CN114853898A - 一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。本发明提供了呈递特异蛋白的病毒样颗粒。所述特异蛋白为SARS‑CoV‑2的S蛋白的RBD区段。所述呈递特异蛋白的病毒样颗粒为对基孔肯雅病毒样颗粒进行如下改造得到的：在基孔肯雅病毒的E2蛋白中插入所述特异蛋白。插入位置具体可为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间。所述的病毒样颗粒可用于制备产品；所述产品的用途为如下：(e1)作为新型冠状病毒疫苗；(e2)作为预防和/或治疗新冠肺炎的药物。本发明对于SARS‑CoV‑2具有重要的应用推广价值。

Description

一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚 单位疫苗

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。

背景技术

冠状病毒是一种有囊膜的正义RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属。一些冠状病毒严重威胁人类健康，如导致严重呼吸综合征(SARS)爆发的SARS-CoV和导致中东呼吸综合征(MERS)爆发的MERS-CoV，以及导致新冠病毒肺炎(COVID-19)的SARS-CoV-2。此外，还有一些在人体导致症状较轻疾病的冠状病毒，如HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-HKU1等。一些冠状病毒还可以感染动物，对宠物健康和牲畜生产造成影响，如猫腹膜炎病毒(FIPV)会导致猫的腹膜炎和腹水、具有高致死率，猪流行性腹泻病毒(PEDV)会导致生猪腹泻、严重威胁生猪的生产。此外,还有可以感染犬、鼠和牛的冠状病毒。抵御病毒感染最有效的方式就是疫苗接种，目前世界各国都在加紧研发针对新型冠状病毒及其它冠状病毒的疫苗。

在新冠疫情爆发的初期，科学家已经证实该病毒进入细胞采用的受体为细胞表面的蛋白ACE2，而直接介导与ACE2相互作用的是病毒表面刺突蛋白(S)上的受体结合区(RBD)。从自然感染患者体内分离得到的中和抗体大多数能够结合RBD并且阻止RBD与ACE2的相互作用，因此RBD作为免疫原将能够刺激机体产生中和抗体抑制病毒与受体的结合。

目前的研究显示，将RBD单体或者二聚体蛋白或者编码RBD的mRNA作为疫苗均能够刺激机体产生中和抗体。但RBD单体或者二聚体的免疫原性相对较弱，且目前尚无被批准上市的RNA疫苗，其长期的安全性仍然不明确，因此开发具较高安全性且高免疫原性的RBD亚单位疫苗十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。

本发明提供了呈递特异蛋白的病毒样颗粒。

所述特异蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区段。

所述呈递特异蛋白的病毒样颗粒为对基孔肯雅病毒样颗粒进行如下改造得到的：在基孔肯雅病毒的E2蛋白中插入所述特异蛋白。插入位置具体可为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间。

基孔肯雅病毒的E2蛋白具体如SEQ ID NO:2中第326-747位氨基酸残基所示。

基孔肯雅病毒样颗粒由capsid蛋白、E1蛋白、E2蛋白、E3蛋白和6K蛋白自组装形成。基孔肯雅病毒的多聚蛋白(capsid-E3-E2-6K-E1)(见图1)被宿主蛋白酶切割产生capsid蛋白、E1蛋白、E2蛋白、E3蛋白和6K蛋白。

基孔肯雅病毒的多聚蛋白具体如SEQ ID NO:2所示。

所述具有特异蛋白的病毒样颗粒对基孔肯雅病毒样颗粒还进行了如下改造：用Flag标签取代了基孔肯雅病毒的多聚蛋白中的Furin cleavage site。

Furin cleavage site如SEQ ID NO:2中第322-325位氨基酸残基所示。

所述呈递特异蛋白的病毒样颗粒为对基孔肯雅病毒样颗粒进行如下两个改造得到的：在E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间插入了SEQ ID NO:1所示的SARS-CoV-2RBD(插入片段上游引入了柔性linker“SGS”，插入片段下游引入了柔性linker“GS”)；用Flag标签取代了Furin cleavage site(Flag标签上游引入了柔性linker“SGG”，Flag标签下游引入了柔性linker“GGGS”)。

所述呈递特异蛋白的病毒样颗粒是由CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白得到的；所述CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白是将基孔肯雅病毒的多聚蛋白改造得到的；所述改造包括：在基孔肯雅病毒的E2蛋白中插入所述特异蛋白。插入位置具体可为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间。

基孔肯雅病毒的E2蛋白具体如SEQ ID NO:2中第326-747位氨基酸残基所示。

基孔肯雅病毒的多聚蛋白包括capsid蛋白、E1蛋白、E2蛋白、E3蛋白和6K蛋白。

所述改造还包括：用Flag标签取代基孔肯雅病毒的多聚蛋白中的Furincleavagesite。

Furin cleavage site如SEQ ID NO:2中第322-325位氨基酸残基所示。

所述CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白是将基孔肯雅病毒的多聚蛋白进行如下两个改造得到的：在E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间插入了SEQ ID NO:1所示的SARS-CoV-2RBD(插入片段上游引入了柔性linker“SGS”，插入片段下游引入了柔性linker“GS”)；用Flag标签取代了Furin cleavage site(Flag标签上游引入了柔性linker“SGG”，Flag标签下游引入了柔性linker“GGGS”)。

基孔肯雅病毒的多聚蛋白具体如SEQ ID NO:2所示。

CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白包括：基孔肯雅病毒的capsid蛋白、E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白、基孔肯雅病毒的6K蛋白和基孔肯雅病毒的E1蛋白。

CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白自N端至C端依次包括：基孔肯雅病毒的capsid蛋白、E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白、基孔肯雅病毒的6K蛋白和基孔肯雅病毒的E1蛋白。

E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白包括：基孔肯雅病毒的E3蛋白、Flag标签、E2蛋白N区段、所述特异蛋白、E2蛋白C区段。

E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白自N端至C端依次包括：基孔肯雅病毒的E3蛋白、Flag标签、E2蛋白N区段、所述特异蛋白、E2蛋白C区段。

E2蛋白N区段为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第1-204位氨基酸残基；E2蛋白C区段为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第205-422位氨基酸残基。

E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白具体如SEQ ID NO:3中第262-1035位氨基酸残基所示。

CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白具体如SEQ ID NO:3所示。

本发明还保护一种融合蛋白，即CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白，包括如下：病毒样颗粒的结构蛋白和特异蛋白；所述特异蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区段。

所述病毒样颗粒为基孔肯雅病毒样颗粒。

病毒样颗粒的结构蛋白为基孔肯雅病毒的多聚蛋白。

所述融合蛋白是将基孔肯雅病毒的多聚蛋白进行如下改造得到的：在基孔肯雅病毒的E2蛋白中插入所述特异蛋白。插入位置具体可为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间。

所述融合蛋白是将基孔肯雅病毒的多聚蛋白进行如下两个改造得到的：在基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间插入所述特异蛋白；用Flag标签取代Furin cleavage site。

基孔肯雅病毒的E2蛋白具体如SEQ ID NO:2中第326-747位氨基酸残基所示。

Furin cleavage site如SEQ ID NO:2中第322-325位氨基酸残基所示。

所述融合蛋白是将基孔肯雅病毒的多聚蛋白进行如下两个改造得到的：在E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间插入了SEQ ID NO:1所示的SARS-CoV-2RBD(插入片段上游引入了柔性linker“SGS”，插入片段下游引入了柔性linker“GS”)；用Flag标签取代了Furin cleavage site(Flag标签上游引入了柔性linker“SGG”，Flag标签下游引入了柔性linker“GGGS”)。

基孔肯雅病毒的多聚蛋白具体如SEQ ID NO:2所示。

所述融合蛋白包括：基孔肯雅病毒的capsid蛋白、E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白、基孔肯雅病毒的6K蛋白和基孔肯雅病毒的E1蛋白。

所述融合蛋白自N端至C端依次包括：基孔肯雅病毒的capsid蛋白、E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白、基孔肯雅病毒的6K蛋白和基孔肯雅病毒的E1蛋白。

E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白包括：基孔肯雅病毒的E3蛋白、Flag标签、E2蛋白N区段、所述特异蛋白、E2蛋白C区段。

E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白自N端至C端依次包括：基孔肯雅病毒的E3蛋白、Flag标签、E2蛋白N区段、所述特异蛋白、E2蛋白C区段。

E2蛋白N区段为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第1-204位氨基酸残基；E2蛋白C区段为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第205-422位氨基酸残基。

E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白具体如SEQ ID NO:3中第262-1035位氨基酸残基所示。

所述融合蛋白具体如SEQ ID NO:3所示。

编码所述融合蛋白的核酸分子或者具有所述核酸分子的重组质粒均属于本发明的保护范围。

示例性的，所述核酸分子具体如SEQ ID NO:7所示。

示例性的，所述重组质粒是将SEQ ID NO:7所示的双链DNA分子插入pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点，得到的重组质粒。

示例性的，所述重组质粒是将SEQ ID NO:7所示的双链DNA分子取代pcDNA3.1(+)载体KpnI和XhoI之间的小片段，得到的重组质粒。

本发明还保护一种制备病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：将所述重组质粒转染哺乳动物细胞，然后进行细胞培养，然后收集病毒样颗粒。

所述哺乳动物细胞具体可为HEK293F细胞。

所述方法制备得到的病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述的病毒样颗粒或所述的蛋白质或所述的核酸分子或所述的重组质粒；

所述产品的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)作为新型冠状病毒疫苗；

(e2)作为预防和/或治疗新冠肺炎的药物。

所述产品还可包括疫苗佐剂，例如铝胶佐剂。

本发明还保护以上任一所述的病毒样颗粒或所述的蛋白质或所述的核酸分子或所述的重组质粒在制备产品中的应用；

所述产品的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)作为新型冠状病毒疫苗；

(e2)作为预防和/或治疗新冠肺炎的药物。

发明人尝试了一些所述插入位置(基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间)附近的其他位置，但形成的VLP不理想。

以上任一所述SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区段为含V320-S591的肽段。

以上任一所述SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区段具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

(a2)来源于SARS-CoV-2且与SEQ ID NO:1所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(a3)将SEQ ID NO:1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

以上任一所述CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)SEQ ID NO:3所示的蛋白质；

(b2)与SEQ ID NO:3所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(b3)将SEQ ID NO:3所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

编码CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白的核酸分子具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)SEQ ID NO:7所示的DNA分子；

(c2)与(c1)具有98％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(c3)在严格条件下与(c1)杂交且编码所述的DNA分子。

VLP即病毒样颗粒的缩写。

本发明提供了呈递冠状病毒受体结合区的基孔肯雅病毒样颗粒，可作为预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的亚单位疫苗。本发明通过瞬时转染重组质粒在HEK293F细胞中表达CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白。CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白中基孔肯雅病毒E2蛋白204位氨基酸附近插入SARS-CoV-2RBD(含V320-S591)肽段。CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白在细胞中翻译表达后形成capsid-E3-DYKDDDDK(Flag标签)-E2-RBD-E2-6K-E1多聚蛋白，该多聚蛋白自切割成capsid，E3-DYKDDDDK(Flag标签)-E2-RBD-E2,6K，以及E1蛋白，并由这些蛋白自组装形成不规则球形的病毒样颗粒，即CHIKV-RBD-Flag1-VLP。

CHIKV-RBD-Flag1-VLP的表面高密度展示SARS-CoV-2RBD以刺激免疫细胞产生针对RBD的免疫反应及抗体。对小鼠进行免疫，发现CHIKV-RBD-Flag1-VLP能够高效刺激小鼠产生针对SARS-CoV-2RBD的抗体，并能够诱导产生高滴度的中和抗体。本发明提供的呈递冠状病毒受体结合区的基孔肯雅病毒样颗粒，制备方法简单直接，纯化过程简单高效。

本发明对于SARS-CoV-2具有重要的应用推广价值。

附图说明

图1为CHIKV多聚蛋白和CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白的结构示意图。

图2为CHIKV-RBD-Flag1-VLP的电镜复染照片。

图3为分子筛进行纯化的色谱图。

图4为检测血清中SARS-CoV-2RBD特异性的IgG抗体滴度的结果。

图5为检测血清中中和抗体的滴度的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，实施例中的缓冲液均为如下：含25mM Tris-HCl和150mM NaCl,余量为水，pH8.0。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、病毒样颗粒的制备

一、构建重组质粒

将SEQ ID NO:6所示的双链DNA分子取代pcDNA3.1(+)载体的KpnI和XhoI之间的小片段，得到重组质粒pcDNA3.1-CHIKV-VLP。SEQ ID NO:6所示的双链DNA分子编码SEQ IDNO:2所示的CHIKV多聚蛋白(结构域示意图见图1)。SEQ ID NO:2所示的CHIKV多聚蛋白中，第1-261位氨基酸残基组成capsid蛋白，第262-321位氨基酸残基组成E3蛋白，第322-325位氨基酸残基组成Furin cleavage site，第326-747位氨基酸残基组成E2蛋白，第748-809位氨基酸残基组成6K蛋白，第810-1248位氨基酸残基组成E1蛋白。CHIKV多聚蛋白被宿主蛋白酶切割产生capsid蛋白、E1蛋白、E2蛋白、E3蛋白、6K蛋白，这些蛋白自组装形成病毒样颗粒，即CHIKV-VLP。

将SEQ ID NO:7所示的双链DNA分子取代pcDNA3.1(+)载体的KpnI和XhoI之间的小片段，得到重组质粒pcDNA3.1-CHIKV-RBD-Flag1。SEQ ID NO:7所示的双链DNA分子编码SEQID NO:3所示的CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白(结构域示意图见图1)。SEQ ID NO:3所示的CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白中，第1-261位氨基酸残基组成capsid蛋白，第262-1035位氨基酸残基组成E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白，第1036-1097位氨基酸残基组成6K蛋白，第1098-1536位氨基酸残基组成E1蛋白。与CHIKV多聚蛋白相比，CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白的差异仅在于如下：在E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间插入了SEQ IDNO:1所示的SARS-CoV-2RBD(插入片段上游引入了柔性linker“SGS”，插入片段下游引入了柔性linker“GS”)；用Flag标签取代了Furin cleavage site(Flag标签上游引入了柔性linker“SGG”，Flag标签下游引入了柔性linker“GGGS”)。CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白被宿主蛋白酶切割产生capsid蛋白、E1蛋白、E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白、6K蛋白，这些蛋白自组装形成病毒样颗粒，即CHIKV-RBD-Flag1-VLP。E3-Flag-E2N-RBD-E2C融合蛋白中，自N端至C端依次包括：E3蛋白、Flag标签、E2蛋白N区段、SARS-CoV-2RBD、E2蛋白C区段。

二、制备CHIKV-VLP

1、采用SMM 293-TII培养基培养HEK293F细胞至对数生长期(密度达到1.5×10⁶-2.0×10⁶个细胞/ml培养体系)，然后借助PEI MAX转染重组质粒

pcDNA3.1-CHIKV-VLP(2μg重组质粒/ml培养体系)，然后继续培养24h,然后加入无血清无蛋白补料液SMS 293-SUPI(35ml/L培养体系)，然后继续培养48h。SMM 293-TII培养基和无血清无蛋白补料液SMS 293-SUPI(又称为SMS 293-SUPI培养基添加液)均为义翘神州生物技术有限公司产品。

2、完成步骤1后，1000g离心10min，收集上清。

3、取步骤2得到的上清，4500g离心1h,收集上清。

4、取步骤3得到的上清，加入PEG6000(使其在体系中的浓度为7g/100mL)和NaCl(使其在体系中的浓度为0.5M)，4℃搅拌12小时，然后4500g离心1h，收集沉淀。

5、取步骤4得到的沉淀，先用缓冲液小心清洗，然后用缓冲液重悬，得到沉淀重悬液。蔗糖作为溶质，缓冲液作为溶剂，使蔗糖浓度为24g/100ml，即24％蔗糖溶液。向BeckmanSW41Ti转子对应的超速离心管中加入2ml 24％蔗糖溶液，然后将约7.5ml沉淀重悬液小心铺在蔗糖溶液上方，然后使用超速离心机4℃、32000rpm离心2h，收集离心管底的沉淀。

6、取步骤5得到的沉淀，用缓冲液重悬，得到沉淀悬液。在Beckman SW41Ti转子对应的透明超速离心管中制备20％-60％连续密度梯度蔗糖(蔗糖作为溶质，缓冲液作为溶剂，蔗糖浓度％含义为g/100ml)，然后将1ml沉淀悬液铺于连续密度梯度蔗糖的顶部，使用超速离心机4℃、140000g离心15h,穿刺抽取密度梯度中上部的目的条带。

7、取步骤6得到的抽取物，采用型号为100kD cutoff的浓缩管将缓冲体系置换为缓冲液，即为CHIKV-VLP溶液。

8、取步骤7得到的CHIKV-VLP溶液，采用nanodrop检测蛋白浓度，分装后液氮速冻存于-80℃。

三、制备CHIKV-RBD-Flag1-VLP

1、采用SMM 293-TII培养基培养HEK293F细胞至对数生长期(密度达到1.5×10⁶-2.0×10⁶个细胞/ml培养体系)，然后借助PEI MAX转染重组质粒

pcDNA3.1-CHIKV-RBD-Flag1(2μg重组质粒/ml培养体系)，然后继续培养24h,然后加入无血清无蛋白补料液SMS 293-SUPI(35ml/L培养体系)，然后继续培养48h。SMM293-TII培养基和无血清无蛋白补料液SMS 293-SUPI(又称为SMS 293-SUPI培养基添加液)均为义翘神州生物技术有限公司产品。

2、完成步骤1后，1000g离心10min，收集上清。

3、取步骤2得到的上清，4500g离心1h,收集上清。

4、取步骤3得到的上清，加入anti-Flag beads(每升上清约配比1ml beads)，4℃震荡混匀12小时。anti-Flag beads：金斯瑞生物科技有限公司。

5、完成步骤4后，100g离心10min，收集beads。

6、将步骤5收集的beads转移到重力流空柱(BIO-RAD公司,型号为Econo-Pac)中，使用缓冲液充分洗去杂蛋白，然后使用含200μg/ml 3×Flag peptide的缓冲液竞争性洗脱目的蛋白，将含有目的蛋白的过柱后溶液通过100kD cutoff浓缩管浓缩并将缓冲体系置换为缓冲液，得到CHIKV-RBD-Flag1-VLP溶液。3×Flag peptide：强耀生物合成。

7、取步骤6得到的CHIKV-RBD-Flag1-VLP溶液，采用nanodrop检测蛋白浓度，分装后液氮速冻存于-80℃。

8、取步骤6得到的CHIKV-RBD-Flag1-VLP溶液，进行电镜观察。

CHIKV-RBD-Flag1-VLP的电镜复染照片见图2。呈现不规则的球形。

实施例2、免疫效果评价

铝胶佐剂(Imject Alum)：Thermo Scientific Corp，货号为77161。

采用实施例1制备的CHIKV-VLP溶液或CHIKV-RBD-Flag1-VLP溶液，用pH7.4的PBS缓冲液调整蛋白浓度。

一、分组免疫

4-6周龄Balb/c雌鼠随机分为三组，每组3只。免疫过程：试验第1天进行初次免疫，试验第15天进行加强免疫。免疫方式均为：右后肢肌肉注射。单次单只小鼠免疫100μl免疫物。CHIKV-VLP组：每100μl免疫物由50μl CHIKV-VLP溶液(蛋白含量为2μg)和50μl铝胶佐剂乳化得到。CHIKV-RBD-Flag1-VLP组：每100μl免疫物由50μl CHIKV-RBD-Flag1-VLP溶液(蛋白含量为2μg)和50μl铝胶佐剂乳化得到。PBS对照组：免疫物由50μl PBS缓冲液和50μl铝胶佐剂混合得到。

分别于初次免疫后第21天、第35天、第56天，下颌采血。取血样，4℃静置约1h，然后1500g离心15min，收集血清。

二、检测血清中SARS-CoV-2RBD特异性的IgG抗体滴度。

取初次免疫后第21天的血清和初次免疫后第35天的血清，采用ELISA检测特异性结合SARS-CoV-2RBD的IgG抗体滴度。

1、制备SARS-CoV-2RBD

(1)将SEQ ID NO:8所示的DNA分子插入pcDNA3.1(+)质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒，命名为重组质粒pcDNA3.1-RBD。重组质粒已进行测序验证。

(2)采用SMM 293-TII培养基培养HEK293F细胞至对数生长期(密度达到1.5×10⁶-2.0×10⁶个细胞/ml培养体系)，然后借助PEI MAX转染重组质粒pcDNA3.1-RBD(2μg重组质粒/ml培养体系)，继续培养24h,然后加入无血清无蛋白补料液SMS 293-SUPI(35ml/L培养体系)，继续培养48h。SMM 293-TII培养基和无血清无蛋白补料液SMS293-SUPI(又称为SMS293-SUPI培养基添加液)均为义翘神州生物技术有限公司产品。。

(3)完成步骤(2)后，1000g离心10min，收集上清。

(4)取步骤(3)得到的上清，4500g离心1h,收集上清，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

(5)取步骤(4)得到的滤液，采用anti-Flag beads亲和层析进行纯化。

具体纯化步骤：在重力流空柱(BIO-RAD公司,型号为Econo-Pac)中填充anti-Flagbeads(金斯瑞生物科技有限公司)，每升滤液约配比1ml beads，在上述重力流空柱中使上述滤液流穿beads 3遍，然后用缓冲液充分洗去杂蛋白，然后用含200μg/ml3×Flagpeptide(强耀生物)的缓冲液竞争性洗脱目的蛋白，将含有目的蛋白的过柱后溶液通过10kD cutoff浓缩管浓缩。

(6)取步骤(5)得到的溶液，通过分子筛进行纯化。

具体纯化步骤：使用GE凝胶过滤预装柱Superdex 200Increase 10/300GL(分子筛)，上样体积0.2ml，使用25ml缓冲液洗脱，色谱图显示2个峰(峰值对应的保留体积分别为13.31ml和14.97ml)(见图3)，这两个峰分别对应SARS-CoV-2RBD的二聚体和单体，收集单体峰(峰值对应的保留体积为14.97ml)对应的过柱后溶液，即为SARS-CoV-2RBD溶液。

2、检测血清中SARS-CoV-2RBD特异性的IgG抗体滴度

(1)包被：取酶标板，每孔加入100μL步骤1制备的SARS-CoV-2RBD溶液(SARS-CoV-2RBD的包被量为100ng/孔，用缓冲液调整蛋白浓度)，4℃孵育过夜，弃上清。

(2)用B3T溶液封闭，37℃孵育1小时,弃上清,PBST溶液洗涤。

(3)加入血清稀释液，每孔100μL，37℃孵育1小时，弃上清,PBST溶液洗涤。

(血清稀释液：取步骤一得到的血清，用B3T溶液梯度稀释；每个稀释度设置至少2个复孔)。

(4)加入酶标二抗工作液，每孔100μL，37℃孵育1小时，弃上清，PBST溶液洗涤。

(酶标二抗为抗小鼠IgG(Abcam公司，货号ab6789)，用B3T溶液稀释至4000倍体积，即为酶标二抗工作液)。

(5)每孔加入100μL TMB染液室温孵育。

(6)每孔加入50μL终止液。

(7)用酶标仪读取450nm处的吸光值。

PBST溶液:将1L pH7.4的PBS缓冲液和0.5ml Twenn-20混匀。

B3T溶液:含3％BSA的PBST溶液。

结果见图4。CHIKV-RBD-Flag1-VLP刺激小鼠产生了高滴度的结合SARS-CoV-2RBD的抗体。

三、检测血清中中和抗体的滴度

取CHIKV-RBD-Flag1-VLP组动物初次免疫后第35天的血清和初次免疫后第56天的血清，使用SARS-CoV-2Surrogate Virus Neutralization Test Kit(GenScript,Cat.No.:L00847)检测血清的中和抗体滴度。

结果见图5。可见CHIKV-RBD-Flag1刺激小鼠产生了高滴度的中和抗体。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗

<130> CGGNQAYX206109

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

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<212> PRT

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<212> PRT

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aagggaacta tcgacaatgc cgatctggct aaactggcct ttaagcggtc gtctaaatac 480

gatcttgaat gtgcacagat accggtgcac atgaagtctg atgcctcgaa gtttacccac 540

gagaaacccg aggggtacta taactggcat cacggagcag tgcagtattc aggaggccgg 600

ttcactatcc cgacgggtgc aggcaagccg ggagacagcg gcagaccgat cttcgacaac 660

aaaggacggg tggtggccat cgtcctagga ggggccaacg aaggtgcccg cacggccctc 720

tccgtggtga cgtggaacaa agacatcgtc acaaaaatta cccctgaggg agccgaagag 780

tggagcctcg ccctcccggt cttgtgcctg ttggcaaaca ctacattccc ctgctctcag 840

ccgccttgca caccctgctg ctacgaaaag gaaccggaaa gcaccttgcg catgcttgag 900

gacaacgtga tgagacccgg atactaccag ctactaaaag catcgctgac ttgctctccc 960

caccgccaaa gacgcagtac taaggacaat tttaatgtct ataaagccac aagaccatat 1020

ctagctcatt gtcctgactg cggagaaggg cattcgtgcc acagccctat cgcattggag 1080

cgcatcagaa atgaagcaac ggacggaacg ctgaaaatcc aggtctcttt gcagatcggg 1140

ataaagacag atgacagcca cgattggacc aagctgcgct atatggatag ccatacgcca 1200

gcggacgcgg agcgagccgg attgcttgta aggacttcag caccgtgcac gatcaccggg 1260

accatgggac actttattct cgcccgatgc ccgaaaggag agacgctgac agtgggattt 1320

acggacagca gaaagatcag ccacacatgc acacacccgt tccatcatga accacctgtg 1380

ataggtaggg agaggttcca ctctcgacca caacatggta aagagttacc ttgcagcacg 1440

tacgtgcaga gcaccgctgc cactgctgag gagatagagg tgcatatgcc cccagatact 1500

cctgaccgca cgctgatgac gcagcagtct ggcaacgtga agatcacagt taatgggcag 1560

acggtgcggt acaagtgcaa ctgcggtggc tcaaacgagg gactgacaac cacagacaaa 1620

gtgatcaata actgcaaaat tgatcagtgc catgctgcag tcactaatca caagaattgg 1680

caatacaact cccctttagt cccgcgcaac gctgaactcg gggaccgtaa aggaaagatc 1740

cacatcccat tcccattggc aaacgtgact tgcagagtgc caaaagcaag aaaccctaca 1800

gtaacttacg gaaaaaacca agtcaccatg ctgctgtatc ctgaccatcc gacactcttg 1860

tcttaccgta acatgggaca ggaaccaaat taccacgagg agtgggtgac acacaagaag 1920

gaggttacct tgaccgtgcc tactgagggt ctggaggtca cttggggcaa caacgaacca 1980

tacaagtact ggccgcagat gtctacgaac ggtactgctc atggtcaccc acatgagata 2040

atcttgtact attatgagct gtaccccact atgactgtag tcattgtgtc ggtggcctcg 2100

ttcgtgcttc tgtcgatggt gggcacagca gtgggaatgt gtgtgtgcgc acggcgcaga 2160

tgcattacac catatgaatt aacaccagga gccactgttc ccttcctgct cagcctgcta 2220

tgctgcgtca gaacgaccaa ggcggccaca tattacgagg ctgcggcata tctatggaac 2280

gaacagcagc ccctgttctg gttgcaggct cttatcccgc tggccgcctt gatcgtcctg 2340

tgcaactgtc tgaaactctt gccatgctgc tgtaagaccc tggctttttt agccgtaatg 2400

agcatcggtg cccacactgt gagcgcgtac gaacacgtaa cagtgatccc gaacacggtg 2460

ggagtaccgt ataagactct tgtcaacaga ccgggttaca gccccatggt gttggagatg 2520

gagctacaat cagtcacctt ggaaccaaca ctgtcacttg actacatcac gtgcgagtac 2580

aaaactgtca tcccctcccc gtacgtgaag tgctgtggta cagcagagtg caaggacaag 2640

agcctaccag actacagctg caaggtcttt actggagtct acccatttat gtggggcggc 2700

gcctactgct tttgcgacgc cgaaaatacg caattgagcg aggcacatgt agagaaatct 2760

gaatcttgca aaacagagtt tgcatcggcc tacagagccc acaccgcatc ggcgtcggcg 2820

aagctccgcg tcctttacca aggaaacaac attaccgtag ctgcctacgc taacggtgac 2880

catgccgtca cagtaaagga cgccaagttt gtcgtgggcc caatgtcctc cgcctggaca 2940

ccttttgaca acaaaatcgt ggtgtacaaa ggcgacgtct acaacatgga ctacccacct 3000

tttggcgcag gaagaccagg acaatttggt gacattcaaa gtcgtacacc ggaaagtaaa 3060

gacgtttatg ccaacactca gttggtacta cagaggccag cagcaggcac ggtacatgta 3120

ccatactctc aggcaccatc tggcttcaag tattggctga aggaacgagg agcatcgcta 3180

cagcacacgg caccgttcgg ttgccagatt gcgacaaacc cggtaagagc tgtaaattgc 3240

gctgtgggga acataccaat ttccatcgac ataccggatg cggcctttac tagggttgtc 3300

gatgcaccct ctgtaacgga catgtcatgc gaagtaccag cctgcactca ctcctccgac 3360

tttgggggcg tcgccatcat caaatacaca gctagcaaga aaggtaaatg tgcagtacat 3420

tcgatgacca acgccgttac cattcgagaa gccgacgtag aagtagaggg gaactcccag 3480

ctgcaaatat ccttctcaac agccctggca agcgccgagt ttcgcgtgca agtgtgctcc 3540

acacaagtac actgcgcagc cgcatgccac cctccaaagg accacatagt caattaccca 3600

gcatcacaca ccacccttgg ggtccaggat atatccacaa cggcaatgtc ttgggtgcag 3660

aagattacgg gaggagtagg attaattgtt gctgttgctg ccttaatttt aattgtggtg 3720

ctatgcgtgt cgtttagcag gcactaa 3747

<210> 7

<211> 4611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggagttca tcccgacgca aactttctat aacagaaggt accaaccccg accctgggcc 60

ccacgcccta caattcaagt aattagacct agaccacgtc cacagaggca ggctgggcaa 120

ctcgcccagc tgatctccgc agtcaacaaa ttgaccatgc gcgcggtacc tcaacagaag 180

cctcgcagaa atcggaaaaa caagaagcaa aggcagaaga agcaggcgcc gcaaaacgac 240

ccaaagcaaa agaagcaacc accacaaaag aagccggctc aaaagaagaa gaaaccaggc 300

cgtagggaga gaatgtgcat gaaaattgaa aatgattgca tcttcgaagt caagcatgaa 360

ggcaaagtga tgggctacgc atgcctggtg ggggataaag taatgaaacc agcacatgtg 420

aagggaacta tcgacaatgc cgatctggct aaactggcct ttaagcggtc gtctaaatac 480

gatcttgaat gtgcacagat accggtgcac atgaagtctg atgcctcgaa gtttacccac 540

gagaaacccg aggggtacta taactggcat cacggagcag tgcagtattc aggaggccgg 600

ttcactatcc cgacgggtgc aggcaagccg ggagacagcg gcagaccgat cttcgacaac 660

aaaggacggg tggtggccat cgtcctagga ggggccaacg aaggtgcccg cacggccctc 720

tccgtggtga cgtggaacaa agacatcgtc acaaaaatta cccctgaggg agccgaagag 780

tggagcctcg ccctcccggt cttgtgcctg ttggcaaaca ctacattccc ctgctctcag 840

ccgccttgca caccctgctg ctacgaaaag gaaccggaaa gcaccttgcg catgcttgag 900

gacaacgtga tgagacccgg atactaccag ctactaaaag catcgctgac ttgctctccc 960

cacagcggcg gcgactacaa agacgatgac gacaagggag gcggaagcag tactaaggac 1020

aattttaatg tctataaagc cacaagacca tatctagctc attgtcctga ctgcggagaa 1080

gggcattcgt gccacagccc tatcgcattg gagcgcatca gaaatgaagc aacggacgga 1140

acgctgaaaa tccaggtctc tttgcagatc gggataaaga cagatgacag ccacgattgg 1200

accaagctgc gctatatgga tagccatacg ccagcggacg cggagcgagc cggattgctt 1260

gtaaggactt cagcaccgtg cacgatcacc gggaccatgg gacactttat tctcgcccga 1320

tgcccgaaag gagagacgct gacagtggga tttacggaca gcagaaagat cagccacaca 1380

tgcacacacc cgttccatca tgaaccacct gtgataggta gggagaggtt ccactctcga 1440

ccacaacatg gtaaagagtt accttgcagc acgtacgtgc agagcaccgc tgccactgct 1500

gaggagatag aggtgcatat gcccccagat actcctgacc gcacgctgat gacgcagcag 1560

tctggcaacg tgaagatcac agttaatggg cagacggtgc ggtacaagtg caactgcggt 1620

agcggcagcg tgcagcccac cgagagcatc gtgcggttcc ccaacatcac caatctgtgc 1680

cctttcggcg aggtgttcaa cgccaccaga ttcgcctctg tgtacgcctg gaaccggaag 1740

cggatcagca attgcgtggc cgactacagc gtgctgtaca acagcgccag cttcagcacc 1800

ttcaagtgct acggcgtgtc ccctaccaag ctgaacgacc tgtgcttcac caacgtgtac 1860

gccgacagct tcgtgatcag aggcgacgaa gtgcggcaga ttgcccctgg acagacaggc 1920

aagatcgccg attacaacta caagctgccc gacgacttca ccggctgtgt gattgcctgg 1980

aacagcaaca acctggacag caaagtcggc ggcaactaca actacctgta ccggctgttc 2040

cggaagtcca acctgaagcc tttcgagcgg gacatcagca ccgagatcta tcaggccggc 2100

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ttccagccta caaacggcgt gggctaccag ccttacagag tggtggtgct gagcttcgag 2220

ctgctgcatg ctcctgccac agtgtgcggc cctaagaaaa gcaccaacct ggtcaagaac 2280

aaatgcgtga acttcaactt caacggcctg accggcaccg gcgtgctgac agagagcaac 2340

aagaagttcc tgcctttcca gcagttcggc cgggatatcg ccgataccac agatgctgtc 2400

agagatcccc agacactgga aatcctggac atcaccccat gcagcggcag cggctcaaac 2460

gagggactga caaccacaga caaagtgatc aataactgca aaattgatca gtgccatgct 2520

gcagtcacta atcacaagaa ttggcaatac aactcccctt tagtcccgcg caacgctgaa 2580

ctcggggacc gtaaaggaaa gatccacatc ccattcccat tggcaaacgt gacttgcaga 2640

gtgccaaaag caagaaaccc tacagtaact tacggaaaaa accaagtcac catgctgctg 2700

tatcctgacc atccgacact cttgtcttac cgtaacatgg gacaggaacc aaattaccac 2760

gaggagtggg tgacacacaa gaaggaggtt accttgaccg tgcctactga gggtctggag 2820

gtcacttggg gcaacaacga accatacaag tactggccgc agatgtctac gaacggtact 2880

gctcatggtc acccacatga gataatcttg tactattatg agctgtaccc cactatgact 2940

gtagtcattg tgtcggtggc ctcgttcgtg cttctgtcga tggtgggcac agcagtggga 3000

atgtgtgtgt gcgcacggcg cagatgcatt acaccatatg aattaacacc aggagccact 3060

gttcccttcc tgctcagcct gctatgctgc gtcagaacga ccaaggcggc cacatattac 3120

gaggctgcgg catatctatg gaacgaacag cagcccctgt tctggttgca ggctcttatc 3180

ccgctggccg ccttgatcgt cctgtgcaac tgtctgaaac tcttgccatg ctgctgtaag 3240

accctggctt ttttagccgt aatgagcatc ggtgcccaca ctgtgagcgc gtacgaacac 3300

gtaacagtga tcccgaacac ggtgggagta ccgtataaga ctcttgtcaa cagaccgggt 3360

tacagcccca tggtgttgga gatggagcta caatcagtca ccttggaacc aacactgtca 3420

cttgactaca tcacgtgcga gtacaaaact gtcatcccct ccccgtacgt gaagtgctgt 3480

ggtacagcag agtgcaagga caagagccta ccagactaca gctgcaaggt ctttactgga 3540

gtctacccat ttatgtgggg cggcgcctac tgcttttgcg acgccgaaaa tacgcaattg 3600

agcgaggcac atgtagagaa atctgaatct tgcaaaacag agtttgcatc ggcctacaga 3660

gcccacaccg catcggcgtc ggcgaagctc cgcgtccttt accaaggaaa caacattacc 3720

gtagctgcct acgctaacgg tgaccatgcc gtcacagtaa aggacgccaa gtttgtcgtg 3780

ggcccaatgt cctccgcctg gacacctttt gacaacaaaa tcgtggtgta caaaggcgac 3840

gtctacaaca tggactaccc accttttggc gcaggaagac caggacaatt tggtgacatt 3900

caaagtcgta caccggaaag taaagacgtt tatgccaaca ctcagttggt actacagagg 3960

ccagcagcag gcacggtaca tgtaccatac tctcaggcac catctggctt caagtattgg 4020

ctgaaggaac gaggagcatc gctacagcac acggcaccgt tcggttgcca gattgcgaca 4080

aacccggtaa gagctgtaaa ttgcgctgtg gggaacatac caatttccat cgacataccg 4140

gatgcggcct ttactagggt tgtcgatgca ccctctgtaa cggacatgtc atgcgaagta 4200

ccagcctgca ctcactcctc cgactttggg ggcgtcgcca tcatcaaata cacagctagc 4260

aagaaaggta aatgtgcagt acattcgatg accaacgccg ttaccattcg agaagccgac 4320

gtagaagtag aggggaactc ccagctgcaa atatccttct caacagccct ggcaagcgcc 4380

gagtttcgcg tgcaagtgtg ctccacacaa gtacactgcg cagccgcatg ccaccctcca 4440

aaggaccaca tagtcaatta cccagcatca cacaccaccc ttggggtcca ggatatatcc 4500

acaacggcaa tgtcttgggt gcagaagatt acgggaggag taggattaat tgttgctgtt 4560

gctgccttaa ttttaattgt ggtgctatgc gtgtcgttta gcaggcacta a 4611

<210> 8

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgctgcgcg gactgtgctg cgtgctgcta ctgtgcggcg ccgtgttcgt gagccccagc 60

caggagatcc acgcccgatt caggagagga gccagaggac gcgtgcagcc caccgagagc 120

atcgtgcgct tccccaacat caccaacctg tgccccttcg gcgaggtgtt caacgccacc 180

cgcttcgcca gcgtgtacgc ctggaaccgc aagcgcatca gcaactgcgt ggccgactac 240

agcgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt gagccccacc 300

aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg tacgccgaca gcttcgtgat ccgcggcgac 360

gaggtgcgcc agatcgcccc cggccagacc ggcaagatcg ccgactacaa ctacaagctg 420

cccgacgact tcaccggctg cgtgatcgcc tggaacagca acaacctgga cagcaaggtg 480

ggcggcaact acaactacct gtaccgcctg ttccgcaaga gcaacctgaa gcccttcgag 540

cgcgacatca gcaccgagat ctaccaggcc ggcagcaccc cctgcaacgg cgtggagggc 600

ttcaactgct acttccccct gcagagctac ggcttccagc ccaccaacgg cgtgggctac 660

cagccctacc gcgtggtggt gctgagcttc gagctgctgc acgcccccgc caccgtgtgc 720

ggccccaaga agagcaccaa cctggtgaag aacaagtgcg tgaacttctg gagccacccc 780

cagttcgaga aggactacaa ggacgacgac gacaagtaa 819

Claims (10)

1.呈递特异蛋白的病毒样颗粒；所述特异蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区段。

2.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于：所述呈递特异蛋白的病毒样颗粒为对基孔肯雅病毒样颗粒进行如下改造得到的：在基孔肯雅病毒的E2蛋白中插入所述特异蛋白。

3.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于：所述呈递特异蛋白的病毒样颗粒是由CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白得到的；所述CHIKV-RBD-Flag1融合蛋白是将基孔肯雅病毒的多聚蛋白改造得到的；所述改造包括：在基孔肯雅病毒的E2蛋白中插入所述特异蛋白。

4.如权利要求2或3所述的病毒样颗粒，其特征在于：所述特异蛋白的插入位置为基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位氨基酸残基和第205位氨基酸残基之间。

5.一种融合蛋白，包括如下：病毒样颗粒的结构蛋白和特异蛋白；所述特异蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区段。

6.编码权利要求5所述融合蛋白的核酸分子或者具有所述核酸分子的重组质粒。

7.制备病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述重组质粒转染哺乳动物细胞，然后进行细胞培养，然后收集病毒样颗粒。

8.权利要求7所述方法制备得到的病毒样颗粒。

9.一种产品，其活性成分为权利要求1或2或3或4或8所述的病毒样颗粒或权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的核酸分子或权利要求6所述的重组质粒；

所述产品的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)作为新型冠状病毒疫苗；

(e2)作为预防和/或治疗新冠肺炎的药物。

10.权利要求1或2或3或4或8所述的病毒样颗粒或权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的核酸分子或权利要求6所述的重组质粒在制备产品中的应用；

所述产品的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)作为新型冠状病毒疫苗；

(e2)作为预防和/或治疗新冠肺炎的药物。

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