JP6243482B2 - 病原性微生物の不活性化方法 - Google Patents
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Description
(以下、本明細書において、「病原性微生物の細胞壁および病原性ウイルスを破壊ないし損傷する」との意味で、「病原性微生物の細胞壁を破壊ないし損傷する」という)
オゾン以外には、過酸化水素なども用いることができるが、とりわけオゾンが好ましい。これらのオゾンや過酸化水素は市販のものを好適に使用することができる。
本発明の不活性化対象ウイルスとして、インフルエンザウイルス、ヒト単純疱疹ウイルス、ネコカリシウイルス(ロタウイルスの代用ウイルス)の3種類のウイルスを用いた。
<ウイルス>
インフルエンザウイルスPR8株を、ニワトリ受精卵(10日卵)の漿尿膜腔に接種し、2日間培養した後、漿尿液を採取し、4℃で3,000rpm10分間遠心分離した上清を30%、60%ショ糖のうえに重層し、25,000rpm90分間遠心分離し、ウイルスを精製した。ヒト単純疱疹ウイルスI型F株(HSV)は、Vero細胞で増殖させた上清を用いた。また、ネコカリシウイルスF9株(FCV)は、CRFK細胞で増殖させた上清を用いた。
インフルエンザウイルスの感染価測定用細胞として、ヒト大腸癌由来CaCo2細胞を
用いた。ネコカリシウイルスの感染価測定用細胞は、ネコ腎臓由来CRFK細胞を用いた。HSVの感染価測定用細胞はミドリザル腎臓由来Vero細胞を用いた。
安定化二酸化塩素(50,000ppm)を最終希釈濃度100ppmとなるように滅菌蒸留水で希釈した。有効塩素濃度10ppmの水溶液990μLにウイルス原液10μLを加え1〜60分間室温で処理した。処理時間経過後、10%(W/V)チオ硫酸ナトリウム10μLを加え反応を停止した後、ウイルスを血清不含のDMEMで希釈し0.1mLずつ4ウェルのそれぞれの感受性細胞に接種し、37℃で60分間吸着させた。吸着後、0.8%アガロースゲルまたはメチルセルロースを含む培養液を加え、48〜96時間培養した。培養48〜96時間培養後にメタノール又は10%ホルマリンでウイルス細胞を固定し、0.1%クリスタルバイオレットを含む20%エタノール液を加え、プラックを算定し、感染価を算出した。
ウイルス10μLに200ppm安定化二酸化塩素50μLを加え、2.2ppmになるようにオゾンを通気したオゾン水940μLを加え1〜5分間処理した。処理時間経過後、10%(W/V)チオ硫酸ナトリウム10μLを加え反応を停止した後、ウイルスを血清不含のDMEMで希釈し0.1mLずつ4ウェルのそれぞれの感受性細胞に接種し、37℃で60分間吸着させた。吸着後、0.8%アガロースゲルまたはメチルセルロースを含む培養液を加え、48〜96時間培養した。培養48〜96時間培養後にメタノール又は10%ホルマリンでウイルス細胞を固定し、0.1%クリスタルバイオレットを含む20%エタノール液を加え、プラックを算定し、感染価を算出した。
結果は、表2に示すとおりであり、インフルエンザウイルス、HSVは、感染価がいずれも5PFU/ml以下で感染価は検出できず、ウイルスを100%不活性化していることが明らかである。またFCVの感染価は16PFU/mlであり、不活性化前の感染価(4.2×106)に比べて99.999%の感染価減衰率を示した。
実施例1のインフルエンザウイルスを用い、オゾン2ppmを含む蒸留水にFBSを最終濃度1.0%となるよう添加し、安定化二酸化塩素を10ppmとなるように添加して、ウイルスを1分間処理してウイルスの不活性化を行った。
結果は、表2に示すとおりである。
実施例1で使用したインフルエンザウイルスを用い、オゾン2ppmを含む蒸留水にFBSを最終濃度1.0%となるよう添加し、ウイルスを加え1分間処理してウイルスの不活性化を行った。
結果は、表2に示すとおりである。なお、上記実施例1、比較例1および比較例2の実験は、北里大学医療衛生学部にて行われたものである。
<供試菌株>
使用菌株としてバチルスズブチリスATCC19659(以下、供試菌株という)を用い、使用培地としてバクトトリプチカーゼソイアガー(TSA)(ディフコ社製)およびティピコソイブロスTSB−BP13(TSB)(レーベンラボラトリー社製)を用いた。
供試菌株の芽胞形成を促進させるための硫酸マンガン5μg/mlを添加したTSA培地に供試菌株を培養し、Rothらの方法(Roth,S.,J.Feichtinger,C.,Hertel.2010,Journal of Applied Microbiology 108,521−532)によって、芽胞菌液を作製した。
菌液は4℃で保存した。
安定化二酸化塩素(インターナショナルジオキシドインク社製)
10mMリン酸緩衝溶液(シグマ社製)
中和剤:10%トゥイーン80、0.1%ヒスチジン、0.5%チオ硫酸ナトリウム /PBS(pH7.4)(シグマ社製)
消泡剤:KM−73E(信越化学社製)
有機物である0.3%ウシアルブミンを含む滅菌蒸留水200mlに終濃度1〜9×106CFU/mlとなるよう芽胞菌液2mlを添加した。そこに終濃度3ppmとなるようにオゾンを供給し、60分間供給を継続した。ついで、終濃度10ppmとなるよう安定化二酸化塩素原液(500ppm)を4ml添加し、20℃にて1分間インキュベートし、その後、さらにオゾンを終濃度3ppmで、60分間供給した。終了後、処理菌液1に対して中和剤9の割合で混和し、二酸化塩素の中和とオゾンの蒸散を促すために、室温にて処理液を10分間放置し、その後生存する菌数を算定した。
芽胞菌の残存の確認は、採取した菌液からPBSにて10倍希釈系列(10−1〜10−4)を作製し、希釈液の各々を100μlずつTSA培地に接種した。37℃、48時間培養後、培地上に発育したコロニー数(CFU)を数えて生存菌数を算出することによって行った。
TSA培地上に発育したコロニーはなく、またTSB培地における指示薬の色の変化ならびに濁りはみられず、前記有機物を含むオゾン処理液中の芽胞菌を100%不活性化することができた。なお、上記実施例2の実験は、名古屋大学医学部保健学科にて行われたものである。
2a,2b 病原性微生物および有機物を含む感染性廃液中のオゾン
Claims (2)
- 病原性ウイルスを含む病原性微生物と有機物とを含有する、医療機関または微生物関連の施設からの感染性廃液に、オゾンを活性酸素として0.5〜20ppmとなるよう加えて前記感染性廃液中に活性酸素を拡散させ、該活性酸素により前記病原性微生物の細胞壁および病原性ウイルスを破壊ないし損傷させた後、二酸化塩素を5〜100ppmとなるよう加えて感染性廃液中に前記二酸化塩素を拡散させ、ついでオゾンを活性酸素として0.5〜20ppmとなるよう加えて感染性廃液中に活性酸素を拡散させて感染性廃液を処理し、前記感染性廃液中の前記病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
- 病原性ウイルスを含む病原性微生物と有機物とを含有する、医療機関または微生物関連の施設からの感染性廃液に、オゾンを加えて活性酸素を前記感染性廃液に拡散させ、該活性酸素により病原性ウイルスを含む病原性微生物の細胞壁および病原性ウイルスを破壊ないし損傷させた後、二酸化塩素を加えて感染性廃液中に前記二酸化塩素を拡散させて、前記感染性廃液中の前記病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法であって、オゾンを活性酸素として0.5〜20ppmの濃度に維持して前記感染性廃液を処理しつつ、二酸化塩素を5〜100ppmとなるよう加え、二酸化塩素添加後もさらに前記オゾンを前記濃度に保って処理することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
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