CN114835624B - 一类2,3-二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状病毒药物组合物 - Google Patents

一类2,3-二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状病毒药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类2,3‑二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状病毒药物组合物，属于医药技术领域。本发明提供的2,3‑二取代吲哚衍生物可以抑制新冠病毒的RNA依赖性RNA聚合酶，对新冠病毒的复制具有明显的抑制活性，且毒性研究显示其具有良好的成药性，表明2,3‑二取代吲哚衍生物在制备抗新冠病毒药物方面具有良好应用前景。实施例结果表明，所述2,3‑二取代吲哚衍生物抗新冠病毒活性好，部分化合物活性优于对照药瑞德西韦，同时所述2,3‑二取代吲哚衍生物可以显著抑制SARS‑CoVGluc中GlucmRNA表达量，说明其是一类新型SARS‑CoV‑2RdRp小分子抑制剂。

Description

一类2,3-二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状 病毒药物组合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一类2,3-二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状病毒药物组合物。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科，是一种正链单链RNAβ-冠状病毒，简称新冠病毒。小分子药物是新冠病毒感染治疗的重要手段。瑞德西韦和羟氯喹最先被FDA批准用于新冠病毒感染的治疗。近期，默克的莫纳匹拉韦、辉瑞的Paxlovid(奈玛特韦/利托那韦片)、礼来的巴瑞替尼、君实生物/旺山旺水的VV116等小分子药物被FDA和/或EUA批准用于新冠病毒感染的治疗。随着全球疫情不断演化，开发新的抗新冠病毒药物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一类2,3-二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状病毒药物组合物，本发明提供的2,3-二取代吲哚衍生物具有良好的抑制新冠病毒复制的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一类2,3-二取代吲哚衍生物，具有式1所示结构：
式1中，n1和n2独立地为1或0；
a为1～5，b为0～5；
R1和R2独立地选自氢、卤素基团、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲基、二氟甲氧基、氰基、硝基、氨基、羟基或苯基。
优选地，所述C1～C6烷基为C1～C6直链烷基或C3～C6支链烷基；所述C1～C6烷氧基为C1～C6直链烷氧基或C3～C6支链烷氧基。
优选地，所述C1～C6直链烷基为甲基或乙基，所述C3～C6支链烷基为异丙基或叔丁基；所述C1～C6直链烷氧基为甲氧基或乙氧基，所述C3～C6支链烷氧基为异丙氧基或叔丁氧基。
优选地，所述卤素基团为-F、-Cl、-Br或-I。
优选地，当所述a为1时，所述R1的取代位点为2-位、3-位或4-位；当所述b为1时，所述R2的取代位点为2-位、3-位或4-位。
本发明提供了上述技术方案所述2,3-二取代吲哚衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将具有式a所示结构的化合物与2-卤代乙酸酯进行第一取代反应，得到具有式b所示结构的化合物；
将所述具有式b所示结构的化合物与具有式c所示结构的化合物在碘催化作用下进行第二取代反应，得到具有式d所示结构的化合物；
将所述具有式d所示结构的化合物在碱性条件下进行水解反应，得到具有式e所示结构的化合物；
将所述具有式e所示结构的化合物与具有式f所示结构的化合物进行偶联反应，得到具有式1所示结构的2,3-二取代吲哚衍生物；
所述n1、n2、a、b、R1和R2如式1中所定义。
优选地，所述2-卤代乙酸酯为2-氯乙酸乙酯、2-溴乙酸乙酯、2-氯乙酸丙酯、2-溴乙酸丙酯、2-氯乙酸丁酯和2-溴乙酸丁酯中的一种或几种。
优选地，所述碱性条件由碱性试剂提供，所述碱性试剂为碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱土金属碳酸盐和碱土金属氢氧化物中的一种或几种。
本发明提供了上述技术方案所述2,3-二取代吲哚衍生物和/或其药学上可接受的盐在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
本发明提供了一种抗新型冠状病毒药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效成分，所述有效成分为上述技术方案所述2,3-二取代吲哚衍生物和/或其药学上可接受的盐。
本发明提供了一类2,3-二取代吲哚衍生物、制备方法及应用和抗新型冠状病毒药物组合物。本发明提供的2,3-二取代吲哚衍生物可以结合于新冠病毒的RNA依赖性RNA聚合酶并抑制其功能，对新冠病毒的复制具有明显的抑制活性，且毒性研究显示其具有良好的成药性，表明2,3-二取代吲哚衍生物在制备抗新冠病毒药物方面具有良好应用前景。实施例结果表明，本发明提供的2,3-二取代吲哚衍生物抗新冠病毒活性EC50为0.57～3.13μM，部分化合物活性优于对照药瑞德西韦，同时本发明提供的2,3-二取代吲哚衍生物在5.00μM与10.00μM的浓度下可以显著抑制SARS-CoVGluc中Gluc mRNA表达量，说明所述2,3-二取代吲哚衍生物是一类新型SARS-CoV-2RdRp小分子抑制剂。
附图说明
图1为式5、式9、式10、式22和式24所示化合物以及瑞德西韦在mRNA水平对SARS-CoV-2RdRp转录活性的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了一类2,3-二取代吲哚衍生物，具有式1所示结构：
式1中，n1和n2独立地为1或0；
a为1～5，b为0～5；
R1和R2独立地选自氢、卤素基团、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲基、二氟甲氧基、氰基、硝基、氨基、羟基或苯基。
在本发明中，所述a为1～5，具体可以为1、2、3、4或5；当所述a为1时，所述R1的取代位点优选为2-位、3-位或4-位；当所述a为2～5时，所述R1的取代位点为2-位至6-位的任意2～5个位点。
在本发明中，所述b为0～5，具体可以为0、1、2、3、4或5；当所述b为0时，即R2不存在；当所述b为1时，所述R2的取代位点优选为2-位、3-位或4-位；当所述b为2～5时，所述R2的取代位点为2-位至6-位的任意2～5个位点。
在本发明中，所述C1～C6烷基优选为C1～C6直链烷基或C3～C6支链烷基；所述C1～C6直链烷基优选为甲基或乙基，所述C3～C6支链烷基优选为异丙基或叔丁基。
在本发明中，所述C1～C6烷氧基优选为C1～C6直链烷氧基或C3～C6支链烷氧基；所述C1～C6直链烷氧基优选为甲氧基或乙氧基，所述C3～C6支链烷氧基优选为异丙氧基或叔丁氧基。
在本发明中，所述卤素基团优选为-F、-Cl、-Br或-I。
在本发明中，所述R1优选为-Cl或乙氧基，所述R2优选为-F、-Cl、甲基、甲氧基、乙氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲基、二氟甲氧基、氰基、硝基、氨基、羟基或苯基，所述R2也可以不存在。
作为本发明的具体实施例，所述2,3-二取代吲哚衍生物为具有式2～式33所示结构的化合物，具体见表1。
表1 2,3-二取代吲哚衍生物的结构
本发明提供了上述技术方案所述2,3-二取代吲哚衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将具有式a所示结构的化合物与2-卤代乙酸酯进行第一取代反应，得到具有式b所示结构的化合物；
将所述具有式b所示结构的化合物与具有式c所示结构的化合物在碘催化作用下进行第二取代反应，得到具有式d所示结构的化合物；
将所述具有式d所示结构的化合物在碱性条件下进行水解反应，得到具有式e所示结构的化合物；
将所述具有式e所示结构的化合物与具有式f所示结构的化合物进行偶联反应，得到具有式1所示结构的2,3-二取代吲哚衍生物；
所述n1、n2、a、b、R1和R2如式1中所定义。
本发明中制备所述2,3-二取代吲哚衍生物的反应式如下所示：
下面结合上述反应式对所述2,3-二取代吲哚衍生物的制备方法进行详细说明，为简化表述方式，具有式a所示结构的化合物记为化合物a，具有式b所示结构的化合物记为化合物b，具有式c所示结构的化合物记为化合物c，具有式d所示结构的化合物记为化合物d，具有式e所示结构的化合物记为化合物e，具有式f所示结构的化合物记为化合物f。另外，在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。
本发明将化合物a与2-卤代乙酸酯进行第一取代反应，得到化合物b。在本发明中，所述2-卤代乙酸酯优选为2-氯乙酸乙酯、2-溴乙酸乙酯、2-氯乙酸丙酯、2-溴乙酸丙酯、2-氯乙酸丁酯和2-溴乙酸丁酯中的一种或几种，更优选为2-氯乙酸乙酯、2-溴乙酸乙酯、2-氯乙酸丙酯、2-溴乙酸丙酯、2-氯乙酸丁酯或2-溴乙酸丁酯。在本发明中，所述化合物a与2-卤代乙酸酯的摩尔比优选为1：(1.3～1.7)，更优选为1：1.5。在本发明中，所述第一取代反应优选在有机溶剂存在条件下进行，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，所述有机溶剂的用量以保证第一取代反应顺利进行为基准。在本发明中，所述第一取代反应优选在缚酸剂存在条件下进行，所述缚酸剂优选为碱金属碳酸盐，所述碱金属碳酸盐优选包括碳酸钾、碳酸钠或碳酸铯，所述化合物a与缚酸剂的摩尔比优选为1：(1.8～2.2)，更优选为1：2。
本发明优选将化合物a、2-卤代乙酸酯、缚酸剂以及有机溶剂混合，进行第一取代反应。在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为20～100℃，更优选为40～60℃；时间优选为10min～4h，更优选为30min～2h；本发明优选采用薄层色谱监测反应进程。所述第一取代反应后，本发明优选将所得产物体系用乙酸乙酯萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后利用无水硫酸钠干燥，过滤后将所得滤液进行柱层析分离，得到化合物b。在本发明中，进行所述柱层析分离时，优选以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为8:1～2:1。
得到化合物b后，本发明将所述化合物b与化合物c在碘催化作用下进行第二取代反应，得到化合物d。在本发明中，所述化合物b与化合物c的摩尔比优选为1：(0.8～1.7)，更优选为1：(1.0～1.5)；本发明以碘单质作为催化剂催化第二取代反应，所述化合物b与碘单质的摩尔比优选为1：(0.08～0.17)，更优选为1：(0.10～0.15)；所述第二取代反应优选在有机溶剂存在条件下进行，所述有机溶剂优选为二甲基亚砜(DMSO)，所述有机溶剂的用量以保证第二取代反应顺利进行为基准。
本发明优选将化合物b、化合物c与碘单质混合，进行第二取代反应。在本发明中，所述第二取代反应的温度优选为0～80℃，更优选为40～60℃；时间优选为15min～4h，更优选为50min～2h。所述第二取代反应后，本发明优选将所得产物体系与乙酸乙酯混合，然后依次用饱和硫代硫酸钠水溶液、水以及饱和食盐水进行洗涤，进行柱层析分离，得到化合物d。在本发明中，进行所述柱层析分离时，优选以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为3:1～2:1。
得到化合物d后，本发明将所述化合物d在碱性条件下进行水解反应，得到化合物e。在本发明中，所述碱性条件为进行水解反应的体系的pH值优选为9～14；所述碱性条件优选由碱性试剂提供，所述碱性试剂优选为碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物和碱土金属氢氧化物中的一种或几种，所述碱金属碳酸盐优选为碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢锂、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的一种或几种，所述碱金属氢氧化物优选为氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种，所述碱土金属氢氧化物优选为氢氧化钙和/或氢氧化镁。在本发明中，所述水解反应优选在有机溶剂和水存在条件下进行，所述有机溶剂优选为乙醇，所述有机溶剂和水的用量以保证水解反应顺利进行为基准。
本发明优选将化合物d、有机溶剂与水混合，然后在冰水浴条件下加入碱性试剂，进行水解反应。在本发明中，所述水解反应的温度优选为0～80℃，更优选为20～40℃，具体可以在室温(25℃)条件下进行；所述水解反应的时间优选为20min～4h，更优选为1～3h；本发明优选采用薄层色谱监测反应进程。所述水解反应后，本发明优选将所得产物体系中有机溶剂蒸除，之后加入水和乙醚进行萃取，将水层用盐酸调节pH值为3～4，然后采用乙酸乙酯进行萃取，有机相采用无水硫酸钠干燥，过滤，将所得滤液中溶剂蒸除，得到化合物e。
得到化合物e后，本发明将所述化合物e与化合物f进行偶联反应，得到具有式1所示结构的2,3-二取代吲哚衍生物。在本发明中，所述化合物e与化合物f的摩尔比优选为1：(1.0～2.5)，更优选为1：(1.2～2.0)。在本发明中，所述偶联反应优选在偶联剂存在条件下进行，所述偶联剂优选为HATU、HBTU、HCTU、TATU、TBTU、DCC、DIC、EDCI、CDI、BOP、PyBOP、PyAOP、PyBrOP、BOP-Cl中的一种或几种，所述化合物e与偶联剂的摩尔比优选为1：(1.3～1.7)，更优选为1：1.5。在本发明中，所述偶联反应优选在有机溶剂存在条件下进行，所述有机溶剂优选为二氯甲烷，所述有机溶剂的用量以保证偶联反应顺利进行为基准。在本发明中，所述偶联反应优选在N,N-二异丙基乙胺存在条件下进行，所述化合物e与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比优选为1：(2.0～2.4)，更优选为1：2.2。
本发明优选将化合物e、化合物f、偶联剂、有机溶剂与N,N-二异丙基乙胺混合，进行偶联反应。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为0～80℃，更优选为20～40℃，具体可以在室温(25℃)条件下进行；所述偶联反应的时间优选为0.5～10h，更优选为0.5～4h。所述偶联反应后，本发明优选将所得产物体系与二氯甲烷混合，依次用浓度为0.1mol/L的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水进行洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后将所得滤液进行减压浓缩，之后进行柱层析分离，得到具有式1所示结构的2,3-二取代吲哚衍生物。在本发明中，进行所述柱层析分离时，优选以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为2:1～1:2。
本发明提供了上述技术方案所述2,3-二取代吲哚衍生物和/或其药学上可接受的盐在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
本发明提供了一种抗新型冠状病毒药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效成分，所述有效成分为上述技术方案所述2,3-二取代吲哚衍生物和/或其药学上可接受的盐。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
N-苄基-2-((3-((2-((3,4-二氯苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-1H-吲哚-2-基)硫代)乙酰胺(记为化合物2)的制备，反应式如下所示：
(1)化合物2b的制备
将化合物2a(1.49g，10mmol，按照文献“Journal ofOrganic Chemistry,2005,volume 70,issue 5,p.1828-1834”的方法制备)、K2CO3(2.76g，20mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10mL)和溴乙酸乙酯(2.51g，15mmol)加入圆底烧瓶中，加热至60℃，保温搅拌反应30min，薄层色谱显示化合物2a反应完全；将所得产物体系自然冷却至室温(25℃)，采用乙酸乙酯萃取(50mL×3次)，合并有机相，经饱和食盐水洗涤后利用无水硫酸钠干燥，过滤后将所得滤液进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为8:1～2:1)，得到化合物2b(2.30g，收率为98％)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.07(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),7.23–7.15(m,1H),7.12–7.05(m,1H),6.67(s,1H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),3.52(s,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ171.7,137.5,128.1,127.3,123.0,120.5,120.2,110.9,109.0,62.1,38.5,14.1。
(2)化合物2d的制备
将化合物2b(2.30g，9.8mmol)溶于二甲基亚砜(DMSO，20mL)中，加入化合物2c(4.96g，14.7mmol，按照文献“European Journal of Medicinal Chemistry，vol 186，15，pp111861”方法制备)和碘单质(0.37g，1.47mmol)，加热至60℃，保温搅拌反应50min；反应完成后将所得产物体系自然冷却至室温，加入乙酸乙酯200mL，然后依次用饱和硫代硫酸钠水溶液、水以及饱和食盐水各100mL进行洗涤，进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为3:1～2:1)，得到化合物2d(3.13g，收率为68％)。
(3)化合物2e的制备
将化合物2d(3.13g，6.7mmol)溶于30mL乙醇中，加入10mL水，冰水浴条件下加入氢氧化钠(0.4g，10mmol)，室温搅拌反应3h，薄层色谱显示化合物2d反应完全；将所得产物体系中乙醇蒸除，之后加入水和乙醚进行萃取，将水层用浓度为1mol/L的盐酸调节pH值为3～4，然后采用乙酸乙酯进行萃取(50mL×3次)，合并有机相并采用无水硫酸钠干燥，过滤，将所得滤液中溶剂蒸除，得到化合物2e(2.90g，收率为95％)。
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.75(s,1H),11.75(s,1H),10.17(s,1H),7.79(d,J＝2.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H),7.38–7.31(m,2H),7.13(t,J＝7.6Hz,1H),7.01(t,J＝7.5Hz,1H),3.83(s,2H),3.43(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.7,168.5,139.5,137.2,135.3,131.3,131.0,130.2,125.1,122.9,120.9,120.5,119.7,118.8,111.8,106.7,41.1,37.1。
(4)化合物2的制备
将化合物2e(220mg，0.5mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入苄胺(64mg，0.6mmol)、HATU(285mg，0.75mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(142mg，1.1mmol)，室温条件下反应30min；向所得产物体系中加入二氯甲烷25mL，依次用浓度为0.1mol/L的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水各25mL进行洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后将所得滤液进行减压浓缩，之后进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1～1:2)，得到化合物2(231mg，收率为87％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.84(s,1H),10.13(s,1H),8.61(t,J＝5.9Hz,1H),7.76(d,J＝2.5Hz,1H),7.50(t,J＝8.2Hz,2H),7.36(d,J＝8.1Hz,1H),7.31(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.20(dt,J＝4.9,2.3Hz,3H),7.16–7.08(m,3H),7.06–6.98(m,1H),4.28(d,J＝5.9Hz,2H),3.75(s,2H),3.40(s,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.7,168.5,139.5,139.2,137.1,135.9,131.3,131.0,128.7,127.6,127.3,125.1,122.8,120.8,120.5,119.7,118.8,111.9,42.9,41.0,38.1。
实施例2
N-4-苯基苄基-2-((3-((2-((2-乙氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-1H-吲哚-2-基)硫代)乙酰胺(记为化合物17)的制备，反应式如下所示：
(1)化合物17d的制备
将化合物2b(235mg，1mmol)溶于2mL的DMSO中，加入碘单质(25mg，0.1mmol)与化合物17c(313mg，1mmol，按照文献“European Journal of Medicinal Chemistry，vol 186，15，pp111861”方法制备)，加热至60℃，保温搅拌反应50min；反应完成后将所得产物体系自然冷却至室温，加入乙酸乙酯30mL，依次用饱和硫代硫酸钠水溶液、水以及饱和食盐水各20mL进行洗涤，进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为3:1～2:1)，得到化合物17d(275mg，收率为62％)。
(2)化合物17e的制备
将化合物17d(275mg，0.62mmol)溶于3mL乙醇中，加入1mL水，冰水浴条件下加入氢氧化钠(0.04g，0.93mmol)，室温搅拌反应3h，薄层色谱显示化合物17d反应完全；将所得产物体系中乙醇蒸除，之后加入水和乙醚进行萃取，将水层用浓度为1mol/L的盐酸调节pH值为3～4，然后采用乙酸乙酯进行萃取(50mL×3次)，合并有机相并采用无水硫酸钠干燥，过滤，将所得滤液中溶剂蒸除，得到化合物17e(248mg，收率为93％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.74(s,1H),11.76(s,1H),9.08(s,1H),7.95(t,J＝6.1Hz,1H),7.56(d,J＝8.1Hz,1H),7.33(t,J＝6.0Hz,1H),7.12(t,J＝7.7Hz,1H),7.01(s,1H),6.99(s,2H),6.88–6.80(m,1H),4.09–3.99(m,2H),3.83(s,2H),3.61(d,J＝3.6Hz,2H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.7,167.8,148.5,137.2,134.8,130.0,127.9,124.5,122.9,120.9,120.7,120.5,118.8,112.4,111.8,107.1,64.4,41.2,37.2,15.0。
(3)化合物17的制备
将化合物17e(208mg，0.5mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入4-苯基苄胺(110mg，0.6mmol)、HATU(285mg，0.75mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(142mg，1.1mmol)，室温条件下反应30min；向所得产物体系中加入二氯甲烷25mL，依次用浓度为0.1mol/L的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水各25mL进行洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后将所得滤液进行减压浓缩，之后进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1～1:2)，得到化合物17(253mg，收率为88％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.84(s,1H),9.15(s,1H),8.61(t,J＝5.9Hz,1H),7.96–7.87(m,1H),7.63–7.56(m,3H),7.50–7.42(m,4H),7.42–7.31(m,2H),7.21–7.10(m,3H),7.09–6.94(m,3H),6.84(ddd,J＝8.6,6.4,2.6Hz,1H),4.31(d,J＝5.8Hz,2H),4.05(q,J＝6.9Hz,2H),3.76(s,2H),3.60(s,2H),1.33(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.6,167.9,148.6,140.4,139.2,138.5,137.2,135.3,130.1,129.4,128.2,127.8,127.8,127.0,124.6,122.9,121.1,120.6,120.5,118.9,112.5,112.0,107.0,64.4,42.6,41.2,38.3,15.0。
实施例3
2,2'-((1H-吲哚-2,3-二基)双(硫烷二基))双(N-(2-乙氧基苯基)乙酰胺)(记为化合物26)的制备，反应式如下所示：
将化合物17e(208mg，0.5mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入2-乙氧基苯胺(137mg，1mmol)、HATU(285mg，0.75mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(142mg，1.1mmol)，室温条件下反应3h；向所得产物体系中加入二氯甲烷25mL，依次用浓度为0.1mol/L的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水各25mL进行洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后将所得滤液进行减压浓缩，之后进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1～1:2)，得到化合物26(139mg，收率为52％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.81(s,1H),9.24(s,1H),9.12(s,1H),7.99–7.90(m,2H),7.57(d,J＝7.9Hz,1H),7.39–7.32(m,1H),7.17–6.96(m,6H),6.91–6.79(m,2H),4.05(q,J＝7.0Hz,4H),3.99(s,2H),3.60(s,2H),1.32(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ167.8,167.2,148.9,148.5,137.2,135.0,130.0,127.8,127.6,125.0,124.5,122.9,121.9,121.0,120.6,120.5,118.8,112.7,112.5,111.9,107.1,64.4(2C),41.2,39.3,15.0(2C)。
实施例4
2,2'-((1H-吲哚-2,3-二基)双(硫烷二基))双(N-(3,4-二氯苯基)乙酰胺)(记为化合物27)的制备，反应式如下所示：
将化合物2e(220mg，0.5mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入3,4-二氯苯胺(162mg，1mmol)、HATU(285mg，0.75mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(142mg，1.1mmol)，室温条件下反应4h；向所得产物体系中加入二氯甲烷25mL，依次用浓度为0.1mol/L的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水各25mL进行洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥、过滤后将所得滤液进行减压浓缩，之后进行柱层析分离(以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1～1:2)，得到化合物27(140mg，收率为48％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.82(s,1H),10.41(s,1H),10.18(s,1H),7.90(d,J＝2.5Hz,1H),7.78(d,J＝2.4Hz,1H),7.56–7.45(m,3H),7.42–7.31(m,3H),7.15(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.03(ddd,J＝8.0,7.1,1.0Hz,1H),3.83(s,2H),3.42(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.4,167.7,139.5,139.2,137.2,134.9,131.5,131.3,131.1,131.0,130.1,125.4,125.1,123.1,120.9,120.8,120.5,119.7,119.6,119.0,112.0,107.7,41.1,39.3。
以下测试例中所用2,3-二取代吲哚衍生物为实施例1～4制备所得或按照实施例1～4方法将相关原料进行简单替换制备所得。
测试例1
1)本测试例利用CoV-RdRp-Gluc报告系统对本发明中2,3-二取代吲哚衍生物进行性能测试，具体是将浓度为2.5×105个/mL的HEK293T细胞悬液，按照每孔2mL接种于96孔板中，待细胞长至80％时，HEK293T细胞组每孔共转染10ng的pCoV-Gluc、200ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp12、600ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp7和600ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp8；转染后4h将培养基换成含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，继续培养12h。将6孔板中的细胞消化后制成细胞悬液，按1.0×104个/mL的HEK293T细胞接种于96孔板，每孔100μL；每孔分别加入1μL浓度为10μM的待测化合物(式1所示2,3-二取代吲哚衍生物)和广谱抗病毒核苷类抑制剂瑞德西韦，接着培养24h进行处理，其中阴性对照组每孔加入1μL二甲基亚砜(DMSO)，最后检测荧光值。实验设置三组平行，并进行统计学分析，数据以DMSO组的值为参比进行百分化处理。实验数据以表示，并用GraphPadPrism 5.0进行作图和统计学分析。其中，抑制率＝(阴性对照组-样品组)/(阴性对照组-阳性对照组)×100％。具体结果参见表2。
2)本测试例采用上述实验步骤，继续对待测化合物进行SARS-CoV-2RdRp活性实验的验证，以检测其抑制的EC50，其中，待测化合物和瑞德西韦的终浓度分别为0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM。实验设置三组平行，每次实验以每组的DMSO组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图和统计学分析，具体结果参见表2。
3)采用CCK-8(CellCountingKit-8)试剂盒对待测化合物的细胞毒作用进行检测，具体是将HEK293T细胞接种于96孔板，每孔2.5×104个细胞，于100μL含10％FBS的DMEM培养液中培养；细胞铺板24h后每孔加入1μL梯度稀释的待测化合物，37℃孵育24h；每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃继续孵育1～2h后，使用Enspire2300多功能酶标仪检测各孔在450nm波长处的光吸收值，用以计算半数细胞毒性浓度CC50(指致使50％细胞死亡的药物浓度)。实验设置三组平行，实验数据以表示，并用GraphPad Prism5.0进行作图和统计学分析，具体结果参见表2。
表2中列出了本发明中部分2,3-二取代吲哚衍生物对新冠病毒的抑制作用和毒性作用数据，其中以阳性对照药物瑞德西韦作为对比例。由表2可知，比于阴性对照组(DMSO组)，本发明提供的2,3-二取代吲哚衍生物对新冠病毒(SARS-CoV-2)均表现出显著抑制作用，部分化合物在细胞水平上活性优于阳性对照药物瑞德西韦。
表2待测化合物的体外抗新冠病毒活性和细胞毒作用数据
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NT：未测试。
测试例2
在mRNA水平检测化合物对SARS-CoV-Gluc的影响可以进一步证实其对SARS-CoV-2RdRp转录活性的影响。本测试例采用qRT-PCR方法检测了式5、式9、式10、式22和式24所示化合物在mRNA水平对SARS-CoV-2RdRp的抑制情况，具体如下：
将浓度为2.5×105个/mL的HEK293T细胞悬液，按照每孔2mL接种于6孔板中，待细胞长至80％时，HEK293T细胞组每孔共转染10ngpCoV-Gluc，200ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp12，600ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp7和600ng真核密码子优化的质粒pCOVID19-nsp8质粒；转染后4h将培养基换成含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，其中一组按照每孔5.00mM或10.00mM的待测化合物各加入2μL，另一组以二甲基亚砜(DMSO)作为阴性对照，同时选用瑞德西韦作为阳性对照，每孔5.00mM或10.00mM的瑞德西韦各加入2μL，继续培养24h。最后将培养基吸掉，每孔加入1mL的Trizol试剂，从Trizol中提取出mRNA之后，利用反转录法获得全基因组cDNA，随后进行qRT PCR检测Gluc mRNA的表达量。本实验利用GAPDH作为内参基因。实验设置三组平行，并进行统计学分析，其中，**P＜0.01，***P＜0.001，具体是以DMSO组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图和统计学分析。实验结果见图1，其中，A～E依次为式9、式10、式5、式22和式24所示化合物在mRNA水平对SARS-CoV-2RdRp转录活性的影响结果图，F为瑞德西韦在mRNA水平对SARS-CoV-2RdRp转录活性的影响结果图。
试验结果显示，式5、式9、式10、式22和式24所示化合物在5.00μM与10.00μM的浓度下可以显著抑制SARS-CoVGluc中Gluc mRNA表达量。结合测试例1的试验结果，本发明分别从不同的方面说明了式1所示2,3-二取代吲哚衍生物是一类新型SARS-CoV-2RdRp小分子抑制剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一类2,3-二取代吲哚衍生物，为以下化合物中的任一种：
2.权利要求1所述2,3-二取代吲哚衍生物和/或其药学上可接受的盐在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
3.一种抗新型冠状病毒药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效成分，所述有效成分为权利要求1所述2,3-二取代吲哚衍生物和/或其药学上可接受的盐。
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2-((1H-indol-3-yl)thio)-N-phenyl-acetamides: SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase inhibitors;Jianyuan Zhao等;《Antiviral Research》;第196卷;第105209/摘要及第3页Scheme1页 *

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