化肽中的应用。
本发明还提供鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将鲢鱼排抗氧化肽粉、微晶纤维素、奶粉、羧甲基纤维素钠和甘露醇混合均匀，粉碎后过40目筛，再加入硬脂酸镁，混合均匀后移入压片机模具中压片成形，得到鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片；其中鲢鱼排抗氧化肽粉的制备方法如下：将采用上述分离方法得到的蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液进行喷雾干燥，即得到鲢鱼排抗氧化肽粉。
优选的，所述鲢鱼排抗氧化肽粉、微晶纤维素、奶粉、羧甲基纤维素钠、甘露醇和硬脂酸镁的质量比为12-20:20-30:35-40:2-5:20-30:0.5-1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以鲢鱼鱼排为原料，通过酶促水解反应得到鲢鱼排酶解液，然后采用超滤技术将鲢鱼排酶解液分成<3kDa、3-10kDa和>10kDa三个组分，然后以不同的抗氧化体系来对各组分多肽进行体外抗氧化活性评价，结果表明，<3kDa的组分具有最好的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和Cu2+螯合能力，说明其抗氧化性最好。
(2)本发明选择<3kDa的抗氧化肽组分进行LC-MS/MS检测，通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析，得到其中丰度最高、氨基酸构成符合抗氧化肽特征的9条肽段，分别为GEPFLPMP或PYLIGQF或FSFHMHVNGANALVA或VIVYDQPF或TPIKFDQIVY或HTIIITW或TAYYGPIPF或GPPGPPGP或GPPGPPGTPGPQ。
附图说明
图1为鲢鱼排水解物超滤组分的DPPH自由基清除率图；
图2为鲢鱼排水解物超滤组分的ABTS自由基清除率图；
图3为鲢鱼排水解物超滤组分的羟自由基清除率图；
图4为鲢鱼排水解物超滤组分对Cu2+的螯合能力图；
图5为鲢鱼排水解物超滤组分的还原能力图；
图6为鲢鱼排水解物<3kDa组分的质谱Basepeak图；
图7为GPPGPPGP的二级质谱图；
图8为GPPGPPGTPGPQ的二级质谱图。
具体实施方式
以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。
鲢鱼排，于湖北省洪湖市井力水产食品股份有限公司生产线收集；
碱性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司；
风味蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例
一种鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，包括如下步骤：
(1)将收集到的鲢鱼排进行清洗，沥干，然后用绞肉机绞碎，封装冷藏，得到预处理鱼排；
(2)将步骤(1)得到的预处理鱼排加入到去离子水中配成底物液，固液比为1:6，按加酶量1500U/g加入碱性蛋白酶，以1M H3PO4和1M Ca(OH)2调节底物液的初始pH值为8.0，在55℃水浴中振荡酶解5h后，灭酶，以8000rmp转速离心15min，收集上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液中按加酶量1500U/g加入风味蛋白酶，将底物pH调节为7.0，在50℃水浴中振荡酶解3h后，灭酶，以8000rmp转速离心15min，收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液依次通过分子量为10kDa和3kDa的超滤膜，从而获得蛋白分子量<3kDa、3-10kDa和>10kDa的三种鲢鱼排酶解液；
对本发明实施例所制备的蛋白分子量<3kDa、3-10kDa和>10kDa的鲢鱼排酶解液进行性能测试，具体如下：
1、DPPH自由基清除率测定
采用乙醇溶液作溶剂，配制浓度为0.1mM的DPPH自由基溶液，避光保存，现配现用，取鲢鱼排酶解液2.0mL与DPPH自由基溶液2.0mL混合，充分振荡，在室温下避光孵育45min，于波长517nm处测定吸光度Ai；对照组为等体积乙醇溶液代替DPPH自由基溶液，测得吸光值为Aj；空白组为等体积水代替样品溶液，测得其吸光值为A0，并以等体积去离子水和乙醇混合液为空白调零，
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
式中：Ai—样品组的吸光度；
Aj—对照组的吸光度；
A0—空白组的吸光度。
实验结果如图1所示，从图中可以看出随着各多肽组分浓度的升高，其DPPH自由基清除率均呈现上升趋势，呈现出良好的剂量-效应关系，说明受试物的DPPH自由基清除率与其浓度具有一定的关系。其中<3kDa的多肽组分DPPH自由基清除率从27.02％上升到88.75％，3-10kDa的多肽组分DPPH自由基清除率从19.10％上升到73.32％，>10kDa的多肽组分DPPH自由基清除率从8.78％上升到41.29％。由此可以看出<3kDa的多肽组分具有更好地清除DPPH自由基的能力，这个结果说明分子量大小与多肽的DPPH自由基清除率呈现负相关的关系。
2、ABTS自由基清除能力的测定
以蒸馏水为溶剂，配制含ABTS(7mM)、过硫酸钾(2.45mM)的混合溶液，并于23℃的暗处避光孵育15小时，制得ABTS自由基阳离子基准液。取基准液适量稀释，使其在734nm处的吸光度为0.700±0.005，制得ABTS自由基阳离子工作液。
取ABTS自由基阳离子工作液3.9mL与0.1mL鲢鱼排酶解液混合，充分振荡，于23℃条件下避光反应6min，测定混合溶液在波长734nm处的吸光度；等体积蒸馏水代替样品液做空白组。用ABTS自由基的清除率表示水解物对ABTS自由基的清除能力：
ABTS自由基清除率(％)＝[1-As/A0]×100％
式中：As—样品组的吸光度；
A0—空白组的吸光度。
实验结果如图2所示，从图中可以看出鲢鱼排酶解液能够有效清除反应体系中的ABTS自由基，并且随着各多肽组分浓度的升高，ABTS自由基的清除率也呈现上升趋势，表现出良好的剂量-效应关系，其中<3kDa的多肽组分ABTS自由基清除率从22.97％上升到91.21％，3-10kDa的多肽组分ABTS自由基清除率从17.99％上升到83.79％，>10kDa的多肽组分ABTS自由基清除率从12.86％上升到78.19％，由此可以看出<3kDa的多肽组分具有更好的清除ABTS自由基的能力，表明多肽分子量大小与其的ABTS自由基清除率呈现负相关的关系。
3、羟自由基清除能力的测定
1mL硫酸亚铁溶液(9mM)、1mL过氧化氢溶液(10mM)与1mL不同浓度的鲢鱼排酶解液混合，充分振荡，37℃水浴10min后加入1mL水杨酸溶液(9mM)，振荡混匀，37℃水浴30min，于波长510nm处测定反应混合溶液的吸光度A1；对照组为等体积水代替过氧化氢溶液，测得其吸光值为A2；空白组为等体积水代替样品溶液，测得其吸光度为A0。
羟自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
式中：A1—样品组的吸光度；
A2—对照组的吸光度；
A0—空白组的吸光度。
实验结果如图3所示，从图中可以看出鲢鱼排酶解液各超滤组分对羟自由基的清除率也呈现出良好的剂量-效应关系，羟自由基清除率与多肽浓度表现出正相关关系，在多肽浓度为1mg/mL时，各组分对羟自由基的清除率较低，为10％以下，当浓度上升到5mg/mL时，<3kDa的多肽组分羟自由基清除率上升到了67.02％，3-10kDa的多肽组分羟自由基清除率上升到了56.98％，>10kDa的多肽组分羟自由基清除率上升到了42.67％，<3kDa的多肽组分在各浓度的羟自由基清除率均高于其他组分，鲢鱼排水解物具有清除羟自由基的效果可能是由于在水解过程中一些抗氧化氨基酸被暴露出来，这些氨基酸可以提供与羟自由基活性电子发生反应的质子，进而消除体系内的羟自由基。
4、金属离子螯合能力的测定
1mL硫酸铜溶液(2mM)与1mL吡啶溶液混合，充分振荡，加入0.1mL邻苯二酚紫溶液(0.1％，w/v)，充分振荡后加入1mL蒸馏水和0.1mL不同浓度的鲢鱼排酶解液，充分振荡，25℃反应10min，于波长632nm处测定反应混合溶液的吸光度，蒸馏水代替样品液作空白对照。
Cu2+螯合率(％)＝[1-Am/A0]×100％
式中：Am—样品组的吸光度；
A0—空白组的吸光度。
实验结果如图4所示，从图中可以看出鲢鱼排酶解液对Cu2+具有较强的鳌合能力，且各超滤组分对Cu2+的螯合能力呈现出良好的剂量-效应关系，在多肽浓度较低时(<2mg/mL)，三个组分对Cu2+的螯合能力差异较小，但是当多肽浓度继续提高时，<3kDa的多肽组分对Cu2+的螯合能力明显高于其他组分，这说明分子量大小与多肽的Cu2+的螯合能力呈现负相关的关系。
5、还原能力的测定
取0.2M磷酸盐缓冲液(pH为6.6)2.5mL、l％(w/v)铁氰化钾溶液2.5mL与不同浓度的鲢鱼排酶解液2.5mL混匀，充分振荡，50℃水浴20min，迅速冷却，加入10％(w/v)三氯乙酸溶液2.5mL混匀，充分振荡，3000r/min离心10min，取上层清液2.5mL，加入蒸馏水2.5mL及0.1％(w/v)三氯化铁溶液0.5mL，振荡混匀，室温反应10min后，测定其在波长700nm处的吸光度。吸光度值越大，表示鲢鱼排水解物的还原能力越强。
实验结果如图5所示，从图中可以看出鲢鱼排酶解液各个超滤组分均显示出良好的还原能力，并且还原能力随多肽浓度的增加而升高，呈现出良好的剂量-效应关系，其中<3kDa的多肽组分其反应溶液在700nm处的吸光度从0.301上升到0.985，3-10kDa的多肽组分其反应溶液在700nm处的吸光度从0.255上升到0.896，>10kDa的多肽组分其反应溶液在700nm处的吸光度从0.208上升到0.783，当多肽浓度较低时，<3kDa和3-10kDa组分的还原能力差异较小，并且在多肽浓度为3mg/mL时，3-10kDa组分的还原能力更强，但是当浓度增加到5mg/mL时，<3kDa的组分明显具有更强的还原能力。
本发明实施例中鲢鱼排酶解液各超滤组分都具有一定的自由基清除活性、Cu2+螯合能力及还原能力，且各超滤组分的体外抗氧化性都呈现明显的剂量-效应关系，其中<3kDa的多肽组分体外抗氧化显著高于其它组分。
本发明选择蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液进行LC-MS/MS和MS/MS检测，具体操作步骤如下：
取蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液用C18柱进行除盐处理，除盐后的肽段溶液经离心浓缩仪抽干后，冻存于-20℃等待上机检测；
质谱数据使用Q Exactive Plus质谱仪串联EASY-nLC 1200液相的液质联用系统进行采集，肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至分析柱(50μm*15cm,C18,2μm,)进行分离，利用两个流动相(流动相A:0.1％formic acid和流动相B:0.1％formic acid,80％ACN)建立100min分析梯度，液相的流速设置为300nL/min，质谱以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(R＝70K,AGC＝3e6,max IT＝20ms,scanrange＝350–1800m/z)，以及随后的15个MS/MS扫描(R＝17.5K,AGC＝2e5,max IT＝50ms)，HCD碰撞能量设置为28，四级杆的筛选窗口设置为1.6Da，离子重复采集的动态排除时间设置为35s。
图6为鲢鱼排酶解液<3kDa组分的质谱Basepeak图，质谱MS1扫描范围通常为350-1500m/z，肽段离子化后大部分电荷数为+2价，蛋白中氨基酸残基平均分子量约为110Da，因此质谱检测到的肽段大部分位于7-27氨基酸，使用MaxQuant软件中的Andromeda算法对所检测到的肽段离子最佳匹配谱图进行评分，评分越高表明二级谱图与肽段离子的匹配程度越好，肽段鉴定证据越充分，一般认为评分高于0的肽段均为有效鉴定，所检测出纯度较高的肽段序列和相关信息如下表所示：
从表中可以看出鲢鱼排抗氧化肽的分子量在500-3200Da之间，这与相关研究表明的大多数抗氧化肽分子量处于200-3000Da之间相符合。
本发明通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析，得到其中丰度较高、氨基酸构成符合抗氧化肽特征的9条肽段，分别为GEPFLPMP或PYLIGQF或FSFHMHVNGANALVA或VIVYDQPF或TPIKFDQIVY或HTIIITW或TAYYGPIPF或GPPGPPGP或GPPGPPGTPGPQ。
更进一步地，本发明对其中丰度最高和氨基酸构成符合抗氧化肽特征的两个肽段(母离子m/z 674.338和m/z 528.759)，通过串联质谱(MS/MS)完成其特征离子质子峰的二级质谱分析，作为这两个肽段及对应蛋白的鉴定证据，GPPGPPGP的二级质谱图如图7所示，GPPGPPGTPGPQ的二级质谱图如图8所示。
本发明还提供鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片的制备方法，具体步骤如下：
将本发明实施例中得到的蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液进行喷雾干燥，即得到鲢鱼排抗氧化肽粉，然后将15g鲢鱼排抗氧化肽粉、25g微晶纤维素、35g奶粉、3g羧甲基纤维素钠和25g甘露醇混合均匀，粉碎后过40目筛，再加入0.5g硬脂酸镁，混合均匀后移入压片机模具中压片成形，得到鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片。
最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Glu Pro Phe Leu Pro Met Pro
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Tyr Leu Ile Gly Gln Phe
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Ser Phe His Met His Val Asn Gly Ala Asn Ala Leu Val Ala
1 5 10 15
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Ile Val Tyr Asp Gln Pro Phe
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Pro Ile Lys Phe Asp Gln Ile Val Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
His Thr Ile Ile Ile Thr Trp
1 5
<210> 7
<211> 9
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<212> PRT
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<400> 9
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln
1 5 10

Claims (9)

1.一种鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将收集到的鲢鱼排进行清洗，沥干，然后用绞肉机绞碎，封装冷藏，得到预处理鱼排；
（2）将步骤（1）得到的预处理鱼排配成底物液，加入碱性蛋白酶进行一次酶解，酶解结束后，高温灭酶，离心收集上清液；
（3）向步骤（2）得到的上清液中加入风味蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后，高温灭酶，离心收集上清液；
（4）将步骤（3）得到的上清液通过分子量为3kDa的超滤膜，从而获得蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液；
（5）通过LC-MS/MS技术对步骤（4）得到的蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液进行检测，通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析。
2.根据权利要求1所述的鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，步骤（2）中，底物液的固液比为1:4-10。
3.根据权利要求2所述的鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，步骤（2）中，碱性蛋白酶的添加量为500-4500U/g。
4.根据权利要求3所述的鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，步骤（2）中，一次酶解时，溶液的pH为7.8-8.2，酶解温度为50-60℃，酶解时间为3-5h。
5.根据权利要求2所述的鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，步骤（3）中，风味蛋白酶的添加量为1000-2000U/g。
6.根据权利要求2所述的鲢鱼排抗氧化肽的分离方法，其特征在于，步骤（3）中，二次酶解时，溶液的pH为6.8-7.2，酶解温度为45-55℃，酶解时间为2-4h。
7.如权利要求1-6任一项所述分离方法在提取鲢鱼排抗氧化肽中的应用。
8.一种鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 将鲢鱼排抗氧化肽粉、微晶纤维素、奶粉、羧甲基纤维素钠和甘露醇混合均匀，粉碎后过40目筛，再加入硬脂酸镁，混合均匀后移入压片机模具中压片成形，得到鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片；其中鲢鱼排抗氧化肽粉的制备方法如下：将采用权利要求2所述分离方法得到的蛋白分子量<3kDa的鲢鱼排酶解液进行喷雾干燥，即得到鲢鱼排抗氧化肽粉。
9.如权利要求8所述鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，所述鲢鱼排抗氧化肽粉、微晶纤维素、奶粉、羧甲基纤维素钠、甘露醇和硬脂酸镁的质量比为12-20:20-30:35-40:2-5:20-30:0.5-1。
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