CN111053917A - 一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法。本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法。本发明的目的是解决传统抗菌剂杀菌效率较低、生物相容性差、耐药性细菌难治理的问题。方法:用大分子蛋白质为骨架,引入高效杀菌性能的小分子,同时为获得生物相容性较好的抗菌剂,对蛋白质骨架进行改进,同时起到定向智能杀菌的作用。采用大分子骨架,不易产生耐药性,同时易于设计广谱杀菌剂,解决了细菌易产生耐药性的问题,同时大分子骨架解决了普通抗菌剂杀菌的单一性,高效抗菌小分子胍基的引入,解决了传统抗菌剂杀菌效率较低的问题,解决了传统抗菌剂在生物体内排除困难的问题,起到了智能杀菌的特效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法。
背景技术
自抗生素小分子发现的黄金年代(19世纪40年代到60年代)以来,各种抗菌小分子被用于对抗传染性疾病引起的感染或死亡,抗生素一直是人类抵御感染性疾病的有力武器。这些杀菌小分子是通过与细菌靶标进行特异性结合的途径来杀死细菌,然而随着小分子杀菌剂的大量使用,抗生素对细菌的环境压力已然形成,再加上细菌的短生命周期及基因水平转移特性,耐药性微生物群体随之产生。近年来细菌耐药现象日益突出,抗菌耐药问题已成为国内外社会关注的焦点。在医学上滥用抗生素导致了多药耐药(MDR)“超级细菌”的诞生,例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Gupta,A.,et al.,Engineered PolymerNanoparticles with Unprecedented Antimicrobial Efficacy and TherapeuticIndices against Multidrug-Resistant Bacteria and Biofilms.Journal of theAmerican Chemical Society,2018.140(38):p.12137-12143.),特别是难治性革兰氏阴性菌对全球健康成严重威胁。如何设计出一种可对抗这些耐药菌,同时具有实际药用价值的新型抗菌剂,引发了越来越多科技工作者的关注和思考。
而对于抗菌剂的研究,生物相容性、溶血性、抗菌活性、耐药性和杀菌方式,这都是目前需要解决的问题,传统小分子抗菌剂或者是类抗生素类的研究已经不能应对抗生素滥用导致的细菌污染等问题,而抗菌肽由于他独特的作用机制导致了它具有称为替代抗生素的潜力。国内外的研究主要集中点也是生物相容性、溶血性、抗菌活性、耐药性和智能定向杀菌性,而如何将这些点结合在一起仍是一个挑战。为有效应对抗菌耐药,《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》提出,到2020年国内争取研发上市全新抗菌药1~2个。为此,应大力加强抗菌药物的研发投入和政策扶持,提高新药研发的经济价值和社会价值。
为了解决目前的细菌污染现象,迫切需要研制一种新的抗菌剂来对抗细菌,并且还要具有抗细菌产生耐药性的功能。为此,抗菌肽的研究成了一个热点,也是目前最有可能应用到实际的新型药剂中。所以要合理的设计出一种不易产生耐药性的高效新型抗菌剂。目前新型的抗菌药包括寡聚糖、益生菌、植物提取物、抗菌肽等。抗菌肽是指生物防御系统中产生的,广泛存在于生物体内,在先天性免疫细胞中与炎症反应、先天性免疫和适应性免疫相关的活性,具有抵御外界微生物侵害,清除体内突变细胞的一类带正电荷的两亲性小分子多肽,具有高效抗菌等多种生物学功能和难以产生耐药性无残留等优点(Kumar,P.,etal.,Antimicrobial Peptide–Polymer Conjugates with High Activity:Influence ofPolymer Molecular Weight and Peptide Sequence on Antimicrobial Activity,Proteolysis,and Biocompatibility.ACS Applied Materials&Interfaces,2017.9(43):p.37575-37586.),因此采用可赋予多功能性的抗菌肽来解决现在的MDR超级细菌有着重要意义。
发明内容
本发明是要解决传统抗菌剂杀菌效率较低、生物相容性差、耐药性细菌难治理的问题,而提供了一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法。
一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法具体是按以下步骤进行的:
一、抗菌剂骨架的构筑:将牛血清白蛋白在磁力搅拌下配置成BSA溶液;将己二胺溶于水中配置成己二胺溶液,采用稀盐酸将己二胺溶液的pH调节为4.5~7.5,将调节pH后的己二胺溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA溶液中,得到反应液,再向反应液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2;所述BSA溶液的浓度为5~20mg/mL;所述己二胺溶液的浓度为0.1~0.5mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为20~100mg/mL;所述己二胺与牛血清白蛋白的质量比为1:(50~200);所述己二胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:(20~100);
二、抗菌小分子与抗菌剂骨架的结合:将BSA-NH2溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成BSA-NH2溶液;将胍基乙酸溶于水中配置成胍基乙酸溶液,将胍基乙酸溶液的pH调节为4.5~7.5;将调节pH后的胍基乙酸溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2溶液中,得到反应液,再向反应液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2-胍基乙酸;所述BSA-NH2溶液的浓度为5~20mg/mL;所述胍基乙酸溶液的浓度为0.5~2mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为20~100mg/mL;所述胍基乙酸与BSA-NH2的质量比为1:(50~200);所述胍基乙酸与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:(20~100);
三、聚乙二醇单甲醚的修饰:将聚乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷得到聚乙二醇单甲醚溶液;将对甲酰基苯甲醛溶于二甲基乙酰基得到对甲酰基苯甲醛溶液;将聚乙二醇单甲醚溶液和对甲酰基苯甲醛溶液混合后在搅拌的条件下向其中加入催化剂和吸水剂,在室温下反应4~6h;采用乙醚沉降,滤纸过滤得到滤饼,再采用乙醚冲洗滤饼三次后取滤饼在40~60℃烘箱中干燥,得到的干燥物溶于水中充分搅拌溶解,过滤,取滤液,冻干得到甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚;所述聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为10~200mg/mL;所述对甲酰基苯甲醛溶液的浓度为10~100mg/mL;所述聚乙二醇单甲醚与对甲酰基苯甲醛的质量比为1:(0.01~0.1);所述聚乙二醇单甲醚与催化剂的质量比为1:(0.01~0.05);所述聚乙二醇单甲醚与吸水剂的质量比为1:(0.01~0.1);
四、杀菌剂智能调控的形成:将BSA-NH2-胍基乙酸溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成BSA-NH2-胍基乙酸溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶于蒸馏水中配置成甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2-胍基乙酸溶液中,得到反应液,在室温下反应2~4h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到基于蛋白质的智能高效抗菌剂;所述BSA-NH2-胍基乙酸溶液的浓度为1~10mg/mL;所述甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为1~10mg/mL;BSA-NH2-胍基乙酸与甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚的质量比为1:(0.5~5)。
本发明的有益效果:
1、本发明制备的基于蛋白质的智能高效抗菌剂,解决了传统抗菌剂杀菌效率较低的问题,抗菌剂对细菌具有很好的抗菌效果。同时抗菌剂容易排出体内。创新了抗菌调控方式,采用希夫碱来智能调控杀菌方式,开发了一种新型抗菌调控方式。突破了传统抗生素的弊端,为设计新型抗菌药物提供了一种思路。
2、本发明制备的基于蛋白质的智能高效抗菌剂,解决了抗菌剂的生物相容性问题,采用了聚乙二醇来改善生物相容性,同时还有利于抗菌剂避开机体的免疫系统,延长抗菌药物在体内的半衰期。
3、本发明制备的基于蛋白质的智能高效抗菌剂,解决了目前难治理的耐药性细菌问题,用抗菌剂处理后的细菌不易产生耐药性,对比传统抗生素,细菌产生耐药性的几率大大降低。。
4、本发明可以高效对抗易产生耐药性的革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌。抗菌剂高效性,良好生物相容性,细菌不易产生耐药性,对细菌进行智能杀菌的效果,是一种面对抗生素滥用的现象设计出一种新型抗菌剂的方法。
附图说明
图1是正常大肠杆菌的扫描电子显微镜照片;
图2是正常金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜照片;
图3是经过抗菌剂处理一小时后大肠杆菌的扫描电子显微镜照片;
图4是经过抗菌剂处理一小时后金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜照片;
图5是二倍稀释法测大肠杆菌最小抑菌浓度MIC的实验图,其中抗菌剂的初始浓度为0.5mg/mL;
图6是二倍稀释法测金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度MIC的实验图,其中抗菌剂的初始浓度为1.0mg/mL;
图7是在不同pH的环境中对细菌进行培养的图;其中1为pH=7.4,2为pH=6.5;
图8是未加抗菌剂细菌的荧光染色实验激光共聚焦照片;
图9是采用0.5mg/mL基于蛋白质的智能高效抗菌剂处理后对细菌的荧光染色实验激光共聚焦照片;
图10是用5mg/mL基于蛋白质的智能高效抗菌剂处理后的3T3L1小鼠胚胎成纤维细胞的显微镜照片。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法具体是按以下步骤进行的:
一、抗菌剂骨架的构筑:将牛血清白蛋白在磁力搅拌下配置成BSA溶液;将己二胺溶于水中配置成己二胺溶液,采用稀盐酸将己二胺溶液的pH调节为4.5~7.5,将调节pH后的己二胺溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA溶液中,得到反应液,再向反应液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2;所述BSA溶液的浓度为5~20mg/mL;所述己二胺溶液的浓度为0.1~0.5mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为20~100mg/mL;所述己二胺与牛血清白蛋白的质量比为1:(50~200);所述己二胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:(20~100);
二、抗菌小分子与抗菌剂骨架的结合:将BSA-NH2溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成BSA-NH2溶液;将胍基乙酸溶于水中配置成胍基乙酸溶液,将胍基乙酸溶液的pH调节为4.5~7.5;将调节pH后的胍基乙酸溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2溶液中,得到反应液,再向反应液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2-胍基乙酸;所述BSA-NH2溶液的浓度为5~20mg/mL;所述胍基乙酸溶液的浓度为0.5~2mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为20~100mg/mL;所述胍基乙酸与BSA-NH2的质量比为1:(50~200);所述胍基乙酸与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:(20~100);
三、聚乙二醇单甲醚的修饰:将聚乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷得到聚乙二醇单甲醚溶液;将对甲酰基苯甲醛溶于二甲基乙酰基得到对甲酰基苯甲醛溶液;将聚乙二醇单甲醚溶液和对甲酰基苯甲醛溶液混合后在搅拌的条件下向其中加入催化剂和吸水剂,在室温下反应4~6h;采用乙醚沉降,滤纸过滤得到滤饼,再采用乙醚冲洗滤饼三次后取滤饼在40~60℃烘箱中干燥,得到的干燥物溶于水中充分搅拌溶解,过滤,取滤液,冻干得到甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚;所述聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为10~200mg/mL;所述对甲酰基苯甲醛溶液的浓度为10~100mg/mL;所述聚乙二醇单甲醚与对甲酰基苯甲醛的质量比为1:(0.01~0.1);所述聚乙二醇单甲醚与催化剂的质量比为1:(0.01~0.05);所述聚乙二醇单甲醚与吸水剂的质量比为1:(0.01~0.1);
四、杀菌剂智能调控的形成:将BSA-NH2-胍基乙酸溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成BSA-NH2-胍基乙酸溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶于蒸馏水中配置成甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2-胍基乙酸溶液中,得到反应液,在室温下反应2~4h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到基于蛋白质的智能高效抗菌剂;所述BSA-NH2-胍基乙酸溶液的浓度为1~10mg/mL;所述甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为1~10mg/mL;BSA-NH2-胍基乙酸与甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚的质量比为1:(0.5~5)。
本实施方式选用牛血清蛋白(BSA)大分子为抗菌剂载体骨架,在其表面引入具有强杀菌作用的胍基化官能团(胍基乙酸)。同时采用聚乙二醇修饰,使得该抗菌剂有着良好的生物相容性以及稳定性,降低了改抗菌剂的生物毒性。而在细菌感染时,发生了一系列的生化反应使得感染部位的pH会发生降低,这就为希夫碱的断裂提供了有利条件;当正常细胞时,由于细胞所处环境多为中性,在这种环境下,拟合成的抗菌剂不会有强正电基团明显暴露出来,对细胞的伤害就会比较小,而引入了PEG会使得抗菌剂避开机体的免疫系统,保护其生物活性,增强抗菌剂对外界条件的耐受能力,延长抗菌药物在体内的半衰期;当有细菌感染时,感染部位的酸度会上升,就为抗菌剂的暴露提供了有利条件,从而使得杀菌功能基团与感染部位的细菌相结合,起到了智能杀菌的目的。
本实施方式以大分子蛋白质为骨架,接入抗菌小分子,修饰上可智能断裂的增加生物相容性的聚乙二醇单甲醚;采用的抗菌小分子为胍基类小分子。
本实施方式步骤四引入PEG增加生物相容性,采用在水中形成希夫碱的方式,是BSA-NH2-胍基乙酸上的氨基与对甲酰基苯甲醛修饰的聚己二醇单甲醚上的醛基在水中形成可酸响应断裂的希夫碱;所述的赋予杀菌剂智能调控特质,接入mPEG的数量为6个。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一中采用稀盐酸将己二胺溶液的pH调节为6.5;步骤二中将胍基乙酸溶液的pH调节为6.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一中所述BSA溶液的浓度为10mg/mL;所述己二胺溶液的浓度为0.2mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为50mg/mL。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤一中所述己二胺与牛血清白蛋白的质量比为1:100;所述己二胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:50。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤二中所述BSA-NH2溶液的浓度为10mg/mL;所述胍基乙酸溶液的浓度为1mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为50mg/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤二中所述胍基乙酸与BSA-NH2的质量比为1:50;所述胍基乙酸与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:50。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是:步骤三中所述聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为100mg/mL;所述对甲酰基苯甲醛溶液的浓度为50mg/mL;所述聚乙二醇单甲醚与对甲酰基苯甲醛的质量比为1:0.05。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:步骤三中所述催化剂是4-二甲氨基吡啶,吸水剂是二环己基碳二亚胺;所述聚乙二醇单甲醚与催化剂的质量比为1:0.02;所述聚乙二醇单甲醚与吸水剂的质量比为1:0.05。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是:步骤四中所述BSA-NH2-胍基乙酸溶液的浓度为5mg/mL;所述甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为5mg/mL。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是:步骤四中BSA-NH2-胍基乙酸与甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚的质量比为1:1。其它与具体实施方式一至九之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果:
实施例一:一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法具体是按以下步骤进行的:
一、抗菌剂骨架的构筑:将牛血清白蛋白在磁力搅拌下配置成10mL(10mg/mL)BSA溶液;将己二胺溶于水中配置成5mL(0.2mg/mL)己二胺溶液,采用稀盐酸调节己二胺溶液的pH,分别配置pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的己二胺溶液,将调节pH后的己二胺溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA溶液中,得到反应液,再向反应液中加入2.5mL(50mg/mL)1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2;对产物进行紫外定量分析的技术来判断反应效果。当pH为3.0、3.0、4.0时,反应液发生沉淀,牛血清白蛋白析出,反应失败,当pH为8.0、8.5时,几乎不会发生反应,在4.5~7.5时,反应效果不同,在pH为6.5时,反应效果最好,故采用6.5的酸性条件作为反应条件;
二、抗菌小分子与抗菌剂骨架的结合:将BSA-NH2溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成10mL(10mg/mL)BSA-NH2溶液;将胍基乙酸溶于水中配置成不同浓度的胍基乙酸溶液:0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL,将胍基乙酸溶液的pH调节为6.5;将调节pH后的胍基乙酸溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2溶液中,得到反应液,再向反应液中加入2.5mL(50mg/mL)1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2-胍基乙酸;对合成的抗菌剂用二倍稀释法进行抗菌性能测试。当胍基乙酸的浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL时,接入的胍基乙酸的量比较少,抗菌效果不好,当胍基乙酸的浓度为2.5mg/mL、3mg/mL时,胍基乙酸的溶解性不好,使得反应无法正常进行。在浓度为1.0mg/mL时,反应得到的抗菌剂抗菌效果最好,所以胍基乙酸的反应浓度为1.0mg/mL;
三、聚乙二醇单甲醚的修饰:将聚乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷得到10mL(100mg/mL)聚乙二醇单甲醚溶液;将对甲酰基苯甲醛溶于二甲基乙酰基配置浓度分别为10mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、70mg/mL、100mg/mL的对甲酰基苯甲醛溶液;将聚乙二醇单甲醚溶液和对甲酰基苯甲醛溶液混合后在搅拌的条件下向其中加入20mg催化剂和50mg吸水剂,在室温下反应5h;采用乙醚沉降,滤纸过滤得到滤饼,再采用乙醚冲洗滤饼三次后取滤饼在40℃烘箱中干燥,得到的干燥物溶于水中充分搅拌溶解,过滤,取滤液,冻干得到甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚;
四、杀菌剂智能调控的形成:将BSA-NH2-胍基乙酸溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成10mL(5mg/mL)BSA-NH2-胍基乙酸溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶于蒸馏水中配置成10mL(5mg/mL)甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2-胍基乙酸溶液中,得到反应液,在室温下反应3h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到基于蛋白质的智能高效抗菌剂。对甲酰基苯甲醛的浓度,浓度较低反应不充分,浓度较高,反应产物不易除去,反应浓度范围为10~100mg/mL,最适浓度为50mg/mL。
抗菌剂的合成表征:对合成的抗菌剂进行Zate电势的测试,可以得到BSA的电势为2.2mV,BSA-NH2的电势为30.3mV,BSA-NH2-胍基乙酸的电势为43.8mV。由此可得出抗菌剂的成功合成。同时还对mPEG的分子数进行了定量分析,分别配置不同浓度的BSA-NH2-胍基乙酸,对甲酰基苯甲醛修饰的聚乙二醇单甲醚以及被mPEG修饰的BSA-NH2-胍基乙酸,对不同物质进行紫外定量测试,测得单个BSA-NH2-胍基乙酸上有6个PEG分子链。同时合成的mPEG修饰的BSA-NH2-胍基乙酸具有pH响应性,可以达到智能杀菌的目的。
图1是正常大肠杆菌的扫描电子显微镜照片;从照片中可以看出表面比较圆润,无破裂现象。图2是正常金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜照片;从照片中可以看出表面比较圆润,无破裂现象。图3是经过抗菌剂处理一小时后大肠杆菌的扫描电子显微镜照片;从照片中可以清晰看到大肠杆菌发生了破裂,有部分细胞内溶物流出,细菌破膜死亡。图4是经过抗菌剂处理一小时后金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜照片;从照片中可以清晰看到金黄色葡萄球菌发生了破裂,有部分细胞内溶物流出,细菌破膜死亡。
抗菌剂的抗菌性能测试:对合成的抗菌剂BSA-NH2-胍基乙酸进行抗菌实验,采用二倍稀释法对抗菌剂进行最小抑菌浓度MIC测试,如图5、图6所示,可测的抗菌剂对细菌的最小抑菌浓度为60μg/mL,由图8与图9可知,当加入的抗菌剂浓度为0.5mg/mL时,处理后大约有99%的被抗菌剂杀死,对照不加抗菌剂的对照组,无死亡细菌,由此可知,抗菌剂可以致使细菌发生死亡。同时对细菌进行耐药性测试,在培养16天后,约800代,合成的抗菌剂BSA-NH2-胍基乙酸几乎不产生耐药性,对比传统抗生素,四环素,苄青霉素,卡那霉素,均不同程度的出现了耐药性,如表3所示。由此可看处,合成的抗菌剂BSA-NH2-胍基乙酸不易使细菌产生耐药性。同时针对pH响应性做了相关实验,根据实验结果,在细菌可产生的酸性条件(pH 5.6)下,细菌出现了死亡现象,而在缓冲溶液(pH 7.4)中,对细菌没有杀菌性。可以得出,合成的抗菌剂具有严格的pH响应性,在细菌产生的酸性条件下可以达到杀菌的效果,而在正常生理条件下,合成的抗菌剂对细菌没有抗菌性,符合智能杀菌的目的,如图7所示。表1是BSA-NH2-胍基乙酸的粒径数据表,表2mPEG修饰的BSA-NH2-胍基乙酸的粒径数据图。由表可以看出,BSA-NH2-胍基乙酸的粒径约为1.5nm左右,BSA-NH2-胍基乙酸-mPEG的粒径约为3.6nm左右,可以证明BSA-NH2-胍基乙酸与对甲酰基苯甲醛修饰的聚己二醇单甲醚的成功结合,智能基团希夫碱的成功合成。
抗菌剂的生物相容性测试:针对合成的抗菌剂的生物相容性的测试,采用了新鲜兔血与3T3L1小鼠胚胎成纤维细胞。通过实验结果可知,对新鲜血红细胞几乎没伤害。对3T3L1小鼠胚胎成纤维细胞,高浓度的BSA-NH2-胍基乙酸(5mg/mL)对细胞有一定的伤害,而被mPEG修饰的BSA-NH2-胍基乙酸即使在高浓度下,对细胞仍然没有伤害(如图10所示),由此可看出合成的mPEG修饰的BSA-NH2-胍基乙酸具有很好的生物相容性。
表2
表3
Claims (10)
1.一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法具体是按以下步骤进行的:
一、抗菌剂骨架的构筑:将牛血清白蛋白在磁力搅拌下配置成BSA溶液;将己二胺溶于水中配置成己二胺溶液,采用稀盐酸将己二胺溶液的pH调节为4.5~7.5,将调节pH后的己二胺溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA溶液中,得到反应液,再向反应液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2;所述BSA溶液的浓度为5~20mg/mL;所述己二胺溶液的浓度为0.1~0.5mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为20~100mg/mL;所述己二胺与牛血清白蛋白的质量比为1:(50~200);所述己二胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:(20~100);
二、抗菌小分子与抗菌剂骨架的结合:将BSA-NH2溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成BSA-NH2溶液;将胍基乙酸溶于水中配置成胍基乙酸溶液,将胍基乙酸溶液的pH调节为4.5~7.5;将调节pH后的胍基乙酸溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2溶液中,得到反应液,再向反应液中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液,在室温下反应10h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到BSA-NH2-胍基乙酸;所述BSA-NH2溶液的浓度为5~20mg/mL;所述胍基乙酸溶液的浓度为0.5~2mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为20~100mg/mL;所述胍基乙酸与BSA-NH2的质量比为1:(50~200);所述胍基乙酸与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:(20~100);
三、聚乙二醇单甲醚的修饰:将聚乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷得到聚乙二醇单甲醚溶液;将对甲酰基苯甲醛溶于二甲基乙酰基得到对甲酰基苯甲醛溶液;将聚乙二醇单甲醚溶液和对甲酰基苯甲醛溶液混合后在搅拌的条件下向其中加入催化剂和吸水剂,在室温下反应4~6h;采用乙醚沉降,滤纸过滤得到滤饼,再采用乙醚冲洗滤饼三次后取滤饼在40~60℃烘箱中干燥,得到的干燥物溶于水中充分搅拌溶解,过滤,取滤液,冻干得到甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚;所述聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为10~200mg/mL;所述对甲酰基苯甲醛溶液的浓度为10~100mg/mL;所述聚乙二醇单甲醚与对甲酰基苯甲醛的质量比为1:(0.01~0.1);所述聚乙二醇单甲醚与催化剂的质量比为1:(0.01~0.05);所述聚乙二醇单甲醚与吸水剂的质量比为1:(0.01~0.1);
四、杀菌剂智能调控的形成:将BSA-NH2-胍基乙酸溶于蒸馏水中在磁力搅拌下配置成BSA-NH2-胍基乙酸溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶于蒸馏水中配置成甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液;将甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液以0.5~3mL/min的速率滴加到BSA-NH2-胍基乙酸溶液中,得到反应液,在室温下反应2~4h,反应完成后过滤、透析、冷冻干燥,得到基于蛋白质的智能高效抗菌剂;所述BSA-NH2-胍基乙酸溶液的浓度为1~10mg/mL;所述甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为1~10mg/mL;BSA-NH2-胍基乙酸与甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚的质量比为1:(0.5~5)。
2.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤一中采用稀盐酸将己二胺溶液的pH调节为6.5;步骤二中将胍基乙酸溶液的pH调节为6.5。
3.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤一中所述BSA溶液的浓度为10mg/mL;所述己二胺溶液的浓度为0.2mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤一中所述己二胺与牛血清白蛋白的质量比为1:100;所述己二胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:50。
5.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤二中所述BSA-NH2溶液的浓度为10mg/mL;所述胍基乙酸溶液的浓度为1mg/mL;所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液的浓度为50mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤二中所述胍基乙酸与BSA-NH2的质量比为1:50;所述胍基乙酸与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液中溶质的质量比为1:50。
7.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤三中所述所述聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为100mg/mL;所述对甲酰基苯甲醛溶液的浓度为50mg/mL;所述聚乙二醇单甲醚与对甲酰基苯甲醛的质量比为1:0.05。
8.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤三中所述催化剂是4-二甲氨基吡啶,吸水剂是二环己基碳二亚胺;所述聚乙二醇单甲醚与催化剂的质量比为1:0.02;所述聚乙二醇单甲醚与吸水剂的质量比为1:0.05。
9.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤四中所述BSA-NH2-胍基乙酸溶液的浓度为5mg/mL;所述甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚溶液的浓度为5mg/mL。
10.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质的智能高效抗菌剂的制备方法,其特征在于步骤四中所述BSA-NH2-胍基乙酸与甲酰基苯甲醛修饰后的聚乙二醇单甲醚的质量比为1:1。
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