CN114836454A - 改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域，本发明将小鹅瘟病毒Cap蛋白N端21‑36位富含精氨酸的肽段删除，删除区域引入一个通用T细胞表位以促进免疫原性，获得改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的氨基酸序。将改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白基因与表达载体连接后转染HEK293细胞，实现小鹅瘟病毒Cap蛋白的高效可溶性表达，表达的蛋白自发组装成病毒样颗粒，可用于小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗、卵黄抗体等产品的开发。

Description

改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
小鹅瘟是由小鹅瘟病毒引起的雏鹅急性败血性传染病。病雏鹅的临诊特点是精神委顿，食欲废绝，严重下痢，有时出现神经症状，死亡率高。因此，小鹅瘟病毒作为一种重要的病原微生物，对我国养鹅业造成巨大危害，亟需开发安全、有效的疫苗、卵黄抗体等预防、治疗制剂。
疫苗、卵黄抗体等生物制剂的产业化开发，需要有合适的免疫原，以及建立其快速、 用新鲜制备的鹅血PBMC细胞成功实现了小鹅瘟病毒的体外分离，病毒滴度达8×107.0拷贝/ml。小鹅瘟病毒分离、培养技术的不成熟严重限制了其生物制剂的开发进度。
小鹅瘟病毒ORFC1基因编码的衣壳蛋白(Cap蛋白)，是病毒唯一的结构蛋白，具有良好的免疫原性 ，常作为基因工程疫苗开发的靶蛋白利用杆状病毒表达系统实现了小鹅瘟病毒Cap蛋白的表达，且表达的蛋白可形成病毒样颗粒，显示了良好的应用前景。但真核系统表达蛋白制备生物制剂，对禽类生物制品产业化应用来说生产成本偏高。
因此，需要提供一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用，以解决上述现有存在的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用，通过小鹅瘟病毒Cap蛋白，成功实现小鹅瘟病毒Cap蛋白的高效可溶性表达，表达的蛋白一方面避开了繁琐的变复性工艺，另一方面可自发组装成病毒样颗粒，显示了良好的应用前景，将小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗、小鹅瘟病毒卵黄抗体用于雏鹅对小鹅瘟病毒强毒的预防或治疗，均取得优异效果。
为解决上述技术问题，本发明提供一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白，包括编码蛋白，所述编码蛋白的核苷酸序列为SEQ No.2。
一种上述的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将小鹅瘟病毒 Cap蛋白N 端富含精氨酸的21-36位肽段用可促进细胞免疫的一种T细胞表位肽段替换，得到改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白，同时在小鹅瘟病毒 Cap蛋白的C端增加6个组氨酸，改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的氨基酸序列为SEQ No.1；
步骤2、利用在线生物软件DNAWorks，将步骤1中改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白进行密码子优化，并获得的核苷酸序列为SEQ No.2的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白；
步骤3、将步骤2中的核苷酸序列SEQ No.2通过全基因合成、载体构建、HEK293细胞悬浮培养、镍柱纯化方法制备，得到病毒样颗粒的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。
进一步的，所述步骤3包括以下步骤：
步骤3.1、将步骤2中的小鹅瘟病毒Cap蛋白核苷酸序列SEQ No.2的两端分别加上Nco I和Hind III酶切位点后进行全基因合成；
步骤3.2、将步骤3.1中全基因合成的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白基因用Nco I和Hind III 双酶切后连入pMT2 载体相应的酶切位点，构建表达载体；
步骤3.3、用CaCl2法将步骤3.2中的表达载体转化入大肠杆菌，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养，选取25个单菌落提取质粒，Nco I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定，将测序验证后的阳性克隆质粒提取后转染HEK293细胞，然后在DMEM培养基中悬浮培养至106时加入0.2～0.5mM IPTG诱导4～9小时，离心取上清，该上清即为病毒样颗粒的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。
进一步的，所述步骤1中小鹅瘟病毒 Cap蛋白N 端富含精氨酸的21-36位肽段的氨基酸序列为SEQ No.3。
进一步的，所述步骤1中T细胞表位肽段的氨基酸序列为SEQ No.4。
一种上述的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白应用于制备小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗和小鹅瘟病毒卵黄抗体。
本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：
本发明的小鹅瘟病毒Cap蛋白N端21-36位富含精氨酸的肽段删除，以促进Cap蛋白的重组表达与正确折叠，同时为了促进小鹅瘟病毒Cap蛋白的免疫原性，删除区域引入一个可促进免疫的通用T细胞表位，最后采用生物软件进行HEK293稀有密码子优化，成功实现小鹅瘟病毒Cap蛋白的高效可溶性表达，表达的蛋白一方面避开了繁琐的变复性工艺，另一方面可自发组装成病毒样颗粒，显示了良好的应用前景；
将改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白应用于小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗和小鹅瘟病毒卵黄抗体，并将小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗和小鹅瘟病毒卵黄抗体用于雏鹅对小鹅瘟病毒强毒的预防或治疗，均取得优异效果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白，包括编码蛋白，所述编码蛋白的核苷酸序列为SEQ No.2，本发明将改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白基因与pMT2 表达载体连接构建重组质粒。 重组质粒转染HEK293细胞，诱导表达后经 SDS-PAGE分析，细胞培养上清中有30kD重组目的蛋白，Western-blot 鉴定显示其可与小鹅瘟病毒阳性血清产生特异性条带，电镜结果表明重组蛋白自发组装成直径20nm的小鹅瘟病毒病毒样颗粒，成功实现小鹅瘟病毒Cap蛋白的高效可溶性表达，表达的蛋白一方面避开了繁琐的变复性工艺，另一方面可自发组装成病毒样颗粒，显示了良好的应用前景。
实施例2：
一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将小鹅瘟病毒Cap蛋白N 端富含精氨酸的21-36位肽段用可促进细胞免疫的一种T细胞表位肽段替换，得到改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白，同时在小鹅瘟病毒 Cap蛋白的C端增加6个组氨酸，改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的氨基酸序列为SEQ No.1，小鹅瘟病毒 Cap蛋白N 端富含精氨酸的21-36位肽段的氨基酸序列为为SEQ No.3。所述步骤1中一种T细胞表位肽段的氨基酸序列为SEQNo.4。
步骤2：利用在线生物软件DNAWorks，将步骤1中改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白进行密码子优化，并获得的核苷酸序列为SEQ No.2的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。
步骤3：将步骤2中的核苷酸序列SEQ No.2通过全基因合成、载体构建、HEK293细胞悬浮培养、镍柱纯化方法制备，得到病毒样颗粒的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。所述步骤3包括以下步骤：步骤3.1将步骤2中的小鹅瘟病毒Cap蛋白核苷酸序列SEQ No.2的两端分别加上 Nco I和Hind III酶切位点后进行全基因合成；步骤3.2：将步骤3.1中全基因合成的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白基因用Nco I和Hind III 双酶切后连入pMT2 载体相应的酶切位点，构建表达载体；步骤3.3：用CaCl2法将步骤3.2中的表达载体转化入大肠杆菌，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养。选取25个单菌落提取质粒，Nco I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆质粒提取后转染HEK293细胞，然后在DMEM培养基中悬浮培养至106时加入0.2～0.5mM IPTG诱导4～9小时，离心取上清，该上清即为病毒样颗粒的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。
检测操作：采用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达，同时设立未诱导细胞作为对照。结果诱导后阳性细胞比对照细胞在30kD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为 25％以上。
将步骤3.3中诱导后的细胞培养液上清跑电泳，用小鹅瘟病毒阳性血清做Westernblot鉴定，结果显示阳性反应。
将步骤3.3中诱导后细胞培养上清滴加到有碳膜的铜网上，自然风干后，滴加2％磷钨酸钠溶液进行负染，负染后进行电镜观察。改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白能够自发组装成病毒样颗粒，直径大小约为20nm。
以上结果证明获得的阳性克隆为小鹅瘟病毒Cap蛋白工程菌。
实施例3：
一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白应用于制备小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗和小鹅瘟病毒卵黄抗体。
小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗的制备与检验：
1毒株
1.1制造用菌种为小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗生产细胞株。
1.2生产用细胞株标准。
1.2.1形态和生化特性。
含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均为葡萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验+，VP-，枸橼酸利用试验。
1.2.2培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。
1.2.3鉴别检验。
1.2.3.1 PCR检测将本菌的LB液体培养物做模板，用以下PCR引物进行PCR扩增，应能扩增出574bp左右的片段。
P1：5-TTGGTTTCTTCGGTTCTC-3′
P2：5-ATGTCGTATTGTGCGTTA-3′
扩增的条件如下：94℃5min变性，94℃30S，50℃30S，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。
1.2.3.2 Western-blot检测将诱导表达的HEK293细胞培养上清液与抗小鹅瘟病毒阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。
1 .2 .4纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。
1 .2 .5保存冻干细胞株，-20℃，保存期为2年。
2疫苗制造及半成品检验：
2.1生产用种子制备。
2.1.1一级种子繁殖和鉴定将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的DMEM液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，然后划线接种于含卡那霉素的DMEM固体培养基上37℃培养16～18小时，作为一级种子。
2.1.2二级种子繁殖在一级种子中选取符合1.2.1项标准的典型菌落 20个混合于少量DMEM培养液中，接种于含卡那霉素的DMEM培养液中，37℃培养8～10小时，进行纯粹检验，应纯粹。
2 .2制苗用培养基为改良DMEM培养基，每1000ml培养基中含胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，葡萄糖5g，MgSO4·7H2O 5g。
2.3制苗用抗原液制备：
2.3.1细胞悬浮培养用培养罐通气培养，按培养罐容积装入适量培养基(70％左右)及消泡剂，灭菌后按培养基量的1～10％接种二级种子菌液，37℃通气培养，待菌液的OD600值达到7.0时，加入2～10g/L的α-乳糖诱导，再继续培养6～8小时。使用20％NaOH调节pH，通过转速关联控制溶氧。当溶氧迅速上升时，流加补料。
2.3.2悬浮培养结束后，离心8000r/min，离心15分钟，收集上清液。
2.3.3镍柱层析纯化常规镍柱纯化，收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得重组蛋白液。
2.3.4灭活将纯化的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，取少量样品进行半成品检验。
2.4半成品检验。
2.4.1蛋白含量检测用BCA法检测上清液蛋白浓度，稀释至终浓度 0 .5mg/ml，无菌过滤，待用。
2.4.2无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
2.4.3内毒素含量检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者方可用于制苗。
2.5疫苗制备。
2.5.1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本80 6份，至温度达到 125～130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。
2.5.2水相制备取灭菌的吐温80 4份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐温80完全溶解。
2.5.3乳化取油相2份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0 .01％。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min 离心15分钟，管底应无水相析出。
2.5.4分装 定量分装，密封瓶口。
3成品检验
3.1物理性状。
外观 为乳白色乳剂；
剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1 滴外，均应不扩散；
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底应无水相析出；
黏度按现行《中国兽药典》进行，符合规定；
装量检查按现行《中国兽药典》进行，符合规定；
3.2无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
3.3安全检验将7日龄健康易感鹅20只平均分为两组，每组10只。第一组腿部肌肉注射本发明制备的疫苗，0 .5ml/只，第二组腿部肌肉注射同体积生理盐水。免疫后21日观察鹅群，结果两组雏鹅均全部健活，无任何不良反应。
3.4甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。
小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗的效力试验
1对照疫苗的制备
参考2020版《中国兽药典》组织灭活苗的制备规程，将小鹅瘟病毒 HN株按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0 .2％，37℃灭活12小时。灭活完全后按实施例2中2.5疫苗制备部分与3成品检验部分的方法制备小鹅瘟病毒组织灭活苗。
2动物效力实验
将7日龄健康易感鹅60只平均分为两组，每组20只。第一组为Cap蛋白疫苗免疫组，用本发明制备的小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗进行腿部肌肉免疫，0.5ml/只。第二组为组织灭活苗组，用制备的小鹅瘟病毒组织灭活苗进行腿部肌肉免疫，0.5ml/只。第三组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫21天后各组腿部肌肉小鹅瘟病毒HN株0.2ml(含 104.0ID50)，攻毒14天后统计免疫保护率(发病只数占总只数的百分率)。
其中发病标准：
1.羽毛营养失调，羽轴出血、毛刺、逐渐消瘦；
2.死亡。以上两者出现之一即判为发病。
结果：Cap蛋白疫苗免疫组疫苗免疫后鹅群免疫保护率为100％，对照疫苗组免疫后鹅群免疫保护率为55％，生理盐水对照组的鹅群发病率为 90％。证明本发明的小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗对鹅群具有良好的临床保护效果，优于小鹅瘟病毒组织灭活苗，可进行临床推广和应用。
表1小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验
组别 攻毒毒株 攻毒剂量（只） 攻毒日龄 攻毒后14天鹅发病数
Cap蛋白疫苗免疫组 小鹅瘟HN株 10<sup>4.0</sup>ID<sub>50</sub> 28日龄 0/20
组织灭活苗组 小鹅瘟HN株 10<sup>4.0</sup>ID<sub>50</sub> 28日龄 9/20
生理盐水对照组 小鹅瘟HN株 10<sup>4.0</sup>ID<sub>50</sub> 28日龄 18/20
小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备与检验
1.蛋鹅免疫
将实施例2制备的小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗免疫蛋鹅，首次免疫每只鹅颈部皮下注射制备的疫苗0.5ml，14天后进行第二次免疫，每只鹅颈部皮下注射制备的疫苗0.5ml，二免后14天进行第三次免疫，每只鹅颈部皮下注射制备的疫苗0.5ml，三免后14天进行加强免疫 ,每只鹅颈部皮下注射制备的疫苗0.5ml，加强免疫之后14天，采集卵黄测定小鹅瘟病毒的琼扩抗体效价，应≥1:64。
2卵黄抗体制造
2.1蛋壳消毒将收集的高免蛋浸入42℃，0 .1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。蛋壳污染严重的，预先选出，单独用消毒水冲洗干净后，再浸泡消毒1次。
2.2打蛋分离卵黄采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
2.3灭活I充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，加入等体积pH值为6.5的灭菌注射用水，搅拌均匀，60～65℃加热灭活30分钟，冷却至室温。
2.4萃取在不锈钢罐中加入原卵黄6倍体积的酸化水(用盐酸将pH 值调为4.2的注射用水)，并降温至4℃，然后将灭活I的卵黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4～8小时，酸化完成后，低温离心分离上清液并转入另一反应罐中。
2.5灭活II在上清液中加入终浓度为0 .2％正辛酸，搅拌均匀，室温放置5～10小时。
2.6过滤用适宜的过滤方法过滤，使其澄清。
2 .7灭活III加入终浓度为0 .05％甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌均匀，室温放置24小时，期间搅拌4～6次。
2.8过滤除菌加入适量氢氧化钠调节pH值约为6 .8～7 .2后，用 0 .22μm微孔滤芯过滤除菌。
2.9无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
2.10琼扩抗体效价测定效价应不低于1:16。
2.11分装将检验合格的半成品无菌定量分装，加盖密封。
3成品检验
3.1物理性状本品为澄清液体，放置48小时后瓶底有少许沉淀。pH 值6.8～7.2。
3.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。
3.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
3.4支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无支原体生长。
3.5外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无外源病毒污染。
3.6安全性实验将7日龄健康易感鹅20只平均分为两组，每组10只。第一组腿部肌肉注射本发明制备的卵黄抗体，1.0ml/只，第二组腿部肌肉注射同体积生理盐水。免疫后21日观察鹅群，应全部健活，无任何不良反应。
小鹅瘟病毒卵黄抗体的效力试验
1对照卵黄抗体的制备
将实施例3制备的对照疫苗参照实施例4的实验步骤免疫蛋鹅并进行卵黄抗体的制备与检验，即为对照卵黄抗体，琼扩抗体效价应不低于1:16。
2动物效力实验
将28日龄健康易感鹅60只平均分为两组，每组20只。第一组为Cap蛋白治疗组，腿部肌肉注射小鹅瘟病毒HN株0.2ml(含104 .0ID50)，24h后肌肉注射本发明制备的小鹅瘟病毒卵黄抗体，0.5ml/只。第二组为对照卵黄抗体治疗组，腿部肌肉注射小鹅瘟病毒HN株0.2ml(含104 .0ID50)，24h后肌肉注射本发明制备的对照卵黄抗体，0.5ml/只。第三组为生理盐水对照组，腿部肌肉小鹅瘟病毒HN株0.2ml(含104 .0ID50)，24h后肌肉注射无菌生理盐水，0.5ml/只。攻毒14天后统计治疗效果。
其中发病标准：
1、羽毛营养失调，羽轴出血、毛刺、逐渐消瘦；
2、死亡。以上两者出现之一即判为发病。
结果：Cap蛋白治疗组治疗后鹅群获得100％保护，对照卵黄抗体治疗组治疗后鹅群获得60％保护，生理盐水对照组的鹅群则80％发病。
证明本发明制备的小鹅瘟病毒卵黄抗体对鹅群的具有良好的临床保护效果，优于小鹅瘟病毒组织灭活苗制备的对照卵黄抗体，可进行临床推广和应用。
表2小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果试验结果
组别 攻毒毒株 攻毒剂量（只） 攻毒日龄 攻毒后14天鹅发病数
Cap蛋白治疗组 小鹅瘟HN株 10<sup>4.0</sup>ID<sub>50</sub> 28日龄 0/20
对照卵黄抗体治疗组 小鹅瘟HN株 10<sup>4.0</sup>ID<sub>50</sub> 28日龄 6/20
生理盐水对照组 小鹅瘟HN株 10<sup>4.0</sup>ID<sub>50</sub> 28日龄 18/20
以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 洛阳沃普森生物工程有限公司
<120> 改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 539
<212> PRT
<213> 改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的氨基酸序列
<400> 1
Ala Cys Asp Glu Phe Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp His
20 25 30
Cys Asp Ser Gln Trp Met Gly Asn Thr Val Ile Thr Lys Thr Thr Arg
35 40 45
Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Ile Tyr Lys Ala Ile Thr
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Gln Asp Ala Thr Val Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro
85 90 95
Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn His Trp Gly Ile Arg Pro Lys
100 105 110
Ser Leu Lys Phe Lys Ile Phe Asn Val Gln Val Lys Glu Val Thr Thr
115 120 125
Gln Asp Gln Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln
130 135 140
Val Phe Thr Asp Asp Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala
145 150 155 160
Thr Glu Gly Thr Met Pro Pro Phe Pro Ser Asp Val Tyr Ala Leu Pro
165 170 175
Gln Tyr Gly Tyr Cys Thr Met His Thr Asn Gln Asn Gly Ala Arg Phe
180 185 190
Asn Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met
195 200 205
Leu Arg Thr Gly Ser Asn Phe Glu Phe Thr Phe Asp Phe Glu Glu Val
210 215 220
Pro Phe His Ser Met Phe Ala His Ser Gln Asp Leu Asp Arg Leu Met
225 230 235 240
Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Trp Asn Phe Asn Glu Val Asp Ser
245 250 255
Ser Arg Lys Ala Gln Phe Lys Lys Ala Val Lys Gly Ala Tyr Gly Thr
260 265 270
Met Gly Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Lys Leu Leu Asp Gln Arg Val
275 280 285
Arg Ala Tyr Thr Gly Gly Thr Asp Asn Tyr Ala Asn Trp Asn Ile Trp
290 295 300
Ser Asn Gly Asn Lys Val Asn Leu Lys Asp Arg Gln Tyr Leu Leu Gln
305 310 315 320
Pro Gly Pro Val Ser Ala Thr His Thr Lys Val Glu Ala Ser Ser Ile
325 330 335
Pro Ala Gln Asn Ile Leu Gly Leu Ala Lys Asp Pro Tyr Arg Ser Gly
340 345 350
Ser Thr Thr Ala Gly Ile Ser Asp Ile Met Val Thr Asp Glu Gln Glu
355 360 365
Val Ala Pro Thr Asn Gly Val Gly Trp Lys Pro Tyr Gly Lys Thr Val
370 375 380
Thr Asn Glu Gln Asn Ser Thr Thr Ala Pro Thr Ser Ser Asp Leu Asp
385 390 395 400
Val Leu Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr
405 410 415
Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Lys Thr Asp Gly Lys Phe
420 425 430
His Pro Ser Pro Asn Leu Gly Gly Phe Gly Leu Tyr Asn Pro Pro Pro
435 440 445
Gln Val Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Val Glu
450 455 460
Tyr Val His Gln Lys Trp Asn Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Ser Ser Gly
465 470 475 480
Gln Cys Thr Val Glu Met Val Trp Glu Leu Arg Lys Glu Asn Ser Lys
485 490 495
Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Ser Asp Arg Thr
500 505 510
Ser Ile Met Phe Ala Pro Asn Glu Thr Gly Gly Tyr Ile Glu Asp Arg
515 520 525
Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Gln Asn Leu
530 535
<210> 2
<211> 1605
<212> DNA
<213> 编码蛋白的核苷酸序列
<400> 2
atggcagagg gaggaggcgg agctttgggc gacgcttcag ggggtgccga tggagtgggt 60
aatgcctcgg gaaattggca ttgcgattcc caatggatgg gaaacacagt catcacaaaa 120
actacccgaa cttgggtctt gccgagctac aataaccaca tctacaaagc aattaccagc 180
ggaacctctc aggacgcaac tgtccagtat gctggataca gtactccctg ggggtacttc 240
gatttcaacc gcttccactg ccacttctcc ccgagagact ggcaaagact tatcaacaac 300
cattggggaa tcagacccaa gtcccttaaa tttaagatct tcaatgtcca agtcaaagaa 360
gtcacaacgc aggatcagac gaagaccatt gcaaacaatc tcacgtcaac gattcaagtg 420
ttcacggatg atgagcatca actcccgtat gtgctgggct cggctacgga aggcaccatg 480
ccgccgttcc cgtcggatgt gtatgccctg ccgcagtacg ggtattgcac aatgcacacc 540
aaccagaacg gtgcacgatt caatgaccgg agtgcattct actgcttaga atacttcccc 600
agtcagatgc taagaacagg cagcaacttt gagttcacgt ttgactttga agaagttcct 660
ttccacagca tgttcgctca ttcacaggac ttagacaggc tgatgaaccc cttagtggat 720
caatacctct ggaatttcaa tgaggtagac agcagcagaa aagctcaatt taaaaaagct 780
gtgaaaggcg cttatggcac catgggccgc aattggctgc caggacctaa actcctggac 840
cagagagtta gggcctatac aggcggaaca gataattatg caaactggaa catctggagt 900
aatggaaaca aggtcaattt gaaggacagg cagtacctct tgcaacccgg acctgtatca 960
gctactcaca caaaagtaga ggcttccagc atcccagccc aaaatatttt aggtttagct 1020
aaagatccat acagatctgg cagcactaca gcaggaataa gtgatattat ggtcacggac 1080
gagcaggaag tagcacctac aaatggcgta gggtggaaac catatggcaa gactgtaacg 1140
aatgaacaaa acagtactac agctcctacg agttcagatc ttgatgttct tggagcttta 1200
ccaggaatgg tttggcagaa cagagatata tatctacagg gacctatttg ggctaaaata 1260
ccaaagaccg atggcaaatt ccatccttct ccgaatctcg gaggatttgg cctgtacaac 1320
ccaccaccac aggtcttcat caagaataca ccggtacctg cagaccctcc ggtagaatac 1380
gtacaccaga agtggaattc ttacataacc cagtattctt cgggccagtg tacagtagag 1440
atggtgtggg agctcagaaa agagaattca aagcggtgga atccagaaat tcagttcacc 1500
agcaatttca gtgacagaac aagcataatg tttgcaccta atgaaactgg tggatacata 1560
gaagatagat tgattggaac cagatatcta actcaaaatc tgtaa 1605
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 富含精氨酸的21-36位肽段的氨基酸序列
<400> 3
Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg Leu Arg Ile Ala Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> T细胞表位肽段的氨基酸序列
<400> 4
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe
1 5 10 15

Claims (6)

1.一种改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白，其特征在于，包括编码蛋白，所述编码蛋白的核苷酸序列为SEQ No.2。
2.一种如权利要求1所述改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将小鹅瘟病毒 Cap蛋白N 端富含精氨酸的21-36位肽段用可促进细胞免疫的一种T细胞表位肽段替换，得到改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白，同时在小鹅瘟病毒 Cap蛋白的C端增加6个组氨酸，改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的氨基酸序列为SEQ No.1；
步骤2、利用在线生物软件DNAWorks，将步骤1中改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白进行密码子优化，并获得的核苷酸序列为SEQ No.2的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白；
步骤3、将步骤2中的核苷酸序列SEQ No.2通过全基因合成、载体构建、HEK293细胞悬浮培养、镍柱纯化方法制备，得到病毒样颗粒的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。
3.根据权利要求2所述的所述改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3包括以下步骤：
步骤3.1、将步骤2中的小鹅瘟病毒Cap蛋白核苷酸序列SEQ No.2的两端分别加上 NcoI和Hind III酶切位点后进行全基因合成；
步骤3.2、将步骤3.1中全基因合成的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白基因用Nco I和HindIII 双酶切后连入pMT2 载体相应的酶切位点，构建表达载体；
步骤3.3、用CaCl2法将步骤3.2中的表达载体转化入大肠杆菌，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养，选取25个单菌落提取质粒，Nco I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定，将测序验证后的阳性克隆质粒提取后转染HEK293细胞，然后在DMEM培养基中悬浮培养至106时加入0.2～0.5mM IPTG诱导4～9小时，离心取上清，该上清即为病毒样颗粒的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白。
4.根据权利要求2所述的所述改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤1中小鹅瘟病毒 Cap蛋白N 端富含精氨酸的21-36位肽段的氨基酸序列为SEQ No.3。
5.根据权利要求2所述的所述改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤1中T细胞表位肽段的氨基酸序列为SEQ No.4。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的改造的小鹅瘟病毒Cap蛋白应用于制备小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗和小鹅瘟病毒卵黄抗体。
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