CN114836526A - 一种靶向测序方法及试剂盒 - Google Patents
一种靶向测序方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种靶向测序方法及试剂盒。本发明通过加入化合物和杂交促进剂使得杂交时间大大缩短,在保持较高的特异性与均一性的基础上,变性时间由传统的10分钟减少为30秒,杂交时间由16小时以上降低至0.5小时,探针富集时间由45分钟缩短至20分钟。
Description
本申请是申请日为2020年08月31日,申请号为CN202010895989.2,发明名称为用于使探针与文库快速杂交的方法和试剂盒的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因测序领域,具体地涉及一种靶向测序方法及试剂盒。
背景技术
高通量测序技术兼备高通量和高准确性优势,正在逐步改变传统临床诊断领域,包括遗传病辅助诊断、肿瘤用药伴随诊断以及病原体检测等方面。在高通量测序技术中,靶向测序技术是应用最广的技术之一,具有准确,经济等多种特点。
靶向测序技术分为三类,包括基于PCR原理的扩增子技术(Amplicon),基于杂交原理的捕获技术(Capture)以及基于杂交、延伸和连接原理的分子倒置探针技术(MIP)。上述方法具有各自的应用场景,Ampliocn受限于覆盖均一性,适用于较小目标区域的靶向测序、而Capture则不受目标区域尺寸的限制,已广泛应用于肿瘤伴随诊断、无创单基因病诊断、病原体检测等领域。
捕获技术也具有一定的局限性,例如操作较为繁琐,实验周期较长。在捕获的传统实验流程中,探针/文库的杂交时间在16小时以上,占捕获流程的50%以上;因此,进一步缩短变性、杂交以及探针富集时间,将从根本上提升捕获技术的时效性,更加贴合临床诊断的需求。
肿瘤的发生是由于一系列基因突变的积累,进而导致细胞中信号通路紊乱,细胞分裂周期出现错误,最终导致细胞恶性增殖。临床需要在诊疗全程根据患者个体的基因突变情况进行药物或疗法的选择,也就是伴随诊断。基于第二代高通量测序的捕获技术已经广泛应用于临床级别的肿瘤基因伴随诊断,并获得了相关部门的批准,但整个检测流程时间仍然较长,因此,优化捕获技术的杂交流程,使之在保持检测性能的同时,能够快速完成检测,对于将来进一步优化肿瘤基因伴随诊断具有现实意义。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明通过加入化合物和杂交促进剂在保持较高的特异性与均一性的基础上,使得杂交时间大大缩短。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一方面,提供一种用于使探针与文库快速杂交的方法,其包括以下步骤:
(1)使探针与文库在杂交缓冲液中接触;
(2)在探针与文库结合形成复合体后,利用经磁珠清洗缓冲液清洗并活化的磁珠经链霉亲和素捕获复合体;
(3)利用清洗液对与链霉亲和素结合的复合体进行清洗;
(4)利用PCR反应富集与探针结合的目标文库,然后纯化,随后进行高通量测序。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,使探针提前加入杂交缓冲液,而不是在文库变性后加入杂交缓冲液。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,所述文库与所述探针的变性温度为92-98℃,例如93、95或97℃,变性时间为30秒至2分钟,例如1分钟,优选2分钟。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,所述探针为5’生物素修饰的单链DNA,其长度为110-130nt,优选为120nt。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,所述杂交缓冲液包括柠檬酸钠缓冲液、0.8-1.2M甜菜碱、0.8-1.2M四甲基氯化铵、4-6%重量/体积比的硫酸葡聚糖、18-44体积%的甲酰胺。优选地,此处的柠檬酸钠缓冲液为1X,甜菜碱为1M,四甲基氯化铵为1M,硫酸葡聚糖的浓度为5%重量/体积比,甲酰胺为20体积%。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,所述探针与所述文库在杂交缓冲液中杂交结合的时间为0.5-4小时,优选为0.5小时。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,步骤(3)中,所述磁珠清洗缓冲液组分包括3M NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA和0.1%Tween-20;且在清洗后,链霉亲和素磁珠仍然保持在磁珠清洗缓冲液中,而无需弃掉磁珠清洗缓冲液。该配方有助于自动化清洗流程的开展。例如,磁珠保持在磁珠清洗缓冲液中时,不易干燥失效;同时,液体状磁珠和更大体积的反应液利于移液工作站的流程设置,工作流程更加稳定。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,所述清洗液包括:清洗液S:1X SSC、0.1%Tween-20;清洗液I:1X SSC、0.1%十二烷基磺酸钠(SDS);清洗液II:0.5X SSC;清洗液III:0.2X SSC。
根据本发明的用于使探针与文库快速杂交的方法,优选地,包括依次以下步骤:
(a)将预文库、接头阻断剂和探针混合,然后蒸干,所述预文库包括适用于MGI测序仪(MGISEQ-2000、MGISEQ-200等)、Illumina测序仪(Nextseq、Miseq和Miniseq等)、Life测序仪(Ion Torrent PGM等)的预文库;
(b)向步骤(a)产物中加入杂交缓冲液,混匀并在室温孵育5分钟,随后95℃变性2分钟,65℃孵育30分钟,此时,所述杂交缓冲液包括1X柠檬酸钠缓冲液(SSC)、2M甜菜碱、1M四甲基氯化铵、5%(w/v)硫酸葡聚糖、20%(v/v)甲酰胺;
(c)杂交完成后,探针与链霉亲和素磁珠结合15分钟,所述链霉亲和素磁珠经磁珠清洗缓冲液清洗两遍,并存在于50μL磁珠清洗缓冲液中;
(d)在65℃条件下,使用65℃的清洗液I清洗步骤(c)的链霉亲和素磁珠清洗一次,清洗条件:吹吸10次或涡旋混匀3秒;
(e)在65℃条件下,使用65℃的清洗液S清洗磁珠两次,清洗条件:涡旋混匀后,65℃孵育5分钟;
(f)使用清洗液I在室温孵育涡旋混匀2分钟以清洗磁珠;
(g)使用清洗液II在室温孵育涡旋混匀1分钟以清洗磁珠;
(h)使用清洗液III在室温孵育涡旋混匀0.5分钟以清洗磁珠;
(i)PCR富集,并纯化文库;
(j)对纯化后的文库进行高通量测序。
本发明的第二方面,提供一种用于使探针与文库快速杂交的试剂盒,所述试剂盒包括如下组分:
组分1:杂交缓冲液;
组分2:磁珠清洗缓冲液;
组分3:清洗液S;
组分4:清洗液I;
组分5:清洗液II;和
组分6:清洗液III。
本发明可用于高通量靶向测序的探针/文库的快速杂交与清洗。通过加入化合物和杂交促进剂,本发明使得杂交时间大大缩短,在保持较高的特异性与均一性的基础上,变性时间由传统的10分钟减少为30秒,杂交时间由16小时以上降低至0.5小时,探针富集时间由45分钟缩短至20分钟,可对EGFR、BRAF、KARS基因相关突变进行准确检测。
附图说明
图1本发明与传统杂交流程比较示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。除非另有说明,否则“%”为基于重量的百分数。
实施例1
本实施例用于研究甜菜碱、四甲基氯化铵的浓度对短时间杂交的影响。
采用DNA建库试剂盒(Rapid DNA Lib Prep Kit,ABclonal)对NA12878 gDNA(Coriell)构建本实施例所用的预文库(插入片段大小:~300bp;PCR循环数:7)。如表1所示,使用不同配方的杂交缓冲液,按照下文所述A-I步骤分别进行0.5小时杂交(N=2)。
表1
A.文库预封闭
A-1.将表2试剂加入到0.2mL低吸附离心管(Eppendorf)中:
表2
A-2.使用真空浓缩仪(Eppendorf)将离心管中溶液蒸干。
B.探针与文库杂交
将13μL杂交缓冲液加入到步骤A-2的干粉中,涡旋混匀,室温孵育5分钟。95℃变性10分钟,随后加入4μL探针(280Kb,3pmol,BOKE),涡旋混匀后,65℃孵育0.5小时。
C.清洗溶液准备
按照表3所示准备各种清洗溶液,其中,清洗液S和部分清洗液I在65℃条件下预热30分钟后使用。
表3
D.链霉亲和素磁珠准备
D-1.将链霉亲和素磁珠从冰箱中(4℃)取出恢复到室温(约30分钟)。
D-2.涡旋混匀15秒。
D-3.取100μL链霉亲和素磁珠加入到新的1.5mL低吸附离心管中。
D-4.将离心管放到磁力架上,直到溶液澄清。
D-5.吸弃上清,切勿扰动磁珠。
D-6.按以下步骤对链霉亲和素磁珠进行清洗:
D-6-1.将离心管从磁力架上取下,加入200μL磁珠清洗缓冲液,涡旋振荡10秒。
D-6-2.将离心管瞬时离心,放到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清,切勿扰动磁珠。
D-7.重复步骤D-6。
D-8.将离心管从磁力架上取下,加入100μL磁珠清洗缓冲液。
D-9.将离心管中的100μL磁珠重悬液转移到新的0.2mL低吸附离心管(Eppendorf)中待用。
D-10.将离心管放到磁力架上,直到溶液澄清。
D-11.吸弃上清,切勿扰动磁珠,立即进行后续实验步骤。
E.探针富集
E-1.将杂交混合物(步骤B-2)加入到含链霉亲和素磁珠(步骤D-11)的0.2mL低吸附离心管中。
E-2.使用移液器轻柔吹吸10次混匀。
E-3.使用PCR仪(热盖温度设置为75℃)65℃孵育45分钟。
E-4.每12分钟涡旋混匀3秒,确保磁珠处于悬浮状态。
F.捕获后清洗
F-1.65℃清洗
F-1-1.将100μL预热的清洗液I加入到含有杂交混合物的0.2mL低吸附离心管中(步骤E-4)。
F-1-2.吹吸混匀后,将含有链霉亲和素磁珠的反应液转移到新的1.5mL低吸附离心管中。
F-1-3.将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-1-4.继续按以下步骤进行清洗:
F-1-4-1.加入200μL预热的清洗液S,吹吸或涡旋混匀后,在65℃条件下孵育5分钟。
F-1-4-2.瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-1-5.重复步骤F-1-4。
F-2.室温清洗
F-2-1.加入200μL清洗液I,涡旋混匀2分钟。
F-2-2.将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-2-3.加入200μL清洗液II,涡旋混匀1分钟。
F-2-4.将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-2-5.加入200μL清洗液III,涡旋混匀30秒。
F-2-6.将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-3.磁珠重悬。
F-3-1.立即加入20μL无酶无菌水。
F-3-2.使用移液器吹吸10次,重悬磁珠,进入后续实验步骤。
G.PCR扩增
G-1.按照表4配置PCR反应体系。
表4
G-2.吹吸或低速涡旋混匀使磁珠保持悬浮状态,立即进入步骤G-3。
G-3.使用PCR仪按表5程序运行,热盖温度105℃。
表5
H.PCR产物纯化
H-1.每个PCR管中加入75μL AMPure XP纯化磁珠(Beckman)。
H-2.按照AMPure XP操作手册纯化PCR产物。
H-3.使用22μL Tris-HCl(10mM,pH 8.5)进行洗脱。
H-4.转移20μL包含捕获文库的洗脱液到新的1.5mL低吸附离心管(Eppendorf)中。
I.文库质控
I-1.使用Qubit荧光计3.0(ThermoFisher)测量文库浓度。
I-2.使用Agilent 2100测量文库片段长度,产物集中在200-600bp之间,无接头二聚。
H.高通量测序
采用Illumina Miniseq测序仪进行PE150模式测序。
数据分析
使用Trimmomatic去除接头以及低质量序列得到clean data,然后使用Samtools提取目标区域的reads,根据比对位置统计中靶率和目标区域平均测序深度,再通过每个目标区域深度与平均深度的比值统计相应目标区域占比得到0.2和0.5x平均深度的目标区域占比(衡量捕获均一性)。
如表6所示,与传统杂交缓冲液相比,通过加入硫酸葡聚糖、甲酰胺,并提高甜菜碱浓度后,中靶率明显提升,但0.2和0.5x平均深度的目标区域占比逐渐减低;再加入四甲基氯化铵后,随着其浓度的升高,中靶率逐渐降低,0.2和0.5x平均深度的目标区域占比逐渐升高。其中,2M甜菜碱和1M四甲基氯化铵能够获得最优的中靶率和均一性。
表6
实施例2
本实施例用于研究探针与文库共变性时间对捕获均一性的影响。
采用实施例1的方法构建预文库,使用终浓度为1X SSC、2M甜菜碱、1.0M四甲基氯化铵、5%(w/v)硫酸葡聚糖、20%(v/v)甲酰胺的杂交反应液进行杂交捕获(N=2),不同之处在于探针加入方式(文库单独变性、探针/文库共变性)和变性时间,实验设计如表7所示。
如表7所示,随着探针/文库共变性时间的延长,其中靶率保持不变,而均一性明显降低。当共变性0.5分钟和2分钟时,采用共变性方式的捕获均一性与文库独立变性的数据相似,无明显差异,而当共变性5和10分钟时,其均一性出现了明显的下降。上述结果表明,探针/文库共变性时间控制在0.5-2分钟时,可以获得与文库独立变性相似的数据表现。
表7
实施例3
本实施例用于研究磁珠清洗缓冲液的保留对于探针富集的影响
采用实施例2中文库变性前加入探针(共变性)的方式对文库进行2min变性,随后进行0.5小时杂交捕获(N=2),不同之处在于采用不同配方的磁珠清洗缓冲液对磁珠进行清洗,并且比较保留(传统方案)和不保留磁珠清洗缓冲液对捕获数据的影响。保留磁珠清洗液方案中,在第二次清洗磁珠后,加入50μL磁珠清洗缓冲液重悬磁珠,随后将17μL杂交反应液加入上述50μL含有磁珠的缓冲液中。其中,传统配方如下:1M NaCl(ThermoFisher)、10mM Tris-HCl pH 7.5(ThermoFisher)、1mM EDTA(ThermoFisher)、0.1%Tween-20(v/v,Sigma)。
如表8所示,保留传统配方的磁珠清洗液进行探针富集时,捕获数据中,中靶率升高约3个百分点,但0.2和0.5x平均深度的目标区域占比分别下降3和4个百分点,影响捕获均一性。当磁珠清洗缓冲液中NaCl浓度逐渐升高后,其均一性明显提升,在3M NaCl时,靶率和均一性达到与不保留磁珠清洗液的传统方案一致的水平。
表8
实施例4
本实施例用于研究探针富集时间对捕获数据的影响。
采用实施例3中文库变性前加入探针(共变性)的方式对文库进行2min变性,随后进行0.5小时杂交捕获(N=2),使用磁珠清洗缓冲液(3M NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mMEDTA、0.1%Tween-20)对磁珠进行清洗并保留磁珠清洗缓冲液进行探针富集,富集时间分别为5min、15min、30min和45分钟。
如表9所示,随着富集时间的减少,捕获数据中冗余度与中靶率逐渐升高,而均一性几乎没有影响。当富集时间在15-45min时,捕获数据各项参数均无明显差异。当富集时间为5min时,冗余度增加至45min富集的7倍左右,测序深度减少30%。
表9
实施例4
本实施例用于研究探针富集时间对捕获数据的影响。
采用已知基因突变频率的DNA标准品(Horizon)和DNA建库试剂盒(Rapid DNALibPrep Kit,ABclonal)构建本实施例所用的预文库(插入片段大小:~300bp;PCR循环数:7)。基因突变信息如表10所示。以实施例1中传统杂交缓冲液及捕获方案作为对照,使用本发明提供的杂交缓冲液、探针与文库共变性以及保留磁珠清洗缓冲液进行探针富集的方法,按照下文所述A-I步骤分别进行0.5小时杂交(N=3)
表10
基因 | 突变 | 频率 |
AKT1 | p.E17K | 1.33% |
BRAF | p.V600E | 2.42% |
EGFR | p.745_750del | 0.91% |
EGFR | p.V769delinsVASV | 1.05% |
PIK3CA | p.E545K | 1.30% |
PIK3CA | p.H1047R | 1.30% |
如表11所示,以实施例1中传统杂交缓冲液及捕获方案作为对照,使用本发明提供的杂交缓冲液、探针与文库共变性以及保留磁珠清洗缓冲液进行探针富集的方法,按照下文所述A-I步骤分别进行0.5小时杂交(N=3)。
表11
A.文库预封闭
A-1.将表12试剂加入到0.2mL低吸附离心管(Eppendorf)中:
表12
A-2.使用真空浓缩仪(Eppendorf)将离心管中溶液蒸干。
B.探针与文库杂交
加入17μL杂交缓冲液(1X SSC、2M甜菜碱、1.0M四甲基氯化铵、5%(w/v)硫酸葡聚糖、20%(v/v)甲酰胺)到步骤A-2的干粉中,涡旋混匀,室温孵育5分钟。随后95℃变性2分钟,65℃孵育0.5小时。
C.清洗液准备
按照表13所示准备清洗溶液,其中,清洗液S和部分清洗液I在65℃条件下预热30分钟后使用。
表13
D.链霉亲和素磁珠准备
D-1.将链霉亲和素磁珠从冰箱中(4℃)取出恢复到室温(约30分钟)。
D-2.涡旋混匀15秒。
D-3.取100μL链霉亲和素磁珠加入到新的1.5mL低吸附离心管中。
D-4.将离心管放到磁力架上,直到溶液澄清。
D-5.吸弃上清,切勿扰动磁珠。
D-6.按以下步骤对链霉亲和素磁珠进行清洗:
D-6-1.将离心管从磁力架上取下,加入200μL磁珠清洗缓冲液,涡旋振荡10秒。
D-6-2.将离心管瞬时离心,放到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清,切勿扰动磁珠。
D-7.重复步骤D-6。
D-8.将离心管从磁力架上取下,加入50μL磁珠清洗缓冲液,待用。
E.探针富集
E-1.将含有链霉亲和素磁珠的50μL缓冲液(步骤D-8)加入杂交反应液(步骤B-2)中。
E-2.使用移液器轻柔吹吸10次混匀。
E-3.使用PCR仪(热盖温度设置为75℃)65℃孵育20分钟。
E-4.每6分钟涡旋混匀3秒,确保磁珠处于悬浮状态。
F.捕获后清洗
F-1.65℃清洗
F-1-1.将100μL预热的清洗液I加入到探针富集反应液中的0.2mL低吸附离心管中(步骤E-4)。
F-1-2.吹吸混匀后,将含有链霉亲和素磁珠的反应液转移到新的1.5mL低吸附离心管中。
F-1-3.将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-1-4.继续按以下步骤进行清洗:
F-1-4-1.加入200μL预热的清洗液S,吹吸或涡旋混匀后,在65℃条件下孵育5分钟。
F-1-4-2.瞬时离心,将离心管放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-1-5.重复步骤F-1-4。
F-2.室温清洗
F-2-1.加入200μL清洗液I,涡旋混匀2分钟。
F-2-2.将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-2-3.加入200μL清洗液II,涡旋混匀1分钟。
F-2-4.将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-2-5.加入200μL清洗液III,涡旋混匀30秒。
F-2-6.将离心管瞬时离心,放置到磁力架上,直到溶液澄清,吸弃上清。
F-3.磁珠重悬
F-3-1.立即加入20μL无酶无菌水。
F-3-2.使用移液器吹吸10次,重悬磁珠,进入后续实验步骤。
G.PCR扩增
G-1.按照表14配置PCR反应体系。
表14
G-2.吹吸或低速涡旋混匀使磁珠保持悬浮状态,立即进入步骤G-3。
G-3.使用PCR仪按表15程序运行,热盖温度105℃。
表15
H.PCR产物纯化
H-1.每个PCR管中加入75μL AMPure XP纯化磁珠(Beckman)。
H-2.按照AMPure XP操作手册纯化PCR产物。
H-3.使用22μL Tris-HCl(10mM,pH 8.5)进行洗脱。
H-4.转移20μL包含捕获文库的洗脱液到新的1.5mL低吸附离心管(Eppendorf)中。
I.文库质控
I-1.使用Qubit荧光计3.0(ThermoFisher)测量文库浓度。
I-2.使用Agilent 2100测量文库片段长度,产物集中在200-600bp之间,无接头二聚。
H.高通量测序
采用Illumina Miniseq测序仪进行PE150模式测序。
数据分析
使用Trimmomatic去除接头以及低质量序列得到clean data,然后使用Samtools提取目标区域的reads,根据比对位置统计中靶率和目标区域平均测序深度,再通过每个目标区域深度与平均深度的比值统计相应目标区域占比得到0.2和0.5x平均深度的目标区域占比。
如表16所示,在相同测序数量下,本发明的中靶率明显超过传统方案近20个百分点,并获得了1000x左右的测序深度,而传统方法只有约600x。此外,在均一性方面,本发明的0.2和0.5x平均深度占比也明显高于传统方法。因此,不论是中靶率还是均一性,本发明均明显优于传统方法。
表16
使用GATK进行质量值校正和局部重比对,使用Freebayes检测变异,annovar进行变异注释后,统计相关基因的突变频率(小于2条Unique阳性Reads判定为未检出-“/”)。如表17所示,采用本发明方案,所有突变位点均检出,且突变频率与预期突变频率偏差小,而传统方案中只有PIK3CA H1047R的三个重复实验全部检出,且其突变频率与预期频率偏差较大。上述结果表明,本发明方案不但能够获得较好的基础捕获数据,同时也具有较高的突变检测准确性。
表17
综上所述,本发明具有以下优势:1)捕获流程时间短,整个杂交、清洗、探针富集和清洗只需要1小时,远远低于传统方法。2)操作简便,探针与文库共变性以及保留磁珠清洗缓冲液,大大简化了操作,更利于自动化工作站操作;3)缓冲液组分成本低。4)数据质量高,特异性、覆盖均一性表现优异;5)基因突变检测准确。随着高通量测序的发展,临床对其也提出了更高的要求,本发明提供的快速杂交方法将大大缩短杂交捕获测序方法的时间,及时提供诊断结果,为患者治疗争取更多的时间。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述,但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.一种用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)使探针与文库在杂交缓冲液中接触;
(2)在探针与文库结合形成复合体后,利用经磁珠清洗缓冲液清洗并活化的磁珠经链霉亲和素捕获复合体;
(3)利用清洗液对与链霉亲和素结合的复合体进行清洗;
(4)利用PCR反应富集与探针结合的目标文库,然后纯化,随后进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,使探针提前加入杂交缓冲液,而不是在文库变性后加入杂交缓冲液。
3.根据权利要求2所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,所述文库与所述探针的变性温度为92-98℃,变性时间为30秒至2分钟。
4.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,所述探针为5’生物素修饰的单链DNA,其长度为110-130nt。
5.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,所述杂交缓冲液包括柠檬酸钠缓冲液、0.8-1.2M甜菜碱、0.8-1.2M四甲基氯化铵、4-6%重量/体积比的硫酸葡聚糖、18-44体积%的甲酰胺。
6.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,所述探针与所述文库在杂交缓冲液中杂交结合的时间为0.5-4小时。
7.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述磁珠清洗缓冲液组分包括3M NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA和0.1%Tween-20;且在清洗后,链霉亲和素磁珠仍然保持在磁珠清洗缓冲液中,而无需弃掉磁珠清洗缓冲液。
8.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,所述清洗液包括:
清洗液S:1X SSC、0.1%Tween-20;
清洗液I:1X SSC、0.1%十二烷基磺酸钠(SDS);
清洗液II:0.5X SSC;
清洗液III:0.2X SSC。
9.根据权利要求1所述的用于使探针与文库快速杂交的方法,其特征在于,包括依次以下步骤:
(a)将预文库、接头阻断剂和探针混合,然后蒸干,所述预文库包括适用于MGI测序仪、Illumina测序仪、Life测序仪的预文库;
(b)向步骤(a)产物中加入杂交缓冲液,混匀并在室温孵育5分钟,随后95℃变性2分钟,65℃孵育30分钟;
(c)杂交完成后,探针与链霉亲和素磁珠结合15分钟,所述链霉亲和素磁珠经磁珠清洗缓冲液清洗两遍,并存在于50μL磁珠清洗缓冲液中;
(d)在65℃条件下,使用65℃的清洗液I清洗步骤(c)的链霉亲和素磁珠清洗一次;
(e)在65℃条件下,使用65℃的清洗液S清洗磁珠两次;
(f)使用清洗液I在室温孵育涡旋混匀2分钟以清洗磁珠;
(g)使用清洗液II在室温孵育涡旋混匀1分钟以清洗磁珠;
(h)使用清洗液III在室温孵育涡旋混匀0.5分钟以清洗磁珠;
(i)PCR富集,并纯化文库;
(j)对纯化后的文库进行高通量测序。
10.一种用于使探针与文库快速杂交的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如下组分:
组分1:杂交缓冲液;
组分2:磁珠清洗缓冲液;
组分3:清洗液S;
组分4:清洗液I;
组分5:清洗液II;和
组分6:清洗液III。
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