CN1148182C - 茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成的药物中的应用，其疗效好、无毒副作用，具有抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成的较佳效果，可用来作为治疗老年性痴呆、血管性淀粉样病变的药物。

Description

茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白 聚集和纤维形成的药物中的应用

本发明涉及茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成的药物中的应用。

β-淀粉样蛋白(Amyloid-β-protein，Aβ)是老年斑(Senile Plaques，SP)中的主要成份，它来自于一种跨膜糖蛋白，即β-淀粉样前体蛋白(Amyloid-β Precursor Protein，APP)，Aβ的不溶性纤维状沉积被认为是导致老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)发病的主要原因。AD的发病率随着年龄的增大而逐渐增加，并随着社会老龄化的发展，其发病人数急剧上升。现已成为导致人类死亡的主要疾病之一。另外，Aβ聚集和纤维形成还能导致血管性淀粉样病变。

至今仍未能找到对AD有效的治疗方法。现有治疗的目的主要是控制行为学方面的异常症状，改善语言、记忆等认知功能，减缓疾病的发展速度以及延缓病症的发生。药物的运用主要包括如下几方面：

①乙酰胆碱酯酶抑制剂，针对AD患者脑内胆碱能神经元大量丢失，乙酰胆碱递质严重缺乏，运用乙酰胆碱酯酶抑制剂，可增加脑内乙酰胆碱的含量，促进神经元功能的恢复。②兴奋性氨基酸受体拮抗剂，保护细胞免受兴奋性递质细胞毒性作用的攻击。③抗炎药物，由于在老年斑淀粉样变核心的周围存在着反应性胶质细胞，有人因此提出了AD的慢性炎症学说，并利用合适的抗炎药来达到预防和治疗的目的。④神经营养因子，它能特异性的作用于神经元，刺激神经元的可塑性，促进神经元的生长、存活，维护细胞的功能。⑤其它，如雌激素的替代治疗，脑细胞代谢激活剂，钙离子拮抗剂的运用等。虽然上述药物在临床应用中已显示出一定的疗效，但在长期使用过程中，由于存在着严重的不可避免的副作用，或者来源有限且不易通过血脑屏障，更缺乏可以肯定的有效性和特异性，因此，这类药物的运用有待于进一步的研究。

目前，化学合成药物的毒副作用严重地困扰着医学界，回归自然，返朴归真成为人们对涉及自身生存条件的新的渴求，人们比以往更注目于天然药物，近年来，人们把这些药物应用于AD的防治已积累了大量行之有效的经验，如中药复方黄连解毒汤，当归芍药散，钩藤散等，既可治疗AD的精神症状，对抗健忘，又能改善患者体质。运用天然药物治疗AD至少有两点优势：(1)作用的多靶点并对人体机能进行整体性的调节；(2)副作用小。因此，对于AD这种神经系统的慢性退行性疾病而言，天然药物的开发和运用具有更大的优势和更广阔的发展前景。目前，虽然天然制剂对AD的治疗取得了一定的效果，然而由于每个患者有不同的辨证特征，药物的疗效差异较大，且现有药物重在改善患者的临床症状，但不能阻遏病情的发展。

Aβ聚集和纤维形成还能导致血管性淀粉样病变，进而诱发中风等疾患。迄今为止，没有根治血管性淀粉样病变的药物。

茶多酚(Green tea polyphenols)是从茶科植物茶(Cameliasinensis)中提取的物质，约占绿茶干重的15％～25％，其结构中含多个邻位酚羟基结构，供质子氢的能力很强，其主要含有几个主要儿茶素化合物：表没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechin gallate，EGCG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表没食子没食子酸脂(epicatechin gallate，EGCG)、表儿茶素(epicatechin EC)和没食子儿茶素(gallocatechin，GC)。茶多酚作为一种天然食品抗氧化剂，1991年已列入我国国家标准。中国专利88108154已报导其提取方法。李楠等有关于茶多酚的研究进展的综述[《江西中医学院学报》，1999，11(3)，140-141]，报导了其提供方法及其具抗氧化等生物活性，迄今为止，未见有关于茶多酚抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成、用于治疗血管性淀粉样病变、老年性痴呆疾病的报导。

本发明的目的就是为了克服目前治疗老年性痴呆、血管性淀粉样病变无疗效好的药物的缺点，提供疗效好、无毒副作用的茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成的药物上的应用。

本发明是这样实现的。

茶多酚是从绿茶中提取的上述几种儿茶素化合物为主的混合物。可以通过下述几种方法提取：(1)茶叶→热水浸提→减压浓缩→氯仿(或二氯甲烷)萃取→有机层提取咖啡碱(水层→乙酸乙酯萃取精制茶多酚)。(2)茶叶→冷提→减压浓缩→萃取脂溶性物质→乙酸乙酯萃取精制茶多酚。(3)茶叶→80％乙醇(或热水浸提)→吸附剂吸附式有机高分子柱吸附→醇洗脱→浓缩干燥精制茶多酚。(4)茶叶→粉碎→热水浸提→沉淀分离→分离纯化→喷雾干燥。还可以通过88108154专利的提取方法提取。

经过体外实验及加速老化鼠(SAM)的行为学和形态学观察实验表明，茶多酚对Aβ的作用包括以下方面：①清除体内的自由基，清除引起Aβ聚集的诱发因素；②与Aβ结合阻止其聚集和纤维化；③与Aβ肽自由基结合抑制Aβ对神经元的毒性作用；④降解已成熟的Aβ纤维，发挥清除淀粉的效应。体内的实验也显示，茶多酚对Aβ样沉积的抑制作用及其改善加速老化鼠学习记忆的能力，进一步提示茶多酚可以干预Aβ纤维聚集、拮抗其神经毒性，达到治疗AD的效果。据李楠等关于茶多酚的研究进展文献资料表明，茶多酚属实际无毒级，且无蓄积毒性，因此茶多酚是实施以Aβ为靶治疗AD的理想药物。当然，由于茶多酚能抑制Aβ聚集和纤维形成，茶多酚便具有治疗血管性淀粉样病变的功效。

本发明的茶多酚制备成抑制Aβ聚集和纤维形成的药物，由于茶多酚能通过血脑屏障达到有效浓度，且能通过胃肠道吸收，可以采用口服剂型、包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等，也可加入食物中食用，或添加至食品中作为保健食品食用。

本发明的茶多酚也可以与目前治疗AD的西药如胆碱酯酶抑制剂如他克林(Tacrine)复方，制成复方制剂，使得在治疗AD时达到标本兼治的目的，也可以与其它中药如当归药散复方。

下列实施例只用于说明本发明，而对本发明的保护范围无任何限制作用。

实施例1，茶多酚的提取，同中国专利88108154的实施例的方法，以热水浸提绿茶，在浸提液中加入石灰水，分离、洗涤沉淀后，用稀酸进行转溶沉淀，转溶液即为茶多酚溶液。浓缩干燥为粉状茶多酚粗品，转溶液经有机溶制萃取后，浓缩干燥即为粗晶态茶多酚。进一步萃取精制，得精制茶多酚。

实施例2

茶多酚胶囊剂。

取精制茶多酚，加滑石粉，混合，在装胶囊机中分装，即得胶囊剂。

实施例3

茶多酚在体外抑制Aβ的聚集和纤维形成

一、材料和方法

Aβ_1-40冻干粉用50mM PBS(pH7.4)稀释成0.1％(230μM)Aβ，在室温下(22℃)分别孵育30min和7天，运用透射电镜和硫黄素T(Th-T)荧光分析观察Aβ纤维的形成，以及茶多酚和维生素E(VE)与Aβ在相同百分浓度下共同孵育时对Aβ纤维形成的影响；检测茶多酚和VE在不同浓度(5×10^-4％、5×10^-3％、5×10^-2％)和不同时间(孵育第1、2、3、4、5天)对Aβ纤维形成的抑制作用，同时观察这两种药物对已成熟的Aβ纤维结构的影响。

二、结果

(一)茶多酚抑制Aβ纤维的形成

Aβ在PBS溶液中能自我聚集，产生无定形和纤维型两种结构，单独孵育30min，主要以无定形Aβ存在，未见Aβ纤维形成。孵育7天，可见大量的直而无分枝的Aβ纤维呈晶状聚集，纤维直径约8～10nm，类似于AD脑SP中的Aβ纤维，茶多酚的存在，能显著地阻止Aβ纤维形成，主要表现为无定形的Aβ结构，VE与Aβ共同孵育也可出现Aβ纤维，直径约3～10nm，呈网状分布。茶多酚与VE的协同作用，产生大量直径为3～5nm呈网状分布的Aβ原纤维。Th-T分析显示，茶多酚、VE和它们的协同作用均能显著地降低Aβ的荧光强度，以茶多酚的效果最为显著，在0.1％浓度下三者对Aβ纤维形成的抑制率分别为94.6％、62.3％和88.7％。

(二)茶多酚抑制Aβ纤维形成的剂量和时间效应

茶多酚和VE对Aβ纤维形成的抑制均有浓度依赖性，它们在0.05％浓度附近出现最大抑制率，茶多酚在每一浓度点的抑制率均远远大于VE，且具有较明显的“平台”。茶多酚在每一时间点的荧光强度也显著小于各组，且能延迟在荧光强度曲线中半高峰出现的时间(T_1/2)。

(三)茶多酚对成熟Aβ纤维的作用

茶多酚能使成熟的Aβ纤维降解，形成直径约3～5nm，长度小于100nm，散在分布的纤维结构。VE也能改变Aβ纤维的形态，形成直径为3～5nm的Aβ原纤维，并呈丝网状连接。Th-T荧光分析表明，茶多酚比VE更显著地减弱了Aβ纤维的荧光强度。

实施例4

FT-IR法定量研究茶多酚对Aβ肽老化时二级结构变化的影响

一、材料和方法

Aβ_1-40在50mM PBS(pH7.4)溶液中单独或分别与茶多酚、VE和茶多酚+VE在相同百分浓度(均为0.1％)下共同孵育7天，孵育后的样品真空冷冻干燥处理，与无水溴化钾充分混合制成溴化钾压片，用Nicolet magna 760傅立叶变换红外(FT-IR)光谱仪检测，根据二阶导数谱采用Gauss和Lorentz功能对原谱进行曲线拟合，定量研究各二级结构的成份和含量，比较各组间二级结构成分的差别。

二、结果

Aβ二级结构成分主要包括自由卷曲、α-螺旋、β-折叠片(伸展结构)和β-转角。Aβ老化7天，β-折叠片的含量约占二级结构总含量的53.2％，与老化30min时β-折叠片的含量相比增加约10％，出现自由卷曲向β-折叠片的转化。茶多酚的存在明显减少β-折叠片(26.4％)的含量。β-转角的含量(23.5％)明显少于老化7天组(32.5％)，VE也能减少β-折叠片的含量(30.8％)，但对β-转角的影响并不明显(31.4％)。茶多酚与VE的协同作用使β-折叠片含量略有上升(55％)，而β-转角的含量(16.7％)显著下降，药物作用的结果抑制了自由卷曲和α-螺旋向β-折叠结构的转化，以茶多酚对β-折叠片和β-转角的影响最为显著。

实施例5

茶多酚对Aβ1-40肽自由基形成的抑制作用

一、材料和方法

0.1％Aβ单独或分别与相同百分浓度的茶多酚、VE乳化液和茶多酚+VE在37℃恒温箱中共同孵育，在孵育液中加入50mM的自由基捕捉剂本叔丁基氮酮(PBN)，分别在孵育后第1、2、3、6天利用Bruker RCS106电子顺磁共振仪(EPR)检测，分析自由基的性质和药物对自由基的清除率。

二、结果

本实验证实Aβ在老化过程中产生曲线强度比为1∶2∶2∶1的四线谱自由基，以孵育第三天时的信号最强。各药物处理组的EPR谱在四线谱的基础上出现分裂和位移，并在第三天出现最为明显的另一种特征的波谱，至第六天波峰数减半或形成一单峰。茶多酚处理组第三天的波型为半醌自由基的六线谱，曲线强度比为1∶1∶3∶3∶1∶1，第六天则转化成1∶9∶1的三线谱，第二峰的g＝2.00057，线宽ΔH＝5.43G。VE组第三天形成2∶2∶1∶1四线谱，第六天的EPR谱为一单峰，g＝2.00058，线宽ΔH＝5.43G。茶多酚和VE共同作用在孵育的第三天产生9∶9∶3∶3∶1∶1的六线谱，而第六天转化成3∶3∶1的三线谱。以第三天EPR谱第二峰的线宽代表各组自由基的强度，计算茶多酚、VE和茶多酚+VE对自由基的清除率分别为50.46％、31.28％和36.77％。

实施例6

茶多酚对注入大鼠脑皮质内Aβ1-40纤维形成的干预作用

一、材料和方法

9只Wistar大鼠(250～300g)随机分为三组，动物用0.1％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，固定在立体定位仪上，将0.2％Aβ1-40 5μl注入大鼠脑深皮质的相同部位。一组作对照，另两组分别用茶多酚和VE腹腔注射治疗(100mg/kg·d)。动物存活7天，然后用4％多聚甲醛和0.5％戊二醛灌注固液经左心室、主动脉灌注固定，取注射部位组织作透射电镜，常规包埋，切片，染色，观察Aβ纤维的形态。另一部分组织作冰冻切片，采用甲醇刚果红法染色，偏振光显微镜观察Aβ纤维结构。

二、结果

在Aβ注射部位出现高电子密度沉积物，其周围存在许多吞噬细胞，胞浆中存在着与沉积物电子密度相似的吞噬颗粒。在对照组和VE组的沉积物中出现大量密集的纤维结构，纤维直径约10nm，类似于SP中的Aβ纤维。而在茶多酚处理组中，这些纤维的数目明显减少，偏振光显微镜观察，在茶多酚处理组注射部位的偏振光相对较弱。

实施例7

茶多酚治疗加速老化鼠(SAM)的行为学和形态学观察

一、材料和方法

2.5月龄雄性SAM-P₈随机分为对照组、TA1组、TA2组和VE组(n＝5)，分别给予正常饮食、0.05％、0.5％茶多酚饮水和500mg VE/kg·diet的特制VE饲料喂养，喂养期为3.5月，然后采用Morris水迷宫测试动物的空间学习记忆能力(逃避潜伏期和平台象限游泳距离的百分比)，动物处死和取材均参照第四部分的方法进行。组化切片采用Gomori’s六胺银法和PAS染色，显示Aβ淀粉样颗粒，利用IBAS2.5全自动图像分析系统对海马CA1区的六胺银染色颗粒(MSG)的灰度、直径(面积)和数目以及不同灰度值下的颗粒分布进行定量分析。

二、结果

(一)行为学测试结果

1.定位航行试验(逃避潜伏期)：8个block训练结果显示，对照组、TA1组、TA2组和VE组的逃避潜伏期分别是62.78”、53.94”、36.38”和40.22”，与对照组相比，TA2和VE组逃避潜伏期减少具有显著性意义(p＜0.05)，TA1和TA2组间也具有显著性差异(P＜0.05)。前5个block各组的逃避潜伏期无显著性差异，后3个block的统计学分析表明，对照组(47.33”)与TA2组(18.16”)和VE组(24.50”)比较，其差别有显著性意义(P＜0.05)，TA1组的逃避潜伏期(39.17”)也显著地少于TA2组(P＜0.05)。

2.空间探索试验(平台象限游泳距离百分比)：对照组在平台象限的游泳距离百分比(11.33％)显著小于TA2组(24.35％)和VE组(20.93％)，TA1组在平台象限的游泳距离百分比(15.09％)与TA2组间也存在显著性差异。

(二)MSG组化观察

MSG主要分布于海马、皮质深层、梨状质和小脑。海马的MSG主要成群分布，分布于海马各层。MSG形态为圆形和卵圆形，并表现出不同的密度。PAS染色的结果与MSG非常相似。

(三)对海马CA1区MSG数目、直径和灰度的影响

对海马CA1区MSG数目、直径、面积和灰度的统计学分析表明，对照组的颗粒数(896.37±202.14)与TA1组(787.10±130.85)、TA2组(727.44±201.74)和VE组(767.70±146.23)的颗粒数相比均无显著性差异(P＞0.05)。对照组的直径和面积(2.04±0.22um，3.29±0.73um²)，显著大于TA1组(1.85±0.14um，2.69±0.35um²)、TA2组(1.69±0.11um，2.26±0.31um²)和VE组(1.79±0.16um，2.53±0.48um²)(P＜0.05)。而这种差异在对照组和TA2或VE组之间更为显著(P＜0.01)。同时TA1组和TA2组的直径和面积也存在显著性差异(P＜0.05)。对照组MSG的平均灰度(92.04±13.24)比较TA1组(76.9±12.83)、TA2组(68.43±12.15)和VE组(69.03±15.71)有非常显著性差异(P＜0.01)。在TA1组和TA2组或VE组之间差异也具有非常显著性意义(P＜0.01)。TA2和VE组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。从MSG在不同灰度区的分布观察，对照组、TA1组、TA2组和VE组在低密度颗粒区所占的百分比分别为12.05％、36.52％、47.91％和44.65％，即治疗组在低密度区的颗粒数明显增多，相关分析显示，行为学参数的变化与MSG结构参数的变化并无统计学意义(P＞0.05)。

小结

一、透射电镜和Th-T荧光分析发现，茶多酚在体外能强烈地抑制Aβ的聚集和纤维形成，并具有剂量的依赖性。同时，它还能明显延迟Aβ老化的时间曲线中半高峰出现的时间(T_1/2)，表明它不仅可以抑制Aβ的扩布聚集，而且还能阻止或延迟Aβ的核化过程。此外，它还可促使成熟的Aβ纤维降解，具备清除淀粉的效应。其抑制Aβ纤维形成的能力大大强于VE。

二、FT-IR定量研究表明，茶多酚抑制Aβ纤维形成的机制在于它可阻止Aβ老化时β-折叠结构的形成，并促使β-折叠向自由卷曲和α-螺旋转化。

三、EPR的分析结果显示，Aβ在PBS中老化时可产生自由基，茶多酚具有强的清除Aβ肽自由基的能力，并将之转化为更稳定的半醌自由基。对EPR谱的线型特征观察表明，它有比VE更多的供氢位点，从而具有更强的抗氧化能力。

四、体内实验结果表明，茶多酚能有效地干预外源性Aβ在动物脑内的纤维形成。在以SAM-P₈为AD模型的研究中，茶多酚有意义地减小了SAM-P₈海马中用六胺银法所显示的Aβ样颗粒的聚集密度、直径和面积，并能显著改善SAM-P₈的学习记忆能力。

五、本实验结果表明，茶多酚对Aβ的作用包括以下方面：①清除体内的自由基，消除引起Aβ聚集的诱发因素；②与Aβ结合阻止其聚集和纤维化；③与Aβ肽自由基结合抑制Aβ的毒性作用；④降解已成熟的Aβ纤维，发挥清除淀粉的效应。因此茶多酚是实施以Aβ为靶治疗AD这一新的战略思想的理想的候药物。同时体内的实验也显示，茶多酚对Aβ样沉积的抑制作用及其改善SAM-P₈学习记忆的能力，进一步提示茶多酚可以通过干预Aβ纤维聚集、拮抗其神经毒性，达到治疗AD的效果。

Claims (5)

1、茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和β-淀粉样蛋白纤维形成的药物中的应用。

2、根据权利1所述茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和β-淀粉样蛋白纤维形成的药物中的应用，其特征在于茶多酚采用口服剂型。

3、根据权利1或2所述茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和β-淀粉样蛋白纤维形成的药物中的应用，其特征在于茶多酚与治疗老年性痴呆的西药复方制成复方制剂。

4、根据权利1或2所述茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和β-淀粉样蛋白纤维形成的药物中的应用，其特征在于茶多酚与治疗老年性痴呆的中药复方制成复方制剂。

5、茶多酚在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集和β-淀粉样蛋白纤维形成的保健食品中的应用，其特征在于茶多酚添加至食品中制成保健食品。