CN114853822B - 一种寡聚核苷酸-二硫化物及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种寡聚核苷酸‑二硫化物及其合成方法,属于基因编码化合物库构建领域。本发明寡聚核苷酸‑二硫化物如式I所示。本发明寡聚核苷酸‑二硫化物的合成方法是在碱性条件下,寡聚核苷酸‑硫醇化合物1和硫醇化合物2在溶剂中反应,得到式I所示寡聚核苷酸‑二硫化物。本发明合成寡聚核苷酸‑二硫化物的方法普适性好、操作简单,能高效率地在寡聚核苷酸上合成二硫化物。同时,本发明方法对DNA损伤小,且反应过程中DNA完整性好。本发明丰富了在DNA上合成编码化合物库的化学反应类型,为合成DNA编码化合物库构建了新的二硫化物骨架,为合成多样性的二硫化物提供了一条快捷实用的有效途径,在先导药物开发中具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因编码化合物库构建领域,具体涉及一种寡聚核苷酸-二硫化物及其合成方法。
背景技术
目前,基因编码的化合物库(DELs)已成为发现新的蛋白配体的普遍方法(1.Goodnow,R.A.;Dumelin,C.E.;Keefe,A.D.DNA-encoded chemistry:Enabling thedeeper sampling of chemical space.Nat.Rev.Drug Discov.2016.2.Neri,D.;Lerner,R.A.DNA-Encoded Chemical Libraries:A Selection System Based on EndowingOrganic Compounds with Amplifiable Information.Annu.Rev.Biochem.2018,87,479–502.)。与传统化学相比,通过高通量筛选,DELs在成本、产出以及构建更大的化学空间上,具有很大的优势。据报道,几种新发现的抑制剂可用于治疗许多类别的相关蛋白质靶标(Zimmermann,G.;Neri,D.DNA-encoded chemical libraries:Foundations andapplications in lead discovery.Drug Discov.Today 2016,21,1828–1834.)。其中包括目前正在临床试验中的化学小分子。DELs结合了组合化学和分子生物学技术,在分子水平上给每个化合物加上一个寡聚核苷酸标签,可在较短的时间内得到多达亿级的化合物库。基因编码化学库技术不仅突破了前者的高成本瓶颈,实现了筛选的化合物化学结构空间及数量上的飞跃,并在生物筛选模式上使用了全新的类似于表型筛选(phenotypicscreening)。与传统高通量筛选相比,DELs极大地增加了化合物的数量和多样性。
DELT以其化合物数量、多样性以及对生物目标蛋白的结合方式在众多的活性化合物的发现技术中脱颖而出。DELs在寻找与疾病蛋白相结合的有生物活性的小分子化合物的筛选中应用越来越广泛,并且成为后基因组时代药物快速发现的平台。因此开发出更多能适用于DELs的骨架分子片段的合成方法也是DELT领域的重要工作之一。
二硫化物是指含有二硫键(-S-S-)的有机硫化合物,研究表明多种二硫化物具有很好的生物活性。奥曲肽(Octreotide)是一种二硫化物,属消化系统用药,具有天然生长抑素的药理活性。兰瑞肽(Lanreotide)是一种用于治疗肢端肥大症以及神经内分泌肿瘤引发的综合症的二硫化物结构类药物。它和奥曲肽(Octreotide)类似,是长效生长激素抑制素类似物。氨酸加压素(Vasopressin)是中枢神经系统的一种重要的神经递质。与机体的体液代谢、血容量、心血管功能、体温平衡、学习和记忆、促肾上腺皮质激素的分泌等功能密切相关。去氨加压素(Desmopressin)是目前临床上常用的治疗尿崩症药,是目前最好的血管加压素替代药物。去氨加压素在所有病人中有一较大的优点——可以避免由于血液制品而带来的肝炎和HIV感染的危险性。
可见,很多二硫化物结构的药物具有良好的生物活性。Hyun-Suk Lim等人报道了在固相磁珠上,合成DNA共轭-二硫化物的方法(Kang Ju Lee,Geul Bang,Yong Wook Kim,Min Hyeon Shin,Hyun-Suk Lim,Design and synthesis of a DNA-encodedcombinatorial library of bicyclic peptoids,Bioorganic&Medicinal Chemistry,2021,(48)116423)。但是该反应是分子内反应,对于DELs合成中构建物种多样的二硫化合物具有一定的局限性。另外,因为DELs的构建依赖于DNA的稳定性,DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定(Gironda-Martínez A.;Donckele E.J.;Samain F.et al.DNA-Encoded Chemical Libraries:A ComprehensiveReview with Successful Stories and Future Challenges;ACSPharmacol.Transl.Sci.2021,4,4,1265–1279.),加热、极端pH或者一些有机试剂(如甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等)容易引起DNA变性,导致DNA不稳定;同时DNA对化合物的反应活性会有一定影响,从而影响化学反应的发生;此外,应用于DELs构建的反应需要具有较高的转化率才能使之能够应用于基因编码库。因此,开发出一种对DNA损伤小、高转化率的在DNA上合成二硫化物的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种寡聚核苷酸-二硫化物及其合成方法。本发明一方面可以创造出目前还没有的二硫化物结构的DELs、为将来应用于生物筛选做基础;另一方面可以丰富为数不多的在DNA上合成编码化合物库的有机分子骨架结构,为该技术领域的发展做贡献。
本发明提供了式I所示的寡聚核苷酸-二硫化物:
其中,DNA为单链或双链的核苷酸链;
L1选自无、氢、-(CH2CH2O)a(CH2)b-、-(CH2)c-、-(CH=CH)c-、-(CH2)a(CH=CH)c(CH2)b-、-(C≡C)c-、-(CH2)a(C≡C)c(CH2)b-或-(CH2CH2S)a(CH2)b-;
a为0~12的整数;
b为0~12的整数;
c为1~12的整数;
L2选自无、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C3-C8杂环烷基、芴甲氧羰基氨基、
R2、R3分别独立选自氢、-NHR4、卤素、酯基、酰胺基、C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6烷氧基;
R4选自氨基保护基或C1-C12烷基;
d为0~12的整数;
e为0~12的整数;
n为0~6的整数;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C3-C8杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、卤素、酯基或酰胺基;
所述烷基的取代基为氨基、酯基或杂环芳基;
所述环烷基、杂环烷基、芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素。
进一步地,
DNA为单链或双链的核苷酸链;
L1选自-(CH2CH2O)a(CH2)b-;
a为1、2、3、4、5或6;
b为1、2、3或4;
L2选自无、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基;所述芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;所述杂环芳基中杂原子为O、N或S,所述杂原子个数为1、2或3;
R2、R3分别独立选自氢、-NHR4、卤素、酯基、酰胺基、C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6烷氧基;
R4选自芴甲氧羰基或C1-C12烷基;
n为1、2、3、4、5或6;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或杂环芳基;所述环烷基、芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;所述杂环芳基中杂原子为O、N或S,所述杂原子个数为1、2或3。
进一步地,
L2选自无、取代或未取代的苯基;所述苯基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素。
进一步地,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式II所示:
其中,DNA为单链或双链的核苷酸链;
a为0~12的整数;
L2选自无、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C3-C8杂环烷基、芴甲氧羰基氨基、
R2、R3分别独立选自氢、-NHR4、卤素、酯基、酰胺基、C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6烷氧基;
R4选自氨基保护基或C1-C12烷基;
d为0~12的整数;
e为0~12的整数;
n为0~6的整数;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C3-C8杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、卤素、酯基或酰胺基;
所述烷基的取代基为氨基、酯基或杂环芳基;
所述环烷基、杂环烷基、芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;
优选地,DNA为单链或双链的核苷酸链;
a为1、2、3、4、5或6;
L2选自无、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基;所述芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;所述杂环芳基中杂原子为O、N或S,所述杂原子个数为1、2或3;
R2、R3分别独立选自氢、-NHR4、卤素、酯基、酰胺基、C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6烷氧基;
R4选自芴甲氧羰基或C1-C12烷基;
n为1、2、3、4、5或6;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或杂环芳基;所述环烷基、芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;所述杂环芳基中杂原子为O、N或S,所述杂原子个数为1、2或3;
更优选地,L2选自无、取代或未取代的苯基;所述苯基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素。
进一步地,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式III所示:
其中,DNA为单链或双链的核苷酸链;
L2选自无、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基;所述芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;所述杂环芳基中杂原子为O、N或S,所述杂原子个数为1、2或3;
R2、R3分别独立选自氢、-NHR4、卤素、酯基、酰胺基、C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6烷氧基;
R4选自芴甲氧羰基或C1-C12烷基;
n为1、2、3、4、5或6;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C12烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环芳基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、芳基、杂环芳基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;所述杂环芳基中杂原子为O、N或S,所述杂原子个数为1、2或3;
优选地,L2选自无、取代或未取代的苯基;所述苯基的取代基为C1-C12烷基、C1-C6烷氧基、卤素;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素。
进一步地,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVa所示:
其中,R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素;
或者,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVb所示:
其中,R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素;
或者,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVc所示:
其中,R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素;
或者,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVd所示:
其中,n为1、2、3、4、5或6;
R1选自氢、硝基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的苯基、卤素、酯基或酰胺基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述环烷基、苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素。
进一步地,所述寡聚核苷酸-二硫化物的结构如下所示:
本发明还提供了一种合成前述的寡聚核苷酸-二硫化物的方法,它包括如下步骤:
碱性条件下,寡聚核苷酸-硫醇化合物1和硫醇化合物2在溶剂中反应,即得式I所示寡聚核苷酸-二硫化物;
其中,L1、L2、n和R1如前述所示。
进一步地,所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1、硫醇化合物2和碱的当量比为1:(1~500):(1~100);
优选地,所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1、硫醇化合物2和碱的当量比为1:(10~300):(5~50);
更优选地,所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1、硫醇化合物2和碱的当量比为1:(50~200):10。
硫醇化合物2可选自脂肪硫醇,如等;也可选自芳香硫醇,如 等。
当硫醇化合物2选自脂肪硫醇时,所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1、硫醇化合物2和碱的当量比优选为1:50:10;当硫醇化合物2选自芳香硫醇时,所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1、硫醇化合物2和碱的当量比优选为1:200:10。
进一步地,所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1为如下化合物之一:
进一步地,所述硫醇化合物2为如下化合物之一:
进一步地,
所述碱是N-甲基吗啉、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意几种的混合;
优选地,所述无机盐缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液;所述有机碱缓冲液为三乙基乙酸铵或三羟甲基氨基甲烷;
更优选地,所述碱为1,1,3,3-四甲基胍。
进一步地,
所述溶剂是水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚,乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯中的任意一种或几种的混合;
优选地,所述溶剂是水和四氢呋喃的混合溶剂;
更优选地,所述溶剂是水和四氢呋喃的混合溶剂,且混合溶剂中四氢呋喃的总含量不高于85%。
进一步地,所述反应的温度为0~60℃;和/或,所述反应时间为1~120分钟;
优选地,所述反应的温度为10~40℃;和/或,所述反应时间为5~90分钟;
更优选地,所述反应的温度为25℃;和/或,所述反应时间为10~60分钟。
本发明还提供了前述的寡聚核苷酸-二硫化物在DELs中的应用。
关于本发明的使用术语的定义:除非另有说明,本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语;对于本文没有具体定义的术语,应该根据公开内容和上下文,给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
本发明中所述化合物的结构均是指能够稳定存在的结构。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示,例如,前缀Ca~b烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如,C1~6烷基是指包含1~6个碳原子的直链或支链的烷基;又例如,C3-C8环烷基是指由3~8个碳原子构成的环烷基。
“杂环烷基”指包含一个到多个杂原子的环烷基。这里所指的杂原子包括氧、硫和氮。例如吡咯烷基等。所述杂环烷基可以稠合于环烷基、杂环烷基上。杂环烷基可以是任选取代的或未取代的。
“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团,例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于其它环状基团(包括饱和与不饱和环),但不能含有杂原子如氮,氧,或硫,同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。芳基可以是取代的或未取代的。
“杂环芳基”指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂原子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上,其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。
“酯基”可以是甲酸甲酯基、甲酸乙酯基、乙酸乙酯基等酯基。
“酰胺基”的结构可以是其中,R11可以选自氢、C1~C8烷基等。
“卤素”为氟、氯、溴或碘。
“氨基保护基”主要选自芴甲氧羰基等。
本发明中,“Fmoc”是芴甲氧羰基的缩写。
本发明式I结构式中的寡聚核苷酸是DNA寡聚核苷酸,由正常核苷酸单体聚合制备,和/或由人工修饰的或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链,其中链的长度没有限制。
本发明提供了一种在寡聚核苷酸上合成二硫化物的方法,该方法普适性好、操作简单,能高效率地实现在寡聚核苷酸上合成二硫化物。本发明方法对DNA损伤小,且反应过程中DNA完整性好。
本领域公知的,DNA必须在一定的条件下才能保持稳定;应用于DNA编码化合物库构建的反应需要具有较高的转化率。在本发明的反应条件下,产物寡聚核酸-二硫化物不仅转化率高,而且产物寡聚核苷酸-二硫化物中的DNA完整性好。本发明中得到的寡聚核苷酸-二硫化物产物的完整性不仅可以从液相色谱质谱得到确认,还可以通过进行下一步DNA酶催化偶联反应验证。
本发明丰富了在DNA上合成编码化合物库的化学反应类型,为合成DNA编码化合物库构建了新的二硫化物骨架,为合成多样性的二硫化物提供了一条快捷实用的有效途径,在先导药物开发中具有非常好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为原料HP的结构。
图2为DNA-NHFmoc的液相色谱质谱检测图谱。
图3为DNA-NH2的液相色谱质谱检测图谱。
图4为寡聚核苷酸-二硫化物S4的液相色谱质谱检测图谱。
图5为寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1的液相色谱质谱检测图谱。
图6为寡聚核苷酸-二硫化物S5的液相色谱质谱检测图谱。
图7为寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-2的液相色谱质谱检测图谱。
图8为寡聚核苷酸-二硫化物S6的液相色谱质谱检测图谱。
图9为寡聚核苷酸-二硫化物S7的液相色谱质谱检测图谱。
图10为寡聚核苷酸-二硫化物S8的液相色谱质谱检测图谱。
图11为寡聚核苷酸-二硫化物S9的液相色谱质谱检测图谱。
图12为寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-3的液相色谱质谱检测图谱。
图13为寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-4的液相色谱质谱检测图谱。
图14为寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-5的液相色谱质谱检测图谱。
图15为寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-6的液相色谱质谱检测图谱。
图16为寡聚核苷酸-二硫化物P1的液相色谱质谱检测图谱。
图17为寡聚核苷酸-二硫化物P2的液相色谱质谱检测图谱。
图18为寡聚核苷酸-二硫化物P3的液相色谱质谱检测图谱。
图19为寡聚核苷酸-二硫化物P4的液相色谱质谱检测图谱。
图20为寡聚核苷酸-二硫化物P5的液相色谱质谱检测图谱。
图21为寡聚核苷酸-二硫化物P6的液相色谱质谱检测图谱。
图22为寡聚核苷酸-二硫化物P7的液相色谱质谱检测图谱。
图23为寡聚核苷酸-二硫化物P8的液相色谱质谱检测图谱。
图24为寡聚核苷酸-二硫化物P9的液相色谱质谱检测图谱。
图25为寡聚核苷酸-二硫化物P10的液相色谱质谱检测图谱。
图26为寡聚核苷酸-二硫化物P11的液相色谱质谱检测图谱。
图27为寡聚核苷酸-二硫化物P12的液相色谱质谱检测图谱。
图28为寡聚核苷酸-二硫化物P13的液相色谱质谱检测图谱。
图29为寡聚核苷酸-二硫化物P14的液相色谱质谱检测图谱。
图30为寡聚核苷酸-二硫化物P15的液相色谱质谱检测图谱。
图31为寡聚核苷酸-二硫化物P16的液相色谱质谱检测图谱。
图32为寡聚核苷酸-二硫化物P17的液相色谱质谱检测图谱。
图33为本发明寡聚核苷酸-二硫化物中寡聚核苷酸的完整性验证实验谱图。
图34为SM1核磁共振氢谱检测图谱。
图35为SM2核磁共振氢谱检测图谱。
图36为qPCR产物T-P-HP的扩增曲线。
图37为qPCR产物T-P-P12的扩增曲线。
图38为qPCR产物T-P-P12的标准曲线。
图39为qPCR产物T-P-P12的熔融曲线。
具体实施方式
除另有说明外,本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。本发明说明书中所有的“当量”指摩尔当量。
1.寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1的合成
1.1合成DNA-NHFmoc
将100纳摩尔HP(HP的结构如图1所示,为市售产品)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的溶液(100微升,1当量)。将40当量的起始头片段化合物S1(市售产品)的DMSO溶液(20微升,200毫摩尔/升)、250当量pH=9.5的四硼酸钠(Na2B4O7)缓冲液(100微升,250毫摩尔/升)、40当量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)水溶液(20微升,200毫摩尔/升)混合,将该混合物用涡旋振荡器充分混匀。再将上述混合物加入到HP的溶液中,混合均匀后于4℃下反应1小时。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液。然后,继续加入总体积3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后,在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液,沉淀即为DNA-NHFmoc。余下沉淀用去离子水溶解后得到DNA-NHFmoc的溶液。利用液相色谱质谱联用仪检测DNA-NHFmoc的谱图如图2所示,其分子量为5406。
1.2合成DNA-NH2
将100纳摩尔DNA-NHFmoc溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的DNA-NHFmoc溶液(100微升,1当量),向其中加入10%的哌啶(piperidine)水溶液(56微升,659当量),将两者混合均匀后于室温下反应1小时。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液。然后,继续加入总体积3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后,在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液,沉淀即为DNA-NH2。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-NH2(简写为DNA-NH2)的溶液。利用液相色谱质谱联用仪检测DNA-NH2的谱图如图3所示,其分子量为5184。
1.3寡聚核苷酸-二硫化物(S4)的合成
将100纳摩尔DNA-NH2溶于去离子水配制成1毫摩尔/升浓度的溶液(100微升,1当量),向其中加入200当量亚芴甲氧羰基半胱胺酸(市售,100微升,200毫摩尔/升二甲基亚砜溶液),1200当量N,N-二异丙基乙胺(120微升,1摩尔/升乙腈溶液),1200当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,200微升,600毫摩尔/升二甲基亚砜溶液),200当量1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt,100微升,200毫摩尔/升二甲基亚砜溶液),混合均匀后室温反应2小时(该缩合反应参考文献:Li Y.;Gabriele E.;Samain F.;Favalli N.;Sladojevich F.;Scheuermann.;Optimized Reaction Conditions for Amide BondFormation in DNA Encoded Combinatorial Libraries,Neri D.ACS Comb.Sci.2016,18,8,438-443.)。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液,然后加入总体积3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后,在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液,沉淀即为寡聚核苷酸-二硫化物(S4)。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-二硫化物(S4)水溶液,利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核苷酸-二硫化物(S4)的谱图如图4所示,其分子量为5597。
1.4寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-1)的合成
将100纳摩尔寡聚核苷酸-二硫化物(S4)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升浓度的溶液(100微升,1当量),向其中加入pH=8.0的3-环己胺基丙磺酸(CAPS)缓冲液(100微升,100毫摩尔/升),100当量DL-1,4-二硫苏糖醇(DTT,50微升,200毫摩尔/升乙腈溶液),混合均匀后25℃反应0.5小时(参考文献:Kaori Sakurai;Thomas M.Snyder;and David R.Liu;DNA-Templated Functional Group Transformations Enable Sequence-ProgrammedSynthesis Using Small-Molecule Reagents,J.Am.Chem.Soc.2005,127,1660-1661)。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液和总体积3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后,在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液,沉淀即为寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-1)。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-1)水溶液,该溶液直接用于下一步反应。利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1的谱图如图5所示,其分子量为5509。
2.寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-2的合成
2.1寡聚核苷酸-二硫化物(S5)的合成
将100纳摩尔DNA-NH2溶于去离子水配制成1毫摩尔/升浓度的溶液(100微升,1当量),向其中加入200当量二硫化物SM1(自制,CAS:63684-45-7,100微升,200毫摩尔/升二甲基亚砜溶液),1200当量N,N-二异丙基乙胺(120微升,1摩尔/升乙腈溶液),1200当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,200微升,600毫摩尔/升二甲基亚砜溶液),200当量1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt,100微升,200毫摩尔/升二甲基亚砜溶液),混合均匀后室温反应0.5小时。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液,然后加入总体积3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后,在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液,沉淀即为寡聚核苷酸-二硫化物(S5)。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-二硫化物(S5)水溶液,利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核苷酸-二硫化物S5的谱图如图6所示,其分子量为5500。
2.2寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-2)的合成
将100纳摩尔寡聚核苷酸-二硫化物(S5)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升浓度的溶液(100微升,1当量),向其中加入pH=8.0的3-环己胺基丙磺酸(CAPS)缓冲液(100微升,100毫摩尔/升),100当量DL-1,4-二硫苏糖醇(DTT,50微升,200毫摩尔/升乙腈溶液),混合均匀后25℃反应0.5小时。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液和总体积3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后,在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液,沉淀即为寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-2)。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-2)水溶液,该溶液直接用于下一步反应。利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核苷酸-硫醇化合物(S1-2)的谱图如图7所示,其分子量为5334。
寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-3~S1-6的合成方法同S1-2。首先按照合成S5的方法合成S6~S9(S6~S9的谱图如图8~11所示),再将S6~S9按照S1-2合成方法分别合成S1-3~S1-6(S1-3~S1-6的谱图如图12~15所示)。
制备S5~S9时原料SM1~SM5的具体结构如下(其中SM1,SM2均为自制):
如上SM1,SM2的合成方法均参照文献:Nobuyoshi Niwa,Yusuke Yamagishi,Hiroshi Murakami,Hiroaki Suga,A flexizyme that selectively charges aminoacids activated by a water-friendly leaving group,Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 19(2009)3892-3894合成,SM1,SM2的核磁共振谱图如图34~35所示)。
本发明共合成6个寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1~S1-6,结构如下:
本发明硫醇底物的代表结构式如下(“S”代表反应底物,“M.W.”代表分子量):
实施例1、寡聚核苷酸-二硫化物P1的合成
于1纳摩尔寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1(1毫摩尔/升,1当量,1微升)的水溶液中加入1-丙硫醇S2-1(20毫摩尔/升四氢呋喃溶液,50当量,2.5微升)以及1,1,3,3-四甲基胍(TMG,4毫摩尔/升四氢呋喃溶液,10当量,2.5微升),将该混合物用涡旋振荡充分混匀后25℃反应10分钟。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液及3倍体积的无水乙醇,振荡均匀后,将其置于-80℃的冰箱中冷冻2小时,然后高速冷冻离心(4℃,12000转数/分钟,15分钟),倒掉上清液,沉淀即为寡聚核苷酸-二硫化物P1。余下沉淀用去离子水溶解配制成1毫摩尔/升浓度的寡聚核苷酸-二硫化物P1水溶液。通过液相色谱质谱联用仪进行检测,检测到相应产物分子量(分子量为5583),说明寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1可与1-丙硫醇S2-1在TMG作用下氧化得到寡聚核苷酸-二硫化物P1。通过液相色谱质谱检测得反应转化率为84%,谱图见附图16。
寡聚核苷酸-二硫化物P2~P3,P9~P10,P12~P13,P15~P17的合成方法同P1的合成方法。
实施例2、寡聚核苷酸-二硫化物P4的合成
于1纳摩尔寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1(1毫摩尔/升,1当量,1微升)的水溶液中加入3-甲氧基苯硫酚S2-4(80毫摩尔/升四氢呋喃溶液,200当量,2.5微升)以及1,1,3,3-四甲基胍(TMG,4毫摩尔/升四氢呋喃溶液,10当量,2.5微升),将该混合物用涡旋振荡充分混匀后25℃反应1小时。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液及3倍体积的无水乙醇,振荡均匀后,将其置于-80℃的冰箱中冷冻2小时,然后高速冷冻离心(4℃,12000转数/分钟,15分钟),倒掉上清液,沉淀即为寡聚核苷酸-二硫化物P4。余下沉淀用去离子水溶解配制成1毫摩尔/升浓度的寡聚核苷酸-二硫化物P4水溶液。通过液相色谱质谱联用仪进行检测,检测到相应产物分子量(分子量为5647),说明寡聚核苷酸-硫醇化合物S1-1可与3-甲氧基苯硫酚S2-4在TMG作用下氧化得到寡聚核苷酸-二硫化物P4。通过液相色谱质谱检测得反应转化率为76%,谱图见附图19。
寡聚核苷酸-二硫化物P5~P8,P11,P14的合成方法同P4的合成方法。
本发明产物寡聚核苷酸-二硫化物的代表结构式P1~P17如下(“P”代表反应产物,括号中百分数为液质转化率,“M.W.”代表分子量):
产物P1~P17的液相色谱质谱检测图谱如图16~32所示。
在DELs的合成中,数量庞大的有机小分子试剂为合成大量的目标产物提供了可能。从以上产物的代表结构可以看出,直链硫醇,支链硫醇,芳香硫醇(含邻位、间位、对位取代基),杂环硫醇,均可以很好的参与反应。硫醇试剂无论含吸电子取代基,还是含给电子取代基,产品转化率均比较可观。因此该方法可以很好的应用到DELs的合成中,也体现了该方法的应用范围广,普适性高。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明寡聚核苷酸-二硫化物制备条件的筛选
按照表1所示条件对本发明寡聚核苷酸-二硫化物制备条件进行筛选。在制备条件筛选中,当硫醇为脂肪硫醇时采用实施例1所述方法制备寡聚核苷酸-二硫化物,当硫醇为芳香硫醇时采用实施例2所述方法制备寡聚核苷酸-二硫化物。
表1.本发明寡聚核苷酸-二硫化物的制备条件
由上述筛选条件可知,并非任何条件都可以成功制备寡聚核苷酸-二硫化物:(1)由编号1-3的实验可知碱的种类可以影响寡聚核苷酸-二硫化物的制备过程,其中当碱为TMG反应可以进行,而碱为硼酸缓冲液或NaOH会影响反应发生;(2)由编号3-5的实验可知碱的用量也会影响寡聚核苷酸-二硫化物的制备,其中碱当量为10时最佳;(3)由编号4、6、7的实验以及编号8和9的实验可知硫醇的用量会影响寡聚核苷酸-二硫化物的制备,其中当硫醇为脂肪硫醇时,脂肪硫醇使用50当量较好;当硫醇为芳香硫醇时,脂肪硫醇使用200当量较好。
试验例2、本发明寡聚核苷酸-二硫化物中寡聚核苷酸的完整性验证实验
1)酶链接反应验证
DNA酶催化偶联反应旨在验证DNA的完整性。由于所有化学反应都在DNA头部边链上引导出的位点上发生,而且本发明寡聚核苷酸-二硫化物的化学实验均在相同条件下进行,所以随机挑选一个产物来验证DNA的偶联实验即可证实本发明寡聚核苷酸-二硫化物中所有寡聚核酸的完整性。本发明验证方法具有普适性。
寡聚核苷酸-二硫化物P12与Tag A(短链的寡聚核苷酸,两条链的分子量分别为4064、5884)链接:将1纳摩尔P12溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的溶液(1微升,1当量),向其中加入1.2当量的Tag A(1毫摩尔/升的水溶液,1.2微升),1微升10×T4 DNA链接缓冲溶液以及0.5微升T4 DNA链接酶。然后将上述溶液混合均匀,室温反应1小时。反应结束后,向反应液中加入总体积10%的5摩尔/升氯化钠溶液,然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇,振荡均匀后,将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后在4000rpm的转速下4℃离心半小时,倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后通过液相色谱质谱检测确认产物分子量,分子量为15320,质谱检测结果见图33。
LCMS分析结果表明,寡聚核苷酸-二硫化物P12与Tag A能够成功偶联。这说明按照本申请书中描述的合成方法得到的寡聚核苷酸-二硫化物的DNA链完整性好。再通过LCMS质谱能够精确地显示其分子量,进一步证实其核苷酸没有受到损伤。因此,本发明中的反应方法不会对DNA基本结构和活性造成损坏。
2)实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)验证
通过本发明方法合成的寡聚核苷酸-二硫化物P-P12,与Tag E及reverse primer经酶链接反应得到全长DNA目标片段T-P-P12。T-P-P12通过LCMS质谱能够精确地显示其分子量。之后对T-P-P12进行qPCR实验验证DNA的完整性。
将T-P-P12逐步进行稀释,每次稀释10倍,共稀释8次,通过qPCR实验得到标准曲线。将前7个稀释液用作qPCR的模板,在反应液中分别加入荧光染料试剂盒(SYBR GreenMaster Mix kit,赛默飞),控制最终体积为20微升,使用实时荧光定量仪(Quant studio3)进行扩增。所有样品重复3个平行实验,qPCR循环程序设置为:50℃加热2分钟,95℃热活化10分钟;然后进行40个循环,95℃变性15秒,60℃退火和延伸1分钟。熔融曲线阶段:95℃持续15秒,60℃持续1分钟,95℃持续15秒。
qPCR结果显示,T-P-HP和T-P-P12的连续稀释液均未见明显的CT位移(图36,37),说明本发明的化学反应方法没有造成DNA的损伤。qPCR的熔融曲线中并未观测到多个峰(图39),表明反应后DNA种类没有明显变化。
通过qPCR进一步说明本发明中的反应方法不会对DNA基本结构和活性造成损坏。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
综上,本发明提供了一种在寡聚核苷酸上合成二硫化物的方法,该方法普适性好、操作简单,能高效率地实现在寡聚核苷酸上合成二硫化物。本发明方法对DNA损伤小,且反应过程中DNA完整性好。本发明丰富了在DNA上合成编码化合物库的化学反应类型,为合成DNA编码化合物库构建了新的二硫化物骨架,为合成多样性的二硫化物提供了一条快捷实用的有效途径,在先导药物开发中具有非常好的应用前景。
Claims (10)
1.一种合成寡聚核苷酸-二硫化物的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
碱性条件下,寡聚核苷酸-硫醇化合物1和硫醇化合物2在溶剂中反应,即得式I所示寡聚核苷酸-二硫化物;所述碱为1,1,3,3-四甲基胍;所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1、硫醇化合物2和碱的当量比为1:(50~200):10;
其中,DNA为单链或双链的核苷酸链;
所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVa所示:
其中,R1选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的苯基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素;
或者,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVb所示:
其中,R1选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的苯基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素;
或者,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVc所示:
其中,R1选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的苯基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素;
或者,所述寡聚核苷酸-二硫化物为式IVd所示:
其中,n为1、2、3、4、5或6;R1选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的苯基;所述烷基的取代基为氨基、酯基或呋喃基;所述苯基的取代基为C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述寡聚核苷酸-二硫化物的结构如下所示:
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述寡聚核苷酸-硫醇化合物1为如下化合物之一:
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述硫醇化合物2为如下化合物之一:
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述溶剂是水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚,乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯中的任意一种或几种的混合。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述溶剂是水和四氢呋喃的混合溶剂。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述溶剂是水和四氢呋喃的混合溶剂,且混合溶剂中四氢呋喃的总含量不高于85%。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述反应的温度为0~60℃;和/或,所述反应时间为1~120分钟。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述反应的温度为10~40℃;和/或,所述反应时间为5~90分钟。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述反应的温度为25℃;和/或,所述反应时间为10~60分钟。
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |