CN114831134B - 一种铂纳米粒子/短肽水凝胶及其制备方法与抗菌应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种铂纳米粒子/短肽水凝胶及其制备方法与抗菌应用,本发明是由N‑芴基甲氧基羰基‑二苯丙氨酸(Fmoc‑FF)二肽与铂纳米粒子(Pt NPs)通过一步共组装得到的铂纳米粒子/短肽水凝胶。本发明提供的铂纳米粒子/短肽水凝胶抗菌材料,制备工艺简单,生物相容性好,在生理条件和低浓度过氧化氢存在时作为类氧化物酶和类过氧化物酶具有高效产生超氧根离子和羟基自由基的能力,与Fmoc‑FF水凝胶本身的粘性和抗菌作用相结合,实现高效协同杀菌,抗菌效果明显优于单一的类酶催化抗菌或者单一肽水凝胶抗菌。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料模拟酶技术领域,具体涉及一种铂纳米粒子/短肽水凝胶及其制 备方法与抗菌应用。
背景技术
细菌感染是世界范围内人类发病率和死亡率高的主要原因之一。虽然抗生素已被广泛 的应用于治疗和预防细菌感染,但由于耐药细菌的出现,开发新的抗菌剂变得越来越重要。 目前一些新型的抗菌材料,如纳米颗粒、聚阳离子聚合物、非抗生素治疗药物(如噬菌体、 抗菌肽和抗菌酶)等,提高了我们治疗抗生素耐药性和复发性感染的能力。
无机纳米材料在抗菌方面具有不产生耐药性、广谱抗菌性、稳定性好等优势。纳米酶 是指具有类似天然酶催化活性的一类纳米材料。纳米酶可作为类过氧化物酶将过氧化氢 (H2O2)转化为有毒的羟基自由基(·OH),或作为类氧化物酶将O2直接转化为有毒的超氧根离子(·O2–)来杀菌。但是,大多数类氧化物酶和类过氧化物酶的最佳活性通常是在酸 性条件下(pH 3.0~5.0),在中性pH值下活性很低,这阻碍了纳米酶在抗菌中的广泛应 用。因此,需要开发能在生理pH条件下发挥最优活性的纳米酶抗菌材料。
抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的天然多肽,是生物体抵抗细菌感染的重要防线。与 传统抗生素不同,抗菌肽通过直接破坏细菌膜的完整性来杀灭细菌;而细菌膜的结构和组 分是细菌进化过程中最保守的部分之一,因此,抗菌肽具有低细菌耐药性。然而,单一的 抗菌肽抗菌仍然存在一些不足,例如抗菌肽对细菌膜的活性具有明显的浓度依赖性,只有 当多肽浓度高于一定的临界值,抗菌肽才能导致细菌死亡,这种高浓度的依赖性使得抗菌 肽杀菌效率低、生物毒性大,极大的限制了其临床应用。另外,目前发现的天然存在的抗 菌肽分子大多数是由L-型氨基酸残基组成,因分子中含有较多的碱性氨基酸残基而易受到 各种蛋白酶的降解,影响了它们的抗菌活性。N-芴基甲氧基羰基-二苯丙氨酸(Fmoc-FF) 二肽相对于其他抗菌多肽可以在生理条件下快速自组装成纤维水凝胶,且苯丙氨酸残基为 两亲性残基,避免了因受到蛋白酶降解而影响抗菌性能。但是,单一使用Fmoc-FF水凝胶 的抗菌性能目前并不令人满意。如果联合使用纳米酶与Fmoc基水凝胶两种类型的抗菌材 料协同作用,可达到优异的抗菌效果。
发明内容
本发明目的:针对上述技术问题,本发明提供了一种铂纳米粒子/短肽水凝胶及其制 备方法与抗菌应用,其解决纳米材料模拟类氧化物酶和类过氧化物酶在生理条件下抗菌活 性不高,抗菌肽抗菌性能不足的问题。
为了实现上述目的,本发明所采用的方案为:
一种铂纳米粒子/短肽水凝胶及其制备方法与抗菌应用,铂纳米粒子/短肽水凝胶是由 N-芴基甲氧基羰基-二苯丙氨酸(Fmoc-FF)与铂纳米粒子(Pt NPs)通过一步共组装得到。 其中,Pt NPs:Fmoc-FF质量分数比为1:20~1:60。
所述的一种铂纳米粒子/短肽水凝胶中Pt NPs由硼氢化钠或者柠檬酸钠还原氯铂酸制得,直 径为5~10nm,。
所述一种铂纳米粒子/短肽水凝胶,包括以下制备步骤:
步骤1:将Fmoc-FF冻干粉溶解在六氟异丙醇(HFIP)中,形成60mg·mL-1~100mg·mL-1储备液。
步骤2:将步骤1中的短肽储备液加入到含量为0.1mg·mL-1~5mg·mL-1Pt NPs水溶液中, 共组装形成铂纳米粒子/短肽水凝胶。
相对于现有技术,本发明具有以下优点:
(1)本发明可通过简单的一步共组装的方式将Pt NPs与Fmoc-FF水凝胶进行复合形成 铂纳米粒子/短肽水凝胶,Pt NPs可均匀的分散在Fmoc-FF水凝胶纤维上,在pH 7.0下具有优异的类氧化物酶和类过氧化物酶催化活性,比单独的Pt NPs类酶催化 活性分别高6倍、26倍。
(2)本发明所涉及的铂纳米粒子/短肽水凝胶在10μmol·L-1低浓度的过氧化氢存在下, 即可产生具有强氧化性的羟基自由基,与通常使用mM级过氧化氢相比,用量明 显减少。
(3)本发明所涉及的铂纳米粒子/短肽水凝胶结合Pt NPs模拟类氧化物酶和类过氧化物 酶活性与Fmoc-FF水凝胶的抗菌能力,协同作用下实现了生理条件下高效抗菌, 抗菌效果明显优于单一的类酶催化抗菌或者单一肽水凝胶抗菌,在细菌感染领域 具有较好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中铂纳米粒子/短肽水凝胶的透射电镜图(A)和X射线光电子能谱图(B)。 (A)图中内插图为倒置铂纳米粒子/短肽水凝胶的光学照片。(B)图中内插图为Pt 4f的XPS光 谱。
图2为实施例1中铂纳米粒子、短肽水凝胶和铂纳米粒子/短肽水凝胶pH 7.0下类氧化 物酶的性能图(A)及在广泛pH(2.2~10.0)范围内的性能图(B)。
图3为实施例1中铂纳米粒子、短肽水凝胶和铂纳米粒子/短肽水凝胶pH 7.0下类过氧 化物酶的性能图(A)及在广泛pH(2.2~10.0)范围内的性能图(B)。
图4为扩散板法评价实施例1中PBS、H2O2、铂纳米粒子、短肽水凝胶、铂纳米粒子/短肽水凝胶、铂纳米粒子+H2O2、短肽水凝胶+H2O2、铂纳米粒子/短肽水凝胶+H2O2对大 肠杆菌E.coli(图(A))和金黄色葡萄球菌S.aureus(图(B))的活力。SEM图像(图(C)) 评价实施例1中8组材料对大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌S.aureus的抗菌效果。
图5为实施例1中铂纳米粒子、短肽水凝胶、铂纳米粒子/短肽水凝胶的生物相容性实 验图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明作出进一步说明,但本发明并不限于以下实施 例。
实施例1
铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备包括如下步骤:
(1)将Fmoc-FF短肽冻干粉溶解在HFIP中,配成浓度为100mg·mL-1的储备液备用。
(2)采用NaBH4还原法合成Pt NPs,4mL 7.7mmol·L-1的H2PtCl6·6H2O溶液中加入51.4mg 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮,分子量30000),然后加入蒸馏水稀释至50mL,在磁力搅拌下 缓慢滴入30mL 15.5mmol·L-1的NaBH4溶液,滴加完毕后继续搅拌2h,反应产物离心干燥得到黑色粉末状PtNPs,PtNPs溶解在去离子水中形成Pt NPs水溶液,浓度为5mg·mL-1。参见图1(A)中左上的内插图,Pt NPs的直径为5.3nm。
(3)将步骤1中的短肽储备液加入蒸馏水,可快速形成短肽水凝胶(Fmoc-FF水凝胶), 其中短肽储备液与蒸馏水的体积比为1:100。Fmoc-FF水凝胶由直径为纳米级,长度为微 米级纤维组成。将步骤1中的短肽储备液加入到步骤2的Pt NPs水溶液中,可快速形成铂纳 米粒子/短肽水凝胶(Pt/Fmoc-FF水凝胶),其中短肽储备液与Pt NPs水溶液的体积比为1: 100。参见图1(A),Pt NPs均匀分散在Fmoc-FF水凝胶纤维上。参见图1(B)的Pt/Fmoc-FF水 凝胶的X射线光电子能谱,显示的C、N、O、Pt的XPS峰,Pt 4f峰(图1(B)的插图)揭 示了Pt物种存在两种化学状态,其中Pt0占主导地位,并且还存在一些二价Pt。
本发明Pt NPs、Fmoc-FF水凝胶和Pt/Fmoc-FF水凝胶类氧化物酶测定:
混合上述实施例1中Pt/Fmoc-FF水凝胶(Pt NPs、Fmoc-FF水凝胶),10mg·mL-1 3,3',5,5 '-四甲基联苯胺(TMB),pH 7.0的10mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(PBS),上述三者体积比为1:1:23,使用紫外-可见分光光度计监测652nm处的吸光度在10min内的变化。在 广泛pH值下Pt NPs、Fmoc-FF水凝胶、Pt/Fmoc-FF水凝胶类氧化物酶测定与上述操作步骤 相似,仅改变缓冲溶液的pH(2.2~10.0),并使用紫外-可见分光光度计监测10min后 652nm处的吸光度。
参见图2(A),在pH 7.0下,600s内没有观察到吸光度的变化,说明单独的Fmoc-FF水凝胶 不能氧化TMB,无类氧化物酶活性;单独的Pt NPs在600s内观察到微弱的吸光度变化, 说明单独的Pt NPs有弱的类氧化物酶活性;Pt/Fmoc-FF水凝胶在600s内观察到强的吸光度 变化,说明本发明构建的Pt/Fmoc-FF水凝胶在pH 7.0时具有优异的类氧化物酶活性。此外, 参见图2(B),Fmoc-FF水凝胶在pH值2.2~10.0的范围内吸光度均很低,表明其具有可忽略 的类氧化物酶活,单独的Pt NPs在pH值2.2~10.0观察到典型的pH依赖的类氧化物酶活性, 观察到在酸性环境(pH 2.2~5.0)中有强的吸光度而在pH 6.0~10.0吸光度明显下降,表 明Pt NPs仅在酸性条件下具有类氧化物酶活。Pt/Fmoc-FF水凝胶,在很宽的pH范围内 (2.2~10.0)具有强的吸光度,表明其在广泛的pH范围内均具有类氧化物酶活,并且在 pH 7.0其氧化TMB的能力是单独的Pt NPs的6倍。
本发明Pt NPs、Fmoc-FF水凝胶和Pt/Fmoc-FF水凝胶类过氧化物酶测定:
混合上述实施例1中Pt/Fmoc-FF水凝胶(PtNPs、Fmoc-FF水凝胶),3%H2O2,10mg·mL-1 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB),pH 7.0的10mmol·L-1PBS缓冲溶液(体积比:1:3:1:20),使用紫外-可见分光光度计监测652nm处的吸光度在10min内的变化。在广泛pH值 下PtNPs、Fmoc-FF水凝胶、Pt/Fmoc-FF水凝胶类过氧化物酶测定与上述操作步骤相似, 仅改变缓冲溶液的pH(2.2~10.0),并使用紫外-可见分光光度计监测10min后652nm处 的吸光度。
参见图3(A),采用本发明实施例1所示的步骤,在pH 7.0下,600s内Pt NPs和Fmoc-FF水凝 胶在H2O2辅助下观察到可忽略的吸光度变化,说明两种材料均不能有效氧化TMB,均表 现出可忽略的类过氧化物酶活;Pt/Fmoc-FF水凝胶在H2O2辅助下在600s内观察到强的吸光度变化,说明本发明构建的Pt/Fmoc-FF水凝胶在pH 7.0下具有优异的类过氧化物酶活性。 此外,参见图3(B),Fmoc-FF水凝胶在pH值2.2~10.0的范围内吸光度很低,表明其具有可 忽略的类过氧化物酶活,单独的Pt NPs在pH值2.2~10.0观察到典型的pH依赖的类氧化酶 样活性,观察到在酸性环境(pH 2.2~5.0)中有强的吸光度而在pH 6.0~10.0吸光度明显 下降,表明Pt NPs仅在酸性条件下具有类过氧化物酶活。Pt/Fmoc-FF水凝胶在很宽的pH范围内(2.2~10.0)具有强的吸光度,表明Pt/Fmoc-FF水凝胶在广泛的pH值(2.2~10.0)下具有类过氧化物酶活性,并且Pt/Fmoc-FF水凝胶氧化TMB的能力是单独的Pt NPs的26倍。本发明中的抗菌实验:
细菌活性实验分为8组:控制组(PBS)、对照组(H2O2、Pt NPs)、单一治疗组(Fmoc-FF水凝胶、Pt NPs+H2O2)、协同治疗组(Pt/Fmoc-FF水凝胶、Fmoc-FF水凝胶+H2O2和 Pt/Fmoc-FF水凝胶+H2O2)。将单克隆大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aurens)分别在Luria-Bertani液体培养基(LB液体培养基)中以转速180rpm在37℃培养12h。然后取菌 液用LB液体培养基按1:100稀释,继续培养2h,待OD600nm达到0.7时,用PBS缓冲液稀释 后的细菌与上述8组在37℃反应2.0h,最终细菌、Pt NPs、Fmoc-FF和H2O2的最终浓度分别 为107CFU·mL-1、25μg·mL-1、2mg·mL-1和10μmol·L-1。然后将上述混合液稀释1000倍, 取100μL悬液铺在固体培养基上培养24h。观察固体培养基上菌落生长情况并进行计数。 以上所有实验均重复3次。参见图4(A)和图4(B),相较控制组,对照组及单一治疗组中Pt NPs+10μmol/L H2O2处理后的细菌的生存力略有下降。另一单一治疗组Fmoc-FF水凝胶处 理后,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率分别显着下降至59%和21%,这是由于Fmoc- FF水凝胶引发氧化和渗透压力的上调,从而导致细菌死亡。此外,对金黄色葡萄球菌的 更好杀菌性能主要归因于表面电荷和细胞壁结构的差异。协同治疗组Fmoc-FF水凝胶+10 μmol/L H2O2处理后,由于H2O2和Fmoc-FF的协同抗菌作用,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 的相对细菌活力分别降低至36%和15%;协同治疗组Pt/Fmoc-FF水凝胶处理后,大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌的相对活性分别降低至17%和13%。协同治疗组Pt/Fmoc-FF+10 μmol/L H2O2水凝胶的杀菌能力进一步提高,由于Fmoc-FF水凝胶自身的抗菌能力以及 Pt/Fmoc-FF水凝胶的氧化酶和过氧化物酶样活性,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的相对活性 分别下降至5%和1%。本发明中铂纳米粒子/短肽水凝胶与细菌作用后的形态,可通过扫描 电镜观察。参见图4(C),对照组10μmol/L H2O2、Pt NPs和单一治疗组Pt NPs+10μmol/L H2O2对两种革兰氏菌基本无治疗效果,另一单一治疗组中的Fmoc-FF水凝胶组观察到 Fmoc-FF水凝胶可与细菌有紧密的接触,虽然也能观察到细菌表面的破损,但破损程度远 不及协同治疗Pt/Fmoc-FF水凝胶+10μmol/L H2O2。在协同抗菌治疗组Pt/Fmoc-FF水凝胶 +10μmol/L H2O2中观察到与细菌有紧密的接触,细菌还出现了明显的皱褶,细菌表面具 有明显的空腔和破损。
本发明中的细胞毒性实验:
使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)进行细胞活力测试。将对数期生长的细胞以1×104cell well-1的密度接种到96孔细胞培养板中。每组设置五个重复孔。24h后,将含有不同浓度的 Pt NPs、Fmoc-FF水凝胶和Pt/Fmoc-FF水凝胶加入到细胞培养液中。细胞在37℃下再生长 24h后,向培养物中加入CCK-8溶液。其中材料(不同浓度的Pt NPs、Fmoc-FF水凝胶和 Pt/Fmoc-FF水凝胶),CCK-8溶液和细胞培养液的体积比为1:1:10。在37℃下孵育24h后,使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度。通过以下公式计算Pt NPs(10~100μg·mL-1)、Fmoc-FF水凝胶(4mg·mL-1)和Pt/Fmoc-FF水凝胶(Pt:100μg·mL-1,Fmoc-FF:4 mg·mL-1)对细胞的生长活力的影响:活力(%)=(处理组的平均吸光度值/对照的平均 吸光度值)×100。结果为三个以上相同的测量值的平均值。参见图5,在孵育24h后,超 过80%的细胞在不同浓度的Pt NPs(0-100μg/mL)、Fmoc-FF水凝胶和Pt/Fmoc-FF水凝胶 下存活,且Pt/Fmoc-FF水凝胶具有更好的生物相容性。
实施例2
铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备包括如下步骤:
(1)将Fmoc-FF短肽冻干粉溶解在HFIP中,配成100mg·mL-1储备液备用。
(2)采用柠檬酸钠还原法合成Pt NPs,将0.16mL 100mmol·L-1H2PtCl6·6H2O加入38mL蒸 馏水中,并在室温下搅拌30min。加入0.2mL 50mmol·L-1C6H5Na3O7后,室温搅拌1h。通 过离心分离Pt NPs,并用超纯水洗涤50℃下烘干。将PtNPs溶解在去离子水中形成PtNPs 水溶液,浓度为5mg·mL-1。
(3)将步骤1中的短肽储备液加入到步骤2的Pt NPs水溶液中,可快速形成铂纳米粒子/短 肽水凝胶,其中短肽储备液与Pt NPs水溶液的体积比为1:100。
实施例3
铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备包括如下步骤:
(1)将Fmoc-FF短肽冻干粉溶解在HFIP中,配成浓度为80mg·mL-1的储备液备用。
(2)采用NaBH4还原法合成Pt NPs,4mL 7.7mmol·L-1的H2PtCl6·6H2O溶液中加入51.4mg 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮,分子量30000),然后加入蒸馏水稀释至50mL,在磁力搅拌下 缓慢滴入30mL 15.5mmol·L-1的NaBH4溶液,滴加完毕后继续搅拌2h,反应产物离心干燥得到黑色粉末状PtNPs,PtNPs溶解在去离子水中形成Pt NPs水溶液,浓度为5mg·mL-1。
(3)将步骤1中的短肽储备液加入到步骤2的Pt NPs水溶液中,可快速形成铂纳米粒子短 肽水凝胶,其中短肽储备液与Pt NPs水溶液的体积比为0.6:100。
实施例4
铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备包括如下步骤:
(1)将Fmoc-FF短肽冻干粉溶解在HFIP中,配成浓度为60mg·mL-1的储备液备用。
(2)采用NaBH4还原法合成Pt NPs,4mL 7.7mmol·L-1的H2PtCl6·6H2O溶液中加入51.4mg 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮,分子量30000),然后加入蒸馏水稀释至50mL,在磁力搅拌下 缓慢滴入30mL 15.5mmol·L-1的NaBH4溶液,滴加完毕后继续搅拌2h,反应产物离心干燥得到黑色粉末状PtNPs,PtNPs溶解在去离子水中形成Pt NPs水溶液,浓度为5mg·mL-1。
(3)将步骤1中的短肽储备液加入到步骤2的Pt NPs水溶液中,可快速形成铂纳米粒子短 肽水凝胶,其中短肽储备液与Pt NPs水溶液的体积比为1:100。
实施例5
铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备包括如下步骤:
(1)将Fmoc-FF短肽冻干粉溶解在HFIP中,配成浓度为100mg·mL-1的储备液备用。
(2)采用NaBH4还原法合成Pt NPs,4mL 7.7mmol·L-1的H2PtCl6·6H2O溶液中加入51.4mg 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮,分子量30000),然后加入蒸馏水稀释至50mL,在磁力搅拌下 缓慢滴入30mL 15.5mmol·L-1的NaBH4溶液,滴加完毕后继续搅拌2h,反应产物离心干燥得到黑色粉末状PtNPs,PtNPs溶解在去离子水中形成Pt NPs水溶液,浓度为1mg·mL-1。 (3)将步骤1中的短肽储备液加入到步骤2的Pt NPs水溶液中,可快速形成铂纳米粒子短 肽水凝胶,其中短肽储备液与Pt NPs水溶液的体积比为1:100。
实施例6
铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备包括如下步骤:
(1)将Fmoc-FF短肽冻干粉溶解在HFIP中,配成浓度为100mg·mL-1的储备液备用。
(2)采用NaBH4还原法合成Pt NPs,4mL 7.7mmol·L-1的H2PtCl6·6H2O溶液中加入51.4mg 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮,分子量30000),然后加入蒸馏水稀释至50mL,在磁力搅拌下 缓慢滴入30mL 15.5mmol·L-1的NaBH4溶液,滴加完毕后继续搅拌2h,反应产物离心干燥得到黑色粉末状PtNPs,PtNPs溶解在去离子水中形成Pt NPs水溶液,浓度为0.1mg·mL-1。
(3)将步骤1中的短肽储备液加入到步骤2的Pt NPs水溶液中,可快速形成铂纳米粒子短 肽水凝胶,其中短肽储备液与Pt NPs水溶液的体积比为1:100。
最后应说明的是:虽然以上已经详细说明了本发明及其优点,但是应当理解在不超出 由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下,可以进行各种改变、替代和变 换。而且,本发明的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体 实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解,根据本发明可以使用 执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将 来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此,所附的权利要求旨在在它们的范 围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
Claims (3)
1.一种铂纳米粒子/短肽水凝胶,其特征在于:所述水凝胶是由N-芴基甲氧基羰基-二苯丙氨酸(Fmoc-FF)二肽与铂纳米粒子(Pt NPs)通过一步共组装得到;铂纳米粒子/短肽水凝胶中Pt NPs:Fmoc-FF质量分数比为1:20~1:60;其制备步骤为,首先将Fmoc-FF冻干粉溶解在六氟异丙醇中,形成浓度为60mg·mL-1~100mg·mL-1的储备液;然后将短肽储备液加入到Pt NPs的水溶液中,基于共组装作用可形成铂纳米粒子/短肽水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种铂纳米粒子/短肽水凝胶,其特征在于:所述的Pt NPs由硼氢化钠或者柠檬酸钠还原氯铂酸制得,其含量为0.1mg·mL-1~5mg·mL-1,直径为5~10nm。
3.一种如权利要求1所述的铂纳米粒子/短肽水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:将Fmoc-FF冻干粉溶解在六氟异丙醇(HFIP)中,形成浓度为60mg·mL-1~100mg·mL-1的储备液;
步骤2:将步骤1中的短肽储备液加入到Pt NPs的水溶液中,基于共组装作用可形成铂纳米粒子/短肽水凝胶。
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