CN1148577C - 对外来火蚁有特异性的抗体和scfv免疫毒素及其应用 - Google Patents

对外来火蚁有特异性的抗体和scfv免疫毒素及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1148577C
CN1148577C CNB988070790A CN98807079A CN1148577C CN 1148577 C CN1148577 C CN 1148577C CN B988070790 A CNB988070790 A CN B988070790A CN 98807079 A CN98807079 A CN 98807079A CN 1148577 C CN1148577 C CN 1148577C
Authority
CN
China
Prior art keywords
fragment
scfv
ant
midgut
epithelial cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB988070790A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1263598A (zh
Inventor
R��ɣ����
R·桑德斯
K·克林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Original Assignee
RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION filed Critical RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Publication of CN1263598A publication Critical patent/CN1263598A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1148577C publication Critical patent/CN1148577C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种制备安全、成本低、对环境无害，并且在生态学上安全的经生物工程改造用来对付外来火蚁的产品的方法。用免疫学和基因工程技术来产生单克隆抗体(mAb)以及展示scFv重链和/或轻链Ig片段的病毒(噬菌体)，这些抗体和Ig片段表现出和外来火蚁蚁后中肠微绒毛细胞高亲合力特异结合。将特异性单克隆抗体和噬菌体展示的抗体Fab片段偶联于毒素，以定向输递和破坏外来火蚁蚁后，但不消灭本地的种类，从而将恢复天然的生态系统。

Description

对外来火蚁有特异性的抗体和 SCFV免疫毒素及其应用
                            发明背景
发明领域
本发明总地涉及免疫学和基因工程技术。具体地说，本发明涉及用免疫学工程来生产新的试剂，该试剂将毒药靶向外来火蚁蚁后(imported fire ants queen)中肠内微绒毛细胞上的细胞表面分子。
相关技术描述
外来火蚁是得克萨斯州以及美国南部其它州中的一种生态学和经济学上的灾害。外来火蚁于30年代被偶然带入美国。这些害虫完全扰乱和破坏了天然生态系统，并给农业(大土丘损坏机器)、大牧场(丧失新生的牲畜)以及娱乐和旅游业(失去可捕猎的鸟，并使公园和游览区变得不舒适)产生了不利的经济影响。
控制火蚁的一个特殊问题是应当怎样来控制或消灭外来昆虫种类而不消灭本地的昆虫种类。这个问题与已经引入美国所有地区的众多非本地动物种类有关。外来种类通常比本地种类更具竞争优势，因为在许多情况下，它们已经产生了增强的繁殖策略并且在它们的新环境中没有自然界捕食者。因此，除去这些外来种类很重要。另一方面，不应当除去本地种类，因为特定生态系统的适当平衡包括了该本地种类的存在。
目前，本领域中有各种控制火蚁的方法。化学毒药(如AMDRO)是本领域中熟知的并且时常被采用。然而，这些毒药可能会污染环境，并且会不加区别地消灭本地种类以及外来种类。
因此，现有技术还缺少一种在环境上安全的、特异性靶向、并仅仅消灭外来火蚁的根除外来火蚁产品。本发明满足了本领域长期以来的这一需求。
                            发明概述
本发明涉及一种安全、成本低、对环境顺适并且在生态学上安全的经生物工程改造用来对付外来火蚁的产品，以及该产品的制备方法。用免疫学和基因工程技术产生单克隆抗体(mAb)和所得的Fab片段，以及展示抗体片段的病毒(噬菌体)(称为单链重链或轻链V-基因片段(scFv)或scFv重链和轻链片段(Fab))，这些抗体和片段表现出对外来火蚁蚁后中肠微绒毛细胞高亲合力特异性结合。将特异性单克隆抗体和噬菌体展示的抗体scFv和Fab片段偶联于毒素(凝溶胶蛋白(gelonin)、细菌内毒素或其它毒素)，或将编码促凋亡诱导剂、细胞循环封闭剂、细胞增殖抑制剂、分化诱导剂的cDNA与scFvFab片段连接，以定向输递和破坏外来火蚁蚁后，但不消灭本地的种类，从而恢复天然的生态系统。另外，双特异性的Fab或scFv(Fab的一个臂表现出对靶向的细胞膜胞外结构域有特异性，Fab的另一个臂表现出对凝溶胶蛋白、细菌内毒素或其它毒素有特异性)提供了另一种新的特异性定向输递毒素的方法。将编码凝溶胶蛋白、细菌内毒素或其它毒素的酶促活性结构域区域的DNA序列插入编码特异性scFv重链或轻链Ig片段或Fab Ig片段的DNA中的方法提供了另一种定向输递毒素的方法。
本发明的一个目的是提供一种对付和控制昆虫害虫的特殊方法，该方法对环境顺适，不会伤害本地的动物种类。
在本发明的一个实例中，提供了一种将促凋亡性、细胞周期抑制剂特异性输递至靶细胞的组合物。
本发明还有一方面是提供一种将毒素和细胞生长抑制剂输递给靶细胞的组合物。
本发明另一方面提供了一种将毒药靶向靶细胞而不靶向非靶细胞的试剂的生产方法，该方法包括下列步骤：用所述靶细胞免疫接种动物，产生单克隆抗体；收获并富集脾细胞；用聚乙二醇使所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合伙伴杂交；通过在HAT培养基中生长来选择杂交瘤；用ELISA技术筛选杂交瘤上清液中鼠抗体的产生，用免疫组织学技术筛选对中肠微绒毛抗原有特异性的抗体；通过极限稀释、筛选杂交瘤上清液，扩展克隆并冷冻阳性克隆来进行克隆；和获得稳定的产生单克隆抗体的杂交瘤，产生上清液或腹水液体或制备纯化的单克隆抗体。
本发明还有一个方面提供了一种杀死火蚁的方法，该方法包括使所述火蚁和本文公开的方法所产生的多肽接触的步骤。
本发明的其它方面、特征和优点能从下列关于本文较佳实例的描述中明显得出。给予这些实施例的目的是为了公开。
                            附图简述
为了获得并详细了解上文所述的本发明的特征、优点和目的以及将要明了的其它方面，可以参考所附附图中描述的本发明某些实例对上文简单归纳的发明作更特定的描述。这些附图构成了说明书的一部分。然而，应当注意所附附图只是描述了本发明的较佳实例，因此不认为它们限制了本发明的范围。
图1示出了本发明的方法，该方法包括免疫引导；cDNA制备；产生噬菌体文库；噬菌体选择；确认特异性scFv和Fab；和对其作测试。
                            发明详述
本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指包含对靶细胞有特异性的重链和轻链多肽的抗体，它产生自并选自克隆的产生抗体的细胞。
本文所用的术语“抗体片段”或“Fab”指以免疫球蛋白为基础的最小的识别单元。免疫球蛋白重链和轻链的V-基因节段表现出对靶抗原有高亲和力。
本文所用的术语“scFv”片段指免疫球蛋白为基础的最小的识别单元，对靶细胞有高亲合力的单链重链或轻链或组合的重链和轻链V基因Ig片段。
本文所用的术语“双特异性抗体”指用化学方法或DNA技术衍生获得的对两个不同的抗原决定簇有特异性的Fab或scFv免疫球蛋白片段，即Ig特异性单元的一个臂与靶向的抗原反应，另一个臂与诸如凝溶胶蛋白或细菌内毒素的毒素特异性反应。
本文所用的术语“毒素”指以毒性方式作用的任何化学物质，当其进入靶细胞时它杀死细胞，它通过三种不同的机制输递：与靶向Ig片段化学连接；双特异性Fab技术或通过提供scFv重链毒素细胞毒性结构域的DNA技术。一种典型的毒素是凝溶胶蛋白(它是一种熟知的核糖体灭活蛋白)或其重组形式。
本文所用的术语“噬菌体展示文库”指多达2×108个独立的免疫球蛋白Fab或scFv片段的克隆的全部文库。
本文所用的术语“促凋亡剂”、“细胞循环封闭剂”、“细胞增殖抑制剂”和“细胞增殖剂”指控制细胞增殖、细胞循环、细胞分化和细胞死亡的基因的cDNA，它与单克隆(抗体)的Fab片段或scFv重链和/或轻链Ig片段连接，以便特异性地输递给靶细胞。
本文所用的术语“噬菌体展示的Fab”和“噬菌体展示的scFv”指展示在噬菌体上并通过抗原和靶细胞的结合来选择的Fab或scFv重链和/或轻链Ig片段的全部组成成分。
根据本发明，可以采用本领域技术人员所知的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已有详细说明。例如参见，Maniatis，Fritsch &Sambrook，″分子克隆实验指南″(1982)；“DNA克隆实用方法”，第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编辑，1984)；“核酸杂交”(B.D.Hames& S.J.Higgins编辑(1985))；“转录和翻译”(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，(1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney，编辑(1986))；“固定化细胞和酶”(IRL Press，(1986))；B.Perbal，″分子克隆实用指导″(1984)。
“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，它可以和另一DNA节段相连以便复制所连接的节段。如果它的给予能被哺乳动物接受者耐受，则称载体是“药学上可接受的”。如果给予量在生理学上是有效的，则称该试剂以“治疗有效量”给予。如果试剂的存在导致哺乳动物接受者的生理学发生改变，则该试剂在生理学上是有效的。例如，在治疗逆转录病毒感染时，降低感染蔓延或由于感染引起的生理性损害的化合物将被认为是在治疗上有效的。
当将此DNA导入细胞内时，则称细胞已经被外源或异源DNA“转化”。转化DNA可以整合或不整合(共价连接)入细胞基因组中。例如，在原核细胞、酵母和哺乳动物细胞中，转化的DNA可以维持在附加元件(如质粒)上。对于真核细胞而言，稳定转化的细胞是一种转化DNA已经整合入染色体从而通过子代细胞染色体复制遗传的细胞。这种稳定性能通过真核细胞能建立包含一群具有转化DNA的子代细胞群体的细胞系或克隆来得以证实。“克隆”是一群通过有丝分裂衍生自单个细胞或共同祖先的细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长多代的原代细胞克隆。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，例如是为编码序列在宿主细胞中表达而提供的启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等。
“DNA分子”指单链形式或双链螺旋体形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的多聚体形式。该术语仅仅指分子的一级和二级结构，而并不限制它任何特定的三级形式。因此，该术语特别包括在线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在根据正常惯例讨论本文的结构时，只给出了沿非转录DNA链5′到3′方向的序列(即具有与mRNA同源的序列的链)。
本发明涉及一种火蚁根除产品，该产品对于环境是安全的，它特异性靶向，并只消灭外来火蚁。另外还考虑到，本发明的方法可用来特异性靶向任何动物昆虫。
生产并筛选对特异性抗原表位高亲合力的单克隆抗体是熟知的标准实验程序。本领域普通技术人员熟知的DNA技术能将编码小的免疫球蛋白识别单元(称为抗体片段，即表现出和完整的较大的母抗体相同抗原特异性的免疫球蛋白重链和轻链N端可变结构域)的DNA导入病毒表达载体(噬菌体)中，该载体在其表面上产生并展示scFv重链和轻链以及重链和轻链相组合的Ig片段(2-9)。这种技术已经用来特异性靶向并选择性破坏肿瘤细胞；然而，该技术迄今还未被用于特异性靶向并消灭昆虫害虫或其它动物害虫。
噬菌体展示方法比传统的单克隆抗体更好的主要优点在于：在病毒表面上可以产生并表达出scFv重链或轻链以及组合的重链和轻链Ig v-区基因的、大而且多样的全部所有组成成分；从而能快速筛选和选择具有靶向特异性的高亲合力(牢固结合)的scFv Ig片段。重要的是，一旦选择了对抗原表位有特异性的特异性噬菌体展示的scFvIg片段，编码该特异性Fab片段的DNA就可用来将凝溶胶蛋白、细菌内毒素或其它毒素的经基因工程改造的酶促活性结构域、编程性细胞死亡(凋亡)基因以及破坏细胞增殖抑制的基因导入该Fab DNA中。这样，就产生了一个输递特异性毒素、凋亡诱导剂、细胞增殖剂或细胞分化诱导剂的靶向系统。具有酶促活性凝溶胶蛋白或细菌毒素或其它细胞死亡诱导基因产物的、具有靶向特异性的scFv或Fab Ig片段的产生提供了定向输递细胞死亡诱导产物的一种新方法。
本发明利用免疫学和基因工程技术来产生单克隆抗体和展示抗体scFv和Fab Ig片段的病毒(噬菌体)，该抗体或片段被选择和外来火蚁蚁后中肠微绒毛细胞特异性反应，但是不和本地火蚁蚁后微绒毛细胞特异性反应。这些scFv和Fab Ig片段和特异性不局限于针对外来火蚁蚁后的微绒毛细胞，而是包括被任何动物种类的被Fab或scFv Ig片段特异性靶向的任何细胞、组织或器官，在这些动物种中这些细胞、组织或器官的破坏会导致该动物种类被遏制或消灭。将这些单克隆抗体以及噬菌体展示的scFv片段偶联于毒素(例如凝溶胶蛋白(一种没有进入细胞机制的核糖体灭活蛋白，它没有毒性，除非被特异性地输递到细胞内)或其它毒素)，从而将毒素输递到外来火蚁蚁后的消化道。
在本发明的还有一个方面，提供了一种杀死火蚁的方法，该方法包括使所述火蚁和用本文公开的方法产生的多肽接触的步骤。本领域普通技术人员能够根据待消灭的火蚁类型和数量通过常规实验来确定本文公开的新的多肽的最佳浓度。
给予下列实施例的目的是为了描述本发明的不同实施例，而并不意味着以任何方式限制本发明：
                            实施例1
                  用中肠微绒毛细胞免疫接种小鼠
用从产卵的外来火蚁蚁后获得的中肠制备物免疫接种Balb/c小鼠。用抗原性复合物切碎的中肠来免疫接种，然后进行双重选择程序(见实施例4)和免疫组织化学程序(见实施例5)，以选择对外来火蚁蚁后微绒毛细胞有特异性的scFv重链和/或轻链Ig片段或单克隆Fab片段。
利用标准细胞培养程序，用免疫小鼠的脾细胞来产生种特异性单克隆抗体。该单克隆抗体对外来火蚁的中肠微绒毛抗原有特异性。用实施例5所述的免疫组织化学程序选择具有特异性的所得杂交瘤上清。
另外，产生了种特异性抗体噬菌体展示的scFv重链和/或轻链Ig片段，它与中肠微绒毛细胞的胞外结构域反应。图1示出了开发噬菌体展示的scFv重链和/或轻链Ig片段时的每一步程序。
                            实施例2
      从免疫接种小鼠脾获得的总RNA制备、扩增和纯化cDNA
从三只免疫小鼠的脾脏中抽提和纯化出总RNA。用试剂盒(Boehringer Mannheim)以及两个引物(一个引物对IgG重链有特异性，另一个对κ轻链有特异性)将RNA反转录(RT)成cDNA(4)。分别用IgG重链和κ轻链特异性引物以及以前公开的热循环条件(见4、5、6)通过聚合酶链反应(PCR)程序扩增cDNA。根据大小通过凝胶电泳分离PCR扩增的产物。
                            实施例3
 展示在丝状噬菌体表面上的scFv重链和/或轻链Ig片段组合文库的构建
用如(4)所述的两步顺序连接步骤以及购自Stratagene的ImmunoZAP试剂盒在丝状噬菌体表达载体中构建scFv重链和轻链Ig片段的组合文库。简言之，酶促断裂凝胶纯化的PCR产物，将PCR产物连接到重链载体1Hc2和轻链载体1Lc中。构建的重链和轻链文库包括scFv片段。然后，组合重链和轻链构建物以产生Fab组合构建物。然后用噬菌体文库转化大肠杆菌细胞，并用辅助噬菌体(VCSM13，Stratagene)感染细胞产生足量的噬菌体展示抗体片段，以便筛选和选择(4)。scFv重链和轻链以及免疫球蛋白重链和轻链的重链和轻链Ig V-区特异性片段用作对靶细胞有高结合亲合性单链V-片段(scFv)或作为对靶细胞有高结合亲合性的组合的重链/轻链V-片段(Fab)。
                             实施例4
               用两步选择来鉴定对外来火蚁蚁后的中肠
                膜抗原有特异性的抗体scFv或Fab片段
第一步选择步骤涉及使表达整个抗体scFv或Fab片段的噬菌体文库和从外来火蚁蚁后获得的切开以暴露微绒毛细胞的中肠游离细胞或反应。洗去不能结合的Ig展示噬菌体，而展示能以高亲合性结合外来火蚁中肠抗原的scFv或Fab Ig片段的噬菌体被洗脱并保留。第二步选择采用本地火蚁蚁后的中肠制备物来进行。只收集不能和本地火蚁蚁后中肠膜抗原反应的噬菌体展示的scFv或Fab片段。重复该选择程序三次，以提供具有便于克隆的高亲合力和亲和性的特异性Ig片段。对所选噬菌体(和外来火蚁蚁后的中肠膜抗原反应，但是不和本地火蚁蚁后的该抗原反应)进行基因工程改造，使得它们不再被展示，而是在大肠杆菌中产生时被分泌。选择程序不局限于上述顺序，也就是说，展示Ig的噬菌体可以首先和本地火蚁蚁后的微绒毛抗原反应，然后选择不与本地火蚁蚁后微绒毛抗原反应的展示Ig的噬菌体，用来和外来火蚁蚁后的微绒毛抗原反应。
                             实施例5
           所选噬菌体展示的抗体scFv或Fab片段以及单克隆
              抗体和外来火蚁中肠微绒毛细胞反应的确认
使所选噬菌体展示的scFv或Fab片段(来自上文实施例4)和各种中肠细胞膜抗原(包括微绒毛细胞抗原)反应。用中肠组织切片的免疫组织化学染色来确定克隆的噬菌体展示的scFv重链和轻链或重链和轻链组合的Ig片段只和外来火蚁蚁后的中肠微绒毛细胞反应。使中肠组织切片和克隆的scFv或Fab组分反应，用灵敏的免疫过氧化物酶VECTASTAIN Elite ABC系统(Vector Laboratories)测定噬菌体的存在。在大肠杆菌中扩增和外来火蚁蚁后微绒毛细胞呈阳性反应但是不和本地火蚁微绒毛细胞反应的克隆，并如实施例6和7所述的那样使用。为了选择单克隆抗体，使中肠组织切片和杂交瘤上清液反应，洗涤，并和偶联了碱性磷酸酶的家兔抗小鼠Ig第二抗体反应。然后加入底物，检查和外来火蚁蚁后中肠微绒毛抗原呈阳性反应但是不和本地火蚁蚁后中肠微绒毛抗原反应的玻片。
                             实施例6
     所选噬菌体展示的抗体片段以及单克隆抗体在体内有效的确认
根据特异性和高亲和力结合外来火蚁微绒毛选出单克隆抗体和scFv重链和/或轻链Ig片段，在大肠杆菌中扩增，测试其在口服后被微绒毛细胞内化的能力。在控制环境中建立外来和本地火蚁群落，每个群落包括一只产卵的外来火蚁蚁后、50只翼状处女火蚁蚁后和约5000只工蚁。将单克隆抗体或scFv或Fab片段混合在大豆食物中给群落喂食。处死每个群落的产卵蚁蚁后和处女蚁蚁后，取出中肠。从中肠制得冷冻组织切片，用上述的免疫组织学染色分析这些切片中scFv重链和/或轻链Ig片段的存在和内在化。用该方法分析单克隆Fab片段。
                            实施例7
           噬菌体展示产生的scFv Ig片段和单克隆Fab片段
            是导向破坏外来火蚁的有效的输递系统的确认
用下列技术将核糖体灭活蛋白、凝溶胶蛋白、细菌内毒素或其它毒素连接到单克隆Fab片段以及scFv重链和/或轻链Ig片段：采用已经成功用于偶联毒素和单克隆抗体Fab片段或scFv重链Ig片段的熟知的化学偶联或连接程序；利用对所靶向抗原以及毒素有特异性的双特异性(Fab)2或scFv重链异二聚体，该异二聚体用已建立的程序(10-12)通过建立稳定的硫醚键在体外产生；在体内利用DNA技术和基因工程改造技术来产生二聚肽，以便用所述技术(13)在大肠杆菌或哺乳动物细胞中产生二价二聚体(对所靶向的抗原和毒素有特异性)，以及用(14)中描述的技术通过基因工程改造scFv重链-毒素的酶促活性结构域，并由细菌表达和分泌。
用免疫组织学技术确定Ig片段和中肠微绒毛抗原连接和内在化，在控制的、已建立的外来和本地火蚁实验群落中，测试scFv重链和/或轻链或单克隆抗体的“喂食”结合外来火蚁蚁后中肠微绒毛抗原但不结合本地火蚁蚁后中肠微绒毛抗原的能力。在实验室建立的蚁群落中以及田间条件下，测试靶向的scFv重链和/或轻链和单克隆Fab片段加上毒素选择性杀死外来火蚁的能力。
本文引用了下列参考文献：
1.Holldobler，B.和E.O.Wilson 1990.″蚂蚁″The Belknap Press，Cambridge，Mass.
2.Barbas，C.和R.Lerner.1991.″噬菌体表面的组合免疫球蛋白文库(phabs)：抗原特异性的快速筛选″Fab.Methods：Comp.Met.Enzym.2：119.
3.Ames，R.，M.Tometta，C.Jones和P. Tsui.1994.″从丝状噬菌体单价Fab展示文库分离中和抗-C5a抗体″J.Immun.152：4572.
4.Ames等人(15位共同作者)1995.″分离自杂交瘤和丝状噬菌体Fab展示文库的针对人IL-5的中和鼠单克隆抗体″J.Immunol.154：6355.
5.Winter，G.，A.D.Griffiths，R.E.Hawkins和H.R.Hoogenboom.1994.″用噬菌体展示技术制备抗体″Ann.Rev.Immunol.12：433.
6.Vaughan，T.J.等人，1996.″分离自大的未免疫噬菌体展示文库的具有亚纳摩尔亲和力的人抗体″Nature Biotech.14：309.
7.Kruif，J.de.等人，1996.″重组人抗体的新前景″Immunology Today 17：453.
8.Kruif，J.de.和T.Logtenberg.1996.″来自半合成抗体噬菌体展示文库的亮氨酸拉链二聚、二价和双特异性scFv抗体″J.Bio.Chem.271：7630.
9.Davis，J.和L.Riechmann.1995.″作为小的识别单元的抗体VH结构域″Biotechnology 13：475.
10.French，R，C.Penney，A.Browning，F.Stirpe，A.George和M.Glennie，1995，″用双特异性抗体通过CD22和CD38将核糖体灭活蛋白，凝溶胶蛋白输递给淋巴瘤细胞″Brit.J.Cancer 71：986.
11.Better，M.，S.Bernhard，D.Fishwild，P.Nolan，R.Bauer，A.Kung，和S.Carroll.1994.″具有工程改造过的半胱氨酸残基的凝溶胶蛋白类似物形成具有独特性质的抗体免疫偶联物″J.Biol.Chem.269-9644.
12.Glennie，M.J.，H.M.McBride，A.T.Worth和G.T.Stevenson.″含有硫醚连接的Fab′片段的双特异性F(ab′)2抗体的制备和性能″J.Immunol.139：2367-2375，1987.
13.Holliger，P.，和G.Winter.″工程改造的双特异性抗体″，Current Opinion inBiotechnology 4：446-449，1993.
14.Maurer-Gebhard，M.，M.Schmidt，M.Azemar，U.Altenschmidt，E.Stocklin，W.Wels，和B.Groner.″用重组erbB-2受体特异性肿瘤毒素的系统性治疗有效地减少了注射了经遗传修饰的肿瘤细胞的小鼠体内肺转移″Cancer Res.58：2661-2666，1998.
本说明书中提及的任何专利或出版物均表明了本发明所属领域的技术人员水平。另外，这些专利和出版物一起纳入本文作参考，正如每份单独的出版物单独具体地纳入本文作参考那样。
本领域技术人员很容易理解，本发明非常适合实现本文提到的目的，获得本文提到的结果和优点以及本文固有的那些目的、结果和优点。本文的实施例以及本文描述的方法、程序、处理、分子和具体化合物表示了较佳的例子，具有代表性，并非意图限制本发明的范围。本领域技术人员能对本文作改动和其它用途，这些均包括在由权利要求所确定的本发明的精神内。

Claims (2)

1.一种生产与毒素活性结构域相连的对外来火蚁中肠微绒毛抗原有特异性的scFv或Fab片段的方法，该方法包括下列步骤：
用经外来火蚁中肠区细胞免疫的动物所得的cDNA产生一个表达scFv重链和/或轻链Ig片段的噬菌体展示文库；
使所述表达scFv重链和/或轻链Ig片段的噬菌体展示文库和外来火蚁的中肠细胞反应；
洗涤所述被反应的中肠细胞，除去所表达的scFv Ig片段不与所述中肠细胞结合的噬菌体；
从所述中肠细胞中洗脱表达结合性scFv Ig片段的噬菌体；
使所述洗脱的、表达scFv Ig片段的噬菌体和本地火蚁的中肠细胞反应；
洗涤所述被反应的本地火蚁中肠细胞，除去未与本地火蚁中肠细胞结合的、洗脱的、表达scFv Ig片段的噬菌体；
工程改造scFv片段，使其不再被展示，而是在大肠杆菌中生产时被分泌；
在大肠杆菌中扩增scFv重链和/或轻链Ig片段；
收集分泌的scFv Ig片段；
用基因工程方法或化学交联方法将所述scFv Ig片段和毒素的酶促活性结构域相连，从而产生了由对外来火蚁中肠微绒毛抗原有结合特异性的Ig片段和毒素活性结构域组成的单个多肽。
2.一种杀灭外来火蚁的方法，该方法包括：
用经外来火蚁中肠区细胞免疫的动物所得的cDNA产生一个表达scFv重链和/或轻链Ig片段的噬菌体展示文库；
使所述表达scFv重链和/或轻链Ig片段的噬菌体展示文库和外来火蚁的中肠细胞反应；
洗涤所述被反应的中肠细胞，除去所表达的scFv Ig片段不与所述中肠细胞结合的噬菌体；
从所述中肠细胞中洗脱表达结合性scFv Ig片段的噬菌体；
使所述洗脱的、表达scFv Ig片段的噬菌体和本地火蚁的中肠细胞反应；
洗涤所述被反应的本地火蚁中肠细胞，除去未与本地火蚁中肠细胞结合的、洗脱的、表达scFv Ig片段的噬菌体；
工程改造scFv片段，使其不再被展示，而是在大肠杆菌中生产时被分泌；
在大肠杆菌中扩增scFv重链和/或轻链Ig片段；
收集分泌的scFv Ig片段；
用基因工程方法或化学交联方法将所述scFv Ig片段和毒素的酶促活性结构域相连，从而产生了由对外来火蚁中肠微绒毛抗原有结合特异性的Ig片段和毒素活性结构域组成的单个多肽；
使所述火蚁和所述单个多肽接触。
CNB988070790A 1997-07-10 1998-07-09 对外来火蚁有特异性的抗体和scfv免疫毒素及其应用 Expired - Fee Related CN1148577C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5213297P 1997-07-10 1997-07-10
US60/052,132 1997-07-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1263598A CN1263598A (zh) 2000-08-16
CN1148577C true CN1148577C (zh) 2004-05-05

Family

ID=21975684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB988070790A Expired - Fee Related CN1148577C (zh) 1997-07-10 1998-07-09 对外来火蚁有特异性的抗体和scfv免疫毒素及其应用

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1000357A4 (zh)
JP (1) JP2001509397A (zh)
KR (1) KR20010021624A (zh)
CN (1) CN1148577C (zh)
AU (1) AU739004B2 (zh)
CA (1) CA2295914A1 (zh)
IL (1) IL133666A0 (zh)
NZ (1) NZ501963A (zh)
RU (2) RU2208641C2 (zh)
TW (1) TW585921B (zh)
WO (1) WO1999002991A1 (zh)
ZA (1) ZA986114B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2856075B1 (fr) * 2003-06-16 2007-10-12 Monoclonal Antibodies Therapeu Procede essentiellement automatise de criblage a grande echelle de cellules secretant des anticorps monoclonaux
GB0422431D0 (en) * 2004-10-08 2004-11-10 Affitech As Method
AU2006221823B2 (en) * 2005-03-11 2011-06-09 Syngenta Limited Rodent pest control
CN100402666C (zh) * 2005-10-21 2008-07-16 中山大学 鉴定入侵南美红火蚁的方法及所用的核酸序列、探针与试剂盒
EP2609116A1 (en) * 2010-08-26 2013-07-03 Agrosavfe N.V. Insect binding antibodies
GB201108598D0 (en) 2011-05-20 2011-07-06 Shotter Nicholas R Front suspension system
EP3415010A1 (en) 2017-06-13 2018-12-19 Agrosavfe Nv Insect-controlling polypeptides and methods
RU2731516C1 (ru) * 2019-08-01 2020-09-03 Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства Антитела против анафилатоксина C5a человека

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1416280A3 (en) * 1995-09-14 2005-08-10 The Regents of the University of California Antibodies specific for native PrPsc

Also Published As

Publication number Publication date
CN1263598A (zh) 2000-08-16
IL133666A0 (en) 2001-04-30
KR20010021624A (ko) 2001-03-15
JP2001509397A (ja) 2001-07-24
RU2208641C2 (ru) 2003-07-20
EP1000357A1 (en) 2000-05-17
AU739004B2 (en) 2001-10-04
AU8389698A (en) 1999-02-08
TW585921B (en) 2004-05-01
RU2002132957A (ru) 2005-01-27
WO1999002991A1 (en) 1999-01-21
EP1000357A4 (en) 2005-05-25
ZA986114B (en) 2000-01-10
NZ501963A (en) 2001-08-31
CA2295914A1 (en) 1999-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1032660B1 (en) Method of identifying binding site domains that retain the capacity of binding to an epitop
JP2023099206A (ja) Ｃｄ２０結合分子およびその使用方法
RU2459868C2 (ru) Способ клонирования когнатных антител
CN101448951A (zh) 融合蛋白、其用途以及制备方法
CN1822857A (zh) 去免疫原性抗cd3抗体
CN101720368A (zh) 储备多样性最大化的功能性人化抗体文库之构建及应用
Criscitiello What the shark immune system can and cannot provide for the expanding design landscape of immunotherapy
JP2022105176A (ja) 免疫レパートリー配列増幅法および適用
CN1148577C (zh) 对外来火蚁有特异性的抗体和scfv免疫毒素及其应用
US20230293652A1 (en) Immunostimulatory adjuvants
DE69832804T2 (de) Verfahren zur herstellung von katalytischen antikörpern
Eger et al. Generation and characterization of a human/mouse chimeric GD2-mimicking anti-idiotype antibody ganglidiximab for active immunotherapy against neuroblastoma
CN109306008A (zh) 一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法
US20060018912A1 (en) Snares for pathogenic or infectious agents and uses related thereto
CN1331888C (zh) 一种抗人b细胞淋巴瘤的单链双特异性抗体
CN101899115A (zh) 二硫键稳定的抗cd3-抗cd19微型双功能抗体及其制备方法
CN101357942B (zh) 一种中和肠出血性大肠杆菌0157：H7志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体、Fab抗体与应用
Zhou et al. High throughput screening of scFv antibodies against viral hemorrhagic septicaemia virus by flow cytometry
CN1169952C (zh) 抗cd20单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用
US7011835B1 (en) Targeted destruction of pests
CN109943572B (zh) 生产抗体片段的方法
WO2001058955A1 (en) Targeted destruction of pests
CN1036794C (zh) 抗人活化血小板单克隆抗体，其制备方法及应用
JP2007236237A (ja) ベクターライブラリーの製造方法、人工ポリクローナル抗体の製造方法、及び医薬組成物の製造方法
Guan Ng et al. Cancer Antibody Engineering: Comparison of Mammalian, Yeast, Bacterial, Plants, Cell-free and Hybridoma Expression Systems

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee