CN114847289B - 一种酸性病毒核酸降解消毒方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酸性病毒核酸降解消毒方法，所述方法包括如下步骤：（1）配制酸性核酸降解消毒剂的液体组分，所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸1～30%、十二烷基硫酸钠1～10%、柠檬酸1～10%、甲酸1～10%，其余为水；（2）配制酸性核酸降解消毒剂的固体组分，所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠10～30份、过一硫酸氢钾10～50份、氯化钾5～15份、氯化钠10～30份；（3）将液体组分和固体组分按质量比1:3至3:1混合，待固体组分全部溶解再稀释50～500倍后对待消毒对象消毒，消毒时间为1～60min。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种酸性病毒核酸降解消毒方法。
背景技术
常见的消毒剂往往只能杀灭病原体，而不能有效降解核酸。在荧光定量PCR方法检测病原体的过程中，可能会因为核酸片段的存在而检测出阳性结果，而不能区分活的或者死的病原体，导致出现假阳性结果。据报道，在使用常规消毒方法的情况下，即便对病原体产生了100％的杀灭效果，但死的病原体和核酸仍然存在，采用荧光定量PCR法进行检测时，仍然可检测病原体的核酸片段，将导致对疫病的误判。特别是对于非洲猪瘟等传染病，即使通过消毒剂对养殖场进行了彻底的消杀，病毒被彻底灭活后不具传播风险，但灭活的病毒核酸仍然保留在养殖场环境中，通过荧光定量PCR法对环境进行核酸检测时就可能出现阳性结果。根据《农业农村部关于印发〈非洲猪瘟疫情应急实施方案(第五版)〉的通知》(农牧发〔2021〕7号)的要求，必须满足环境抽样检测非洲猪瘟疫病检测阴性的条件下，养殖场方可恢复生产。如果通过常见消毒剂进行消毒，虽然杀灭病毒但没有对核酸进行彻底降解，将导致假阳性结果，而无法复工复产。
目前的消毒方法分为物理法和化学法两大类。物理法主要有加热、冷冻、辐射、紫外线和微波消毒等方法，化学法是利用各种化学药剂进行消毒。化学消毒法常用的化学消毒剂，常用的消毒剂产品以成分分类主要有9种：含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂、醛类消毒剂、醇类消毒剂、含碘消毒剂、酚类消毒剂、环氧乙烷、双胍类消毒剂和季铵盐类消毒剂等。这几类消毒剂的消毒原理各不相同，有部分可杀灭病毒同时破坏降解核酸但核酸降解不完全，有部分消毒液仅能杀灭病毒和细菌但对核酸的并无明显作用。
现有吉田真一等的中国发明专利，该发明提供以单叠氮乙锭作为有效成分的核酸降解剂。利用的是单叠氮乙锭与核酸结合的特性，而未真正导致核酸的破坏和降解。但采用单叠氮乙锭作为消毒剂，由于单叠氮乙锭本身具有剧毒，存在对水体、动物和植物具有持久性毒性的缺点。
因此，为了解决消毒和核酸检测的矛盾，很有必要开发一种能有效降解核酸的消毒剂，在彻底杀灭病原体的同时，也彻底降解核酸，防止在PCR法核酸检测过程中产生假阳性结果。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种酸性病毒核酸降解消毒方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述酸性病毒核酸降解消毒方法包括如下步骤：
(1)配制酸性核酸降解消毒剂的液体组分，所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸1～30％、十二烷基硫酸钠1～10％、柠檬酸1～10％、甲酸1～10％，其余为水；
(2)配制酸性核酸降解消毒剂的固体组分，所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠10～30份、过一硫酸氢钾10～50份、氯化钾5～15份、氯化钠10～30份；
(3)将液体组分和固体组分按质量比1:3至3:1混合，待固体组分全部溶解再稀释50～500倍后对待消毒对象消毒，消毒时间为1～60min。
优选地，所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸20％、十二烷基硫酸钠3％、柠檬酸3％、甲酸6％，其余为水。
优选地，所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠25份、过一硫酸氢钾45份、氯化钾10份、氯化钠20份。
优选地，步骤(3)中所述液体组分和固体组分按质量比1：1混合。
优选地，步骤(3)中待固体组分全部溶解再稀释100倍。
优选地，步骤(3)中所述消毒时间为≥5min。
上述酸性核酸降解消毒剂的液体组分和固体组分进行二元包装，制备成降解酸性核酸的消毒剂产品。
下面对本发明作进一步说明：
为了在强效快速杀灭病原体前提下，彻底降解病毒核酸，避免干扰后期PCR法核酸检测结果，并在最大程度上保证对人畜和环境友好，以及运输和使用方便，本发明采用液体组分和固体组分二元包装的形式进行配合，稀释后可采用喷洒、喷雾、擦拭和浸泡等方式的消毒。二元包装形式作为本发明的一个创新点，采用固体组分一方面可以有效保存化学物质和保证有效成分的稳定，延长产品的有效期，另一方面可以减少包装的体积，减少运输体积和运输成本。
本发明中，过氧乙酸是一种绿色生态杀菌剂，通过产生活性氧和乙酸发挥其消毒作用，活性氧可以使病原体的酶失活而被灭活，并可以通过挥发到空气中而对环境中的病原体进行灭活。过一硫酸氢钾可以通过产生活性氧和自由羟基而发挥消毒作用。过碳酸钠与过氧乙酸类似，也是通过活性氧进行消毒。需要说明的是，过碳酸钠往往在碱性环境中发挥作用，而在本发明中，过碳酸钠被置于酸性环境使用，主要利用过碳酸钠在酸性环境中产生二氧化碳气体的特点，在用于表面消毒时产生类似“沸腾”和反复搅拌的效果，可以使病原体和核酸从表面脱离并被稀释，与消毒剂充分接触而达到彻底灭活和降解的效果，极大的提高病原体和核酸的灭活和降解效果。
该消毒剂可以对非洲猪瘟阳性养殖场进行彻底的核酸降解，达到农业农村部对恢复生产的要求。本发明适用于粪便样本、血液样本、环境、舍圈、空气、饮水和衣物等消毒，以及消毒池浸泡消毒和带动物消毒，为动物疫病的消毒和核酸降解提供了一种新的解决方案。本发明适用基质包括但不限于全血、皮毛、尿液、粪便、拭子、腹水和痰液等基质，适用病原体包括但不限于H5亚型禽流感病毒HI抗原、圆环病毒2型病毒抗原(PCV2)、猪流行性腹泻病毒病毒(PEDV)、沙门氏菌、犬细小病毒、犬钩端螺旋体和猫传染性腹膜炎(δ冠状病毒)。
总之，本发明所述酸性核酸降解消毒剂采用液体组分和固体组分配合的方式，用于动物疫病病原体的消毒和核酸的降解。不仅灭活了病原体，并彻底降解病原体核酸，减少了荧光定量PCR结果导致假阳性的难题，同时，二元包装的方式，增强了核酸降解效果，便于运输和使用，具有广谱、效果好、速度快和适用于多种病原体消毒的优点。适用于动物疫病阳性场的消毒和核酸降解，为非洲猪瘟等阳性养殖场的恢复生产创造了条件，也为保障农业生产提供了技术支持，还可为新型冠状病毒(COVID-19)的灭活和核酸降解提供了一种可利用的潜在消毒方法，具有很好的经济和社会价值。
附图说明
图1为消毒剂降解核酸的荧光PCR检测结果(消毒剂对应关系从上至下分别为阳性对照、二氯异氰尿酸钠、强效过氧乙酸复合消毒剂、改良的次氯酸钠消毒液、卫可、强克(过硫酸氢钾)、进口酸性发泡剂、自制酸性核酸降解消毒剂)；
图2为酸性核酸降解消毒剂最大稀释度(从上至下分别为500×、400×、300×、200×、100×、80×、40×、20×和10×倍比稀释)；
图3为酸性核酸降解消毒剂反应时间(从上至下分别为：阳性对照，作用1min、2min、3min、4min、5min、10min、20min、30min和1h)；
图4为酸性核酸降解消毒剂对不同基质中病毒降解效果(从上至下分别禽流感尿囊液核酸、δ冠状病毒核酸、以及酸性核酸降解消毒剂作用后δ冠状病毒核酸、禽流感尿囊液核酸和阴性对照)；
图5为酸性核酸降解消毒剂对PCR产物的降解效果(M:DNA Marker)；
图6为酸性核酸降解消毒剂老化实验结果(从上至下分别为：阳性对照、一元包装54℃±2℃放置2周、以及二元包装54℃±2℃放置3周、2周和1周)。
具体实施方式
1实验材料
过氧乙酸(CH3COOOH，CAS号：79-21-0)、十二烷基硫酸钠(C12H25SO4Na，CAS号：151-21-3)、过碳酸钠(2Na2CO3·3H2O2，CAS号：15630-89-4)、过一硫酸氢钾(KHSO5，CAS号：70693-62-8)、氯化钠(CAS号：7647-14-5)、氯化钾(CAS号：7447-40-7)、柠檬酸(CAS号：77-92-9)和甲酸(CAS号：64-18-6)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
自制酸性核酸降解消毒剂18种，由过氧乙酸、十二烷基硫酸钠、柠檬酸、甲酸、过碳酸钠、过一硫酸氢钾、氯化钾和氯化钠等组分配制而成。商品化消毒剂6种，包括二氯异氰尿酸钠、强效过氧乙酸复合消毒剂、改良的次氯酸钠消毒液、卫可、强克(过硫酸氢钾)和进口酸性发泡剂。
AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit和MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit购自Thermo公司(美国)，TaKaRa real time PCR Kit购自宝生物(大连)工程有限公司。H5亚型禽流感病毒HI抗原(AIV-H5-Re8)，购自哈尔滨兽医研究所。PCV2阳性抗凝全血(拷贝数105/μL)、PCV2阴性抗凝全血、PEDV阳性粪便、PEDV阴性粪便、沙门氏菌阳性痰液、犬细小病毒粪便、犬钩端螺旋体阳性尿样和猫传染性腹膜炎(δ冠状病毒)阳性腹水样品均由深圳市质量安全检测研究院保存。
2实验设备
ABI 7500荧光定量PCR仪；KingFisher 96自动化核酸抽提仪；分析天平(Sartorius BS110S)，德国Sartorius公司；微量加样器，美国Thermo公司；酸度计(HANNApH 211型)，意大利HANNA公司；漩涡振荡器(SI-Vortex-Genie 2型)，美国ScientificIndustries公司；低温冷冻大容量离心机(Anke DL-4000B型)，上海安亭科学仪器厂；恒温恒湿箱，上海精宏HWS-250，上海精宏实验设备有限公司。
3消毒剂配制：
在蒸馏水中依次加入过氧乙酸、十二烷基硫酸钠、柠檬酸和甲酸，混匀并充分溶解，室温静止后采用塑料桶包装成为液体组分，密封室温保存。过碳酸钠、过一硫酸氢钾、氯化钾和氯化钠充分混匀后采用塑料封口袋密封，室温保存。
4核酸降解效果检测：
为了筛选可完全降解核酸的消毒剂，对18种自制消毒剂和6种商品消毒剂进行降解病毒核酸性能评价。具体操作如下：按照国家标准《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》(GB/T38502-2020)要求，将各消毒剂稀释至推荐稀释度的5倍，与PCV2阳性抗凝全血按照1:4的比例混合，室温作用10min。然后，将各混合液采用MagMAXTM-96Viral RNA IsolationKit和KingFisher 96自动化核酸抽提仪进行病毒核酸抽提。按照国家标准《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》(GB/T 35901-2018)规定的方法配置荧光PCR反应体系，设置反应程序，通过ABI 7500荧光定量PCR仪进行实时荧光PCR检测。反应条件设置为94℃30s、60℃45s共40个循环进行扩增，在60℃收集荧光。PCV2阳性抗凝全血作为阳性对照，PCV2阴性抗凝全血作为阴性对照。
5效果评价
利用正交试验评价酸性核酸降解消毒剂对核酸的降解效果进行评价。过氧乙酸、十二烷基硫酸钠、柠檬酸、甲酸、过碳酸钠和过一硫酸氢钾分别设置3水平，进行正交试验设计，L18(37)正交试验设计水平表如表1所示，L18(37)正交试验设计表及结果如表2所示。
表1 L18(36)正交试验设计水平表
表2 L18(36)正交试验设计及结果表
通过对正交试验结果进行分析，从极差R值可以看出，对核酸降解作用影响大小为C＝D>A>B>E＝F，即过碳酸钠＝过一硫酸氢钾>过氧乙酸>柠檬酸＝甲酸>十二烷基硫酸钠。从均值k值可以看出有机酸产品最佳结果为A2B3C2D2E3F3。同时从R值可以看出，过碳酸钠和过一硫酸氢钾对核酸降解的影响最大，说明过碳酸钠和过一硫酸氢钾浓度在一定范围内对核酸降解具有良好的作用。综合以上正交结果以及前实验数据得出最佳浓度配比为：过氧乙酸0.2％、十二烷基硫酸钠0.03％、柠檬酸0.03％、甲酸0.06％、过碳酸钠0.25％和过一硫酸氢钾0.45％。
换算成二元包装，液体组分的最佳组合为过氧乙酸20％、十二烷基硫酸钠3％、柠檬酸3％和甲酸6％，其余为水，固体组分的最佳组合为过碳酸钠25％、过一硫酸氢钾45％、氯化钾10％和氯化钠20％。
6酸性核酸降解消毒剂的核酸降解效果评价
6.1酸性核酸降解消毒剂的核酸降解率研究
将5中得到最优配方的自制酸性核酸降解消毒剂和商品化消毒剂与PCV2阳性血液混合，室温下作用10min，提取核酸进行荧光定量PCR检测结果如图1所示。6种商品化消毒剂无核酸降解效果或者降解效果不佳。自制酸性核酸降解消毒剂具有良好核酸降解效果。
6.2酸性核酸降解消毒剂最大稀释度确定
将酸性核酸降解消毒剂按照10×、20×、40×、80×、100×、200×、300×、400×和500×倍比稀释，分别与PCV2阳性全血作用，荧光定量PCR检测结果如图2所示。随着稀释倍数的加大，酸性核酸降解消毒剂消毒液降解核酸的效果逐渐减弱，确定酸性核酸降解消毒剂的最大稀释度为100×。
6.3酸性核酸降解消毒剂最短反应时间研究
将酸性核酸降解消毒剂与PCV2阳性全血混合后，分别作用1min、2min、3min、4min、5min、10min、20min、30min和1h后，经MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit和KingFisher96自动化核酸抽提仪方法来抽提病毒核酸，荧光定量PCR检测结果如图3所示。酸性核酸降解消毒剂消毒液随着作用时间的变长，对核酸的降解效果越好。综合考虑实际操作过程，优选消毒时间为10min。
6.4酸性核酸降解消毒剂对不同病毒和基质的核酸降解效果研究
将酸性核酸降解消毒剂与含有阳性病原体的各种基质进行混合后室温作用10min，荧光定量PCR检测结果如图4所示。酸性核酸降解消毒剂室温作用10min可完全降解尿囊液的禽流感病毒和粪便中的δ冠状病毒核酸，使δ冠状病毒核酸浓度下降约10000倍。
6.5酸性核酸降解消毒剂对核酸的降解效果研究
将PCV2病毒核酸PCR产物与酸性核酸降解消毒剂消毒剂按照1:2比例混合后室温作用10min，琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，酸性核酸降解消毒剂可将PCR产物彻底降解。
6.6酸性核酸降解消毒剂老化试验
酸性核酸降解消毒剂老化实验结果如图6所示。二元酸性核酸降解消毒剂54℃±2℃放置2周(相当于常温放置1年)后，仍然能够有效降解核酸。说明酸性核酸降解消毒剂二元包装基本能够保持稳定，常温放置保存有效期≥1年。
6.7小规模田间试验
酸性核酸降解消毒剂在PEDV病毒阳性场试用结果表明，酸性核酸降解消毒剂喷洒前20份棉拭子均为阳性，Ct值为28.84～38.21。酸性核酸降解消毒剂喷洒1h后再在同样位置进行采样，20份棉拭子均为阴性，表明酸性核酸降解消毒剂的核酸降解消毒效果良好。
Claims (10)
1.一种酸性病毒核酸降解消毒方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）配制酸性核酸降解消毒剂的液体组分，所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸1～30%、十二烷基硫酸钠1～10%、柠檬酸1～10%、甲酸1～10%，其余为水；
（2）配制酸性核酸降解消毒剂的固体组分，所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠10～30份、过一硫酸氢钾10～50份、氯化钾5～15份、氯化钠10～30份；
（3）将液体组分和固体组分按质量比1:3至3:1混合，待固体组分全部溶解再稀释50～500倍后对待消毒对象消毒，消毒时间为1～60min。
2.如权利要求1所述的酸性病毒核酸降解消毒方法，其特征在于，所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸20%、十二烷基硫酸钠3%、柠檬酸3%、甲酸6%，其余为水。
3.如权利要求1所述的酸性病毒核酸降解消毒方法，其特征在于，所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠25份、过一硫酸氢钾45份、氯化钾10份、氯化钠20份。
4.如权利要求1所述的酸性病毒核酸降解消毒方法，其特征在于，步骤（3）中所述液体组分和固体组分按质量比1：1混合。
5.如权利要求1所述的酸性病毒核酸降解消毒方法，其特征在于，步骤（3）中待固体组分全部溶解再稀释100倍。
6.如权利要求1所述的酸性病毒核酸降解消毒方法，其特征在于，步骤（3）中所述消毒时间为≥5min。
7.一种酸性病毒核酸降解消毒剂，其特征在于，所述酸性病毒核酸降解消毒剂包括液体组分和固体组分，所述液体组分和固体组分进行二元包装；所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸1～30%、十二烷基硫酸钠1～10%、柠檬酸1～10%、甲酸1～10%，其余为水；所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠10～30份、过一硫酸氢钾10～50份、氯化钾5～15份、氯化钠10～30份；所述液体组分和固体组分的质量比为1:3至3:1。
8.如权利要求7所述的酸性病毒核酸降解消毒剂，其特征在于，所述液体组分由如下重量百分比的组分组成：过氧乙酸20%、十二烷基硫酸钠3%、柠檬酸3%、甲酸6%，其余为水。
9.如权利要求7所述的酸性病毒核酸降解消毒剂，其特征在于，所述固体组分由如下重量份的组分组成：过碳酸钠25份、过一硫酸氢钾45份、氯化钾10份、氯化钠20份。
10.如权利要求7所述的酸性病毒核酸降解消毒剂，其特征在于，所述液体组分和固体组分的质量比为1:1。
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