CN114854843A - 一种引发溶血性输血反应的a2血型变异型的snp位点 - Google Patents

一种引发溶血性输血反应的a2血型变异型的snp位点 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种用于检测ABO血型系统A型变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，为新的A型变异型基因编码区域由起始密码子起第467位和626位碱基。本发明提供了A型变异型基因的新的用途，从而提供了一种有效的对能够引发的急性血管内溶血性输血反应的快速基因诊断、基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的新突变位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行新的A型变异型基因突变位点的快速检测。

Description

一种引发溶血性输血反应的A2血型变异型的SNP位点
技术领域
本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种可引发急性或迟发性溶 血性输血反应ABO血型系统A2血型变异型的SNP位点，并通过检测该SNP 位点来建立快速检测A2血型变异型的方法。
发明背景
ABO血型系统是临床输血及器官移植中最为重要的血型系统，其中A2亚 型是ABO血型中常见的变异型。部分A2亚型患者血清中有抗-A1抗体，2018 年荷兰报道了一例A2亚型患者输入A1型红细胞引起严重的溶血性输血反应死 亡的事件。发明人所在单位在对A型变异型的筛查中，首次发现了一例新的A2 变异型，其红细胞上A抗原强度较正常红细胞减弱，导致血浆中存在抗-A1抗 体，一旦输注A型人血液，极易发生输血性溶血反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种引发溶血性输血反应的A2血型变异型的SNP位 点，并通过检测该SNP位点来筛选存在引发溶血性输血反应的A2血型变异型 的患者，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种引发溶血性输血反应的A2血型变异型的SNP位点， 该突变位点能引发急性溶血性输血反应，该突变位点为ABO血型基因(NCBI Reference Sequence:NM_020469.3)编码区ATG起始第467位c.467C>T的突 变和第626位c.626G>A的突变；
作为实施例的一种具体记载，所述的SNP位点位于如下序列的第467位 c.467C>T、第626位c.626G>A；
atggccgaggtgttgcggacgctggccggaaaaccaaaatgccacgcacttcgacctatgatc cttttcctaataatgcttgtcttggtcttgtttggttacggggtcctaagccccagaagtctaatg ccaggaagcctggaacgggggttctgcatggctgttagggaacctgaccatctgcagcgcgtctcg ttgccaaggatggtctacccccagccaaaggtgctgacaccgtgtaggaaggatgtcctcgtggtg accccttggctggctcccattgtctgggagggcacattcaacatcgacatcctcaacgagcagttc aggctccagaacaccaccattgggttaactgtgtttgccatcaagaaatacgtggctttcctgaag ctgttcctggagacggcggagaagcacttcatggtgggccaccgtgtccactactatgtcttcacc gaccagccggccgcggtgccccgcgtgacgctggggaccggtcggcagctgtcagtgctggaggtg cgcgcctacaagcgctggcaggacgtgtccatgcgccgcatggagatgatcagtgacttctgcgagcggcgcttcctcagcgaggtggattacctggtgtgc(SEQ ID NO:1)。
本发明还提供用于检测所述的SNP位点的制剂的一种用途，是用于制备用 于检测引发溶血性输血反应的A2血型变异型的制品中的用途；
所述的检测所述的SNP位点的制剂，作为实施例的一种具体记载，为PCR 扩增测序引物或单倍型扩增及测序引物；
所述的制品为PCR扩增测序试剂盒，其中包含有检测上述SNP位点的扩 增测序引物或单倍型扩增及测序引物；
其中扩增引物的序列信息如下：
ABOnt467&nt626-F:5'-CCGCCTGCCTTGCAGATA-3'(SEQ ID NO:2)、 ABOnt467&nt626-R:5'-ACCGCAGTGAACCTCAGCTT-3'(SEQ ID NO:3)，
所述的单倍型扩增及测序引物的信息如下：
ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'(SEQ ID NO:4)、
ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'(SEQ ID NO:5)。
本发明提供了一种可引发急性或迟发性溶血性输血反应ABO血型A型变异 型的SNP位点，并建立快速检测方法，从而提供了一种有效的避免急性溶血性 输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本 发明所提供的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO 血型A型变异型基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1：先证者直接测序图；为先证者ABO基因Exon7 PCR产物直接测序 结果图，采用ABO-E7R引物对PCR产物进行测序，黑色箭头指向双峰起始位 点，提示其中一条链有碱基缺失。蓝色箭头所指为c.467C>T和c.626G＞A突 变。
图2：先证者克隆测序图，先证者ABO基因编码区域由起始密码子起第467 位碱基发生了突变(c.467C＞T)，626位碱基发生了突变(c.626G＞A)。
具体实施方式
申请人在一个ABO血型AB型变异型基因家系中发现致病性SNP位点， 并证实该基因的突变是导致A型血型发生变异，导致红细胞A抗原比正常A型 人红细胞A抗原要弱，并且血浆中产生同种抗-A1抗体。一旦输入A型血液， 很可能引发急性溶血性输血反应。
所发现的SNP位点位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成大约1065bp的 mRNA(NCBI登录号为NM_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的 蛋白质。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：对ABO血型基因A型变异型先证者基因检测，确认A型变异型 的突变位点
1、提取外周血基因组DNA：
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取ABO血型 AB型变异型基因家系成员外周静脉血5ml，放入EDTA-Na2抗凝管内；DNA提 取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：
吸取500μL抗凝血，采用基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，并 且调整基因组DNA含量为30～50ng/μL，纯度为1.8～2.0。对提取的DNA 行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA 纯度及浓度。
2、直接测序法检测先证者A变异型基因的突变位点
(1)PCR反应体系：
Figure BDA0003624914330000041
应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述 ABOnt467&nt626-F、ABOnt467&nt626-R引物进行扩增反应。
(2)PCR反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃ 60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延 伸10min，扩增产物10℃保温。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中 应用引物对ABOnt467&nt626-F:5'-CCGCCTGCCTTGCAGATA-3'； ABOnt467&nt626-R:5'-ACCGCAGTGAACCTCAGCTT-3'。
测序结果表明，在先证者发现ABO血型A基因编码区域由起始密码子起第 467和626位碱基发生了突变。其中第467位碱基开始出现CT杂合序列，626 位碱基开始出现GA杂合序列。多次测序结果表明该突变位点的确存在该突变， 并不是因为扩增或测序错误引进的(图1、图2)。
3、对ABO基因第7外显子进行单倍型测序，确定先证者A变异型基因的 突变位点
PCR扩增目的片段引物：ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCAC CCTGCCA-3'；ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'。
PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。
PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃ 50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。
(2)反应体系：
Figure BDA0003624914330000051
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板进行扩增反应。 将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引 物使用ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'；ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'(测序引物也可以选用从A 型变异基因上设计的，能扩增SNP位点的其它引物)确定样本的单倍型序列。
结果表明该突变为一新发现的突变。该突变不存在于下面的两个数据库中： 单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)、千人基因组计划 (ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)、Hapmap8数据库 (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)。检索结 果表明该突变非常罕见，该突变导致了编码A血型的蛋白组成的核苷酸发生改 变，A基因编码区域由起始密码子起第467位由C>T，导致了第156位氨基酸 由脯氨酸变为亮氨酸，626位由G＞A，导致了第209位氨基酸由半胱氨酸变为 酪氨酸；氨基酸的突变从而引起了此A变异型的个体A抗原表位发生缺失抗原 减弱，导致这种个体不需要免疫刺激就能够产生血浆中能够产生同种的抗-A1抗 体(天然免疫)，当输注正常人的A型血液时就会发生急性溶血性输血反应， 从而危及患者生命。
在青岛市中心血站输血医学研究所收集先证者的其它家系成员的外周血基 因组DNA，应用上述DNA作为模板与ABOnt467&nt626-F、ABOnt467&nt626-R 引物进行PCR目的片段的扩增，常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR 产物进行直接测序。结果发现该先证者的两名家系成员的ABO血型A基因存在 本发明中发现的SNP突变，即编码区域由起始密码子起第626位G碱基突变为 A。继续对发现突变的两位家系成员进行ABO基因第7外显子单倍型测序，应 用上述提取基因组DNA作为模板与ABO-E6mo、ABO-E7mo引物进行PCR目 的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定， 单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现，先证 者c.467C>T突变，导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，c.626G＞A 突变,导致了第209位氨基酸由半胱氨酸变为酪氨酸。
通过上述的分析，证明可以通过检测本发明筛选的SNP位点来检测个体 ABO血型基因是否发生A基因突变，从而确定是否存在潜在的发生输血后急 性输血型溶血反应的危险。
序列表
<110> 青岛市中心血站
<120> 一种引发溶血性输血反应的A2血型变异型的SNP位点
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccgagg tgttgcggac gctggccgga aaaccaaaat gccacgcact tcgacctatg 60
atccttttcc taataatgct tgtcttggtc ttgtttggtt acggggtcct aagccccaga 120
agtctaatgc caggaagcct ggaacggggg ttctgcatgg ctgttaggga acctgaccat 180
ctgcagcgcg tctcgttgcc aaggatggtc tacccccagc caaaggtgct gacaccgtgt 240
aggaaggatg tcctcgtggt gaccccttgg ctggctccca ttgtctggga gggcacattc 300
aacatcgaca tcctcaacga gcagttcagg ctccagaaca ccaccattgg gttaactgtg 360
tttgccatca agaaatacgt ggctttcctg aagctgttcc tggagacggc ggagaagcac 420
ttcatggtgg gccaccgtgt ccactactat gtcttcaccg accagccggc cgcggtgccc 480
cgcgtgacgc tggggaccgg tcggcagctg tcagtgctgg aggtgcgcgc ctacaagcgc 540
tggcaggacg tgtccatgcg ccgcatggag atgatcagtg acttctgcga gcggcgcttc 600
ctcagcgagg tggattacct ggtgtgc 627
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcctgcct tgcagata 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accgcagtga acctcagctt 20
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggatccat gtgggtggca ccctgcca 28
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcctaggc ttcagttact c 21

Claims (9)

1.一种引发溶血性输血反应的A2血型变异型的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于ABO血型基因编码区ATG起始第467位c.467C>T、第626位c.626G>A。
2.用于检测权利要求1所述的SNP位点的制剂的用途，其特征在于，是在制备用于检测引发溶血性输血反应的A2血型变异型的制品中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的制剂为PCR扩增测序引物或单倍型扩增及测序引物。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的制品为PCR扩增测序试剂盒。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的PCR扩增测序引物，其上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的单倍型扩增及测序引物，其上游引物的序列为SEQ ID NO:4，下游引物的序列为SEQ ID NO:5。
7.一种用于检测A2血型变异型的分子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含有用于检测权利要求1所述的SNP位点的PCR扩增或测序引物对。
8.如权利要求7所述的分子检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物对，其一种引物对中，上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
9.如权利要求7所述的分子检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物对，其一种引物对中，上游引物的序列为SEQ ID NO:4，下游引物的序列为SEQ ID NO:5。
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