CN114814209A - 一种早产儿bpd早期诊断的预警检测标志物pmn-mdsc - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种早产儿BPD早期诊断的预警检测标志物PMN‑MDSC。发明人经过研究首次证实了BPD早产儿外周血中PMN‑MDSC的数量显著低于非BPD早产儿，且BPD早产儿来源的PMN‑MDSC对T细胞增殖的抑制作用明显较弱。因此，PMN‑MDSC可作为早产儿BPD的预警检测标志物，检测样本中PMN‑MDSC含量的试剂可用于辅助早产儿BPD的早期诊断。

Description

一种早产儿BPD早期诊断的预警检测标志物PMN-MDSC

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种早产儿BPD早期诊断的预警检测标志物PMN-MDSC。

背景技术

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）为新生儿危重病之一，对早产儿的氧依赖、早期死亡率和远期生存质量有较大影响。具体的病理表现为肺部发育受阻、肺部纤维组织增生，伴随各种严重的并发症。BPD的防治目前主要是综合性治疗措施，缺乏特异性的靶向治疗，治疗效果不甚理想。所以，明确BPD发生发展的高危因素，阐明其发病机制，进一步寻找预测BPD发生的分子标志物，探讨针对 BPD 病因和发病机制的治疗及可能性的靶向治疗很有必要。

髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是一群具有免疫抑制功能的未成熟细胞。早期研究表明，髓系细胞在肿瘤、感染、创伤等病理状态下会出现分化成熟障碍，而产生大量分化不成熟的髓系祖细胞和未成熟髓系细胞，这类细胞是免疫系统重要的负性调控元件之一，称为MDSC。MDSC可分为两种亚型，分别为粒细胞样MDSC(polymorphonuclear MDSC，PMN-MDSC)和单核细胞样MDSC（Monocytic MDSC，M-MDSC）。有研究表明MDSC在多种疾病如炎症和创伤、感染、癌症等的发病中起着重要作用。

目前尚缺乏可用于BPD早期诊断的分子标志物，且尚无MDSC与BPD之间相关性的报道。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种早产儿支气管肺发育不良早期诊断的预警检测标志物PMN-MDSC，所述PMN-MDSC在早产儿BPD患者外周血中的数量明显低于非BPD早产儿，可用于早产儿BPD的辅助诊断。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

人PMN-MDSC在制备检测早产儿支气管肺发育不良的试剂中的应用。

本发明还提供了检测人PMN-MDSC在生物样本中含量的试剂在制备早产儿支气管肺发育不良检测试剂盒中的应用。

在一些实施例中，所述早产儿为胎龄小于34周的早产儿。

在一些实施例中，所述人PMN-MDSC的流式细胞术分析标记为HLA-DR^-/lowCD11b⁺CD14^-CD15⁺。即HLA-DR阴性或低表达、CD11b阳性、CD14阴性和CD15阳性。

在一些实施例中，所述生物样本为外周血。

在一些实施例中，所述外周血的采集时间为胎儿出生后0~7天。

在优选的实施例中，所述外周血的采集时间为胎儿出生后3~7天。

本发明提供了一种早产儿支气管肺发育不良早期诊断的预警检测标志物PMN-MDSC，发明人经过研究首次证实了BPD早产儿外周血中PMN-MDSC的数量显著低于非BPD早产儿，且BPD早产儿来源的PMN-MDSC对T细胞增殖的抑制作用明显较弱。因此，PMN-MDSC可作为早产儿BPD的预警检测标志物，用于辅助早产儿BPD的早期诊断。检测样本中PMN-MDSC含量的试剂可作为早产儿BPD的辅助诊断试剂。

附图说明

图1为出生3-7d，胎龄<34w，无感染的BPD早产儿组与非BPD早产儿组新生儿外周血中MDSC数量的检测结果；其中，BPD代表BPD早产儿组；non-BPD代表非BPD早产儿组。

图2为出生8-14d，胎龄<34w，无感染的BPD 早产儿组与非BPD早产儿组新生儿外周血中MDSC数量的检测结果；其中，BPD代表BPD早产儿组；non-BPD代表非BPD早产儿组。

图3为CD4⁺T细胞和BPD早产儿、非BPD早产儿和非BPD足月儿来源的PMN-MDSC共培养的检测结果；其中，BPD -早产儿代表BPD早产儿组；non-BPD-早产儿代表非BPD早产儿组；non-BPD-足月儿代表非BPD足月儿组。

图4为CD8⁺T细胞和BPD早产儿、非BPD早产儿和非BPD足月儿来源的PMN-MDSC共培养的检测结果；其中，BPD -早产儿代表BPD早产儿组；non-BPD-早产儿代表非BPD早产儿组；non-BPD-足月儿代表非BPD足月儿组。

图5为Arg1、Nos2和Nox2在BPD早产儿与非BPD早产儿来源的PMN-MDSC中的表达量检测结果；其中，BPD代表BPD早产儿组；non-BPD代表非BPD早产儿组。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

本发明所述早产儿是指胎龄不满37周的活产婴儿。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

本实施例检测中BPD早产儿和非BPD早产儿外周血中MDSC的数量。

一、实验方法

1、临床样本收集及分析

收集于2019年8月至2020年12月在广州市6家三甲医院新生儿科出生的符合入选标准的早产儿，分为BPD早产儿组和非BPD早产儿组。采集两组新生儿的外周血，每例各0.5ml，取样时间点分别为生后3-7d和8-14d。

BPD诊断采用2001年NICHD诊断标准，注意：

A. 1天吸氧＞21%是指当天吸氧浓度＞21%且≥12小时；

B．吸氧不是指突然短暂的措施，而是反映日常的治疗，从判断时间点前几天便开始的吸氧。

具体如表1所示：

表1 诊断标准

排除标准包括：有复杂型先天性心脏病（PDA、ASD、VSD、PPHN）、严重先天性畸形、染色体异常、遗传代谢病、感染及资料不完整者。

根据上述标准，BPD早产儿组纳入5例。由于本研究中几乎所有的BPD患儿胎龄均小于 34 周，因此，我们对BPD组和胎龄小于 34 周的非BPD组早产儿对照组进行了统计分析。

2、流式细胞术检测外周血样本中MDSC的数量

从外周血样本中分离获得PBMC，将1×10⁶ 个PBMC装入5mL 流式管中。加入4mL 1×PBS混匀，4300 rpm/min离心5分钟，弃上清。抗体按照1:400的比例用PBS稀释，每一个标本用的抗体稀释液为100μL。振荡流式管并均匀混合后，在4 ℃冰箱中避光染色30分钟，然后加入4 mL 1×PBS混匀，4300 rpm/min离心5分钟，弃上清。每管加入500μL 1×PBS将细胞悬浮，用流式细胞仪检测。

3、统计学分析

所有数据利用统计学软件GraphPad Prism version5.0a和SPSS 22.0进行统计分析。采用均数t检验，统计结果以均数±标准差表示。所有检验中，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

二、实验结果

如图1所示，在明确早产儿无任何感染的前提下，出生 3-7d，胎龄<34w的BPD早产儿外周血 PMN-MDSC（CD11b⁺HLA-DR^-CD14^- CD15⁺）与非BPD早产儿（出生3-7d，胎龄<34w，无感染）外周血中PMN-MDSC相比，其比例明显下降，有统计学差异（P < 0.05）；而BPD患儿外周血CD15⁺LOX-1⁺以及M-MDSC (CD11b⁺HLA-DR^-CD14⁺CD15^-) 的比例与对照组相比有下降趋势，但未达统计学意义。结果提示PMN-MDSC可能与早产儿BPD 的发生发展存在某种相关性，猜测可能是由于PMN-MDSC数量的减少导致其免疫功能受到抑制。

并且，发明人还发现，出生8-14d，胎龄<34w，无感染的情况下，非BPD早产儿和BPD早产儿外周血中PMN-MDSC（CD11b⁺HLA-DR^-CD14^-CD15⁺）、CD15⁺LOX-1⁺和M-MDSC（CD11b⁺HLA-DR^-CD14⁺CD15^-）的比例相比，差异无统计学意义（P＞0.05），结果如图2所示。这可能与MDSC在新生儿生后10天左右会迅速下降有关。

实施例2

本实施例分析BPD早产儿外周血PMN-MDSC的功能。为了明确在BPD早产儿组患儿中PMN-MDSC的免疫抑制功能是否存在缺陷，我们对两组患儿外周血中的PMN-MDSC进行了功能分析，并分选足月未发生BPD新生儿的PMN-MDSC作为对照。分选BPD早产儿、非BPD早产儿和足月未发生BPD新生儿的外周血PMN-MDSC与CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞进行共培养，利用流式细胞术检测PMN-MDSC对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞增殖的作用。

一、实验方法

1、流式分选BPD早产儿、非BPD早产儿和足月未发生BPD新生儿的外周血PMN-MDSC。

在无菌条件下，将需要分选的细胞，进行流式染色。调整染色后的细胞浓度为5~10million/ml，进入流式分选。使用流式细胞术检测PMN-MDSC 和CD3⁺T细胞比例，并通过流式细胞仪分选得到PMN-MDSC和CD3⁺T细胞。分选获得的PMN-MDSC和CD3⁺T细胞用3 mL 50% FBS完全RPMI 1640培养基处理好置于冰上，待下步应用。

2、PMN-MDSC和T细胞共培养

（1）用无菌PBS（含0.1%BSA）配制2.5 mM的CFSE储存液。

（2）利用37℃预热的含0.1%BSA的无菌PBS重悬无菌分选的CD3⁺T细胞，并调节细胞浓度至l×10⁶/mL。

（3）在细胞悬液中加入4 μL的CFSE储存液（2.5 mM），使CFSE终浓度达1uM。

（4）然后37℃孵育15min，加入5倍体积预冷的培养基后，在冰上放置5min以终止染色。随后以3000 rpm/min离心共5min。

（5）调整细胞浓度至1.75 million/mL，待用。

（6）将流式分选得到的BPD早产儿来源的PMN-MDSC、非BPD早产儿来源的 PMN-MDSC以及足月未发生BPD新生儿来源的PMN-MDSC，均调整细胞浓度至1.75million/ml。将CD3⁺T细胞与PMN-MDSC以8: 1、4: 1和2: 1的进行共培养至U底96孔板内，0.35 million/孔。实验组孔内含anti-CD3 coated (5 μg/ml)和anti-CD28 (2 μg/ml)，每组设1个复孔。培养3天后收集细胞，进行CD4⁺和CD8⁺ T细胞染色，流式分析T细胞增殖情况，FITC通道检测CFSE。

二、实验结果

如图3所示，无论是何种比例，当 CD4⁺T细胞和PMN-MDSC共培养时，BPD早产儿组的CD4⁺T细胞增殖均显著高于非BPD足月儿组（P < 0.01）。同样，以4:1及8:1的比例共培养，当CD4⁺T细胞和PMN-MDSC共培养时，BPD早产儿组的CD4⁺T细胞增殖显著高于非BPD早产儿组（P<0.05）；当CD4⁺T细胞和PMN-MDSC以2:1的比例共培养时，BPD早产儿组的CD4⁺T细胞增殖显著高于非BPD早产儿组（P< 0.01）。由此看出，各组新生儿外周血的PMN-MDSC对CD4⁺T细胞增殖均有抑制作用，相比于非BPD的早产儿及足月儿来源的PMN-MDSC，BPD早产儿来源的PMN-MDSC对CD4⁺T细胞增殖有抑制作用，但是抑制作用明显较弱，与其流式表型比例降低相一致。

如图4所示，当CD8⁺T细胞和PMN-MDSC以8:1的比例共培养时，BPD早产儿组的 CD8⁺T细胞增殖显著高于非BPD足月儿组（P < 0.05）；当CD8⁺T细胞和PMN-MDSC以4:1 的比例共培养时，BPD早产儿组的CD8⁺T细胞增殖显著高于非BPD足月儿组（P< 0.01）；当CD8⁺T细胞和PMN-MDSC以2:1比例共培养时，BPD早产儿组的CD8⁺T细胞增殖显著高于非BPD足月儿组（P <0.01）；当CD8⁺T细胞和PMN-MDSC以8:1比例共培养时，BPD早产儿组的CD8⁺T细胞增殖虽高于非BPD早产儿组，但未达统计学意义（P ＞ 0.05）；当CD8⁺T细胞和PMN-MDSC以4:1比例共培养时，BPD早产儿组的CD8⁺T细胞增殖虽高于非BPD早产儿组，但未达统计学意义（P＞0.05）；当CD8⁺T细胞和PMN-MDSC以2:1比例共培养时，BPD早产儿组的CD8⁺T细胞增殖显著高于非BPD早产儿组（P<0.05）。由此看出，各组新生儿外周血的PMN-MDSC对CD8⁺T细胞增殖均有抑制作用，但相比于非BPD早产儿及足月儿来源的PMN-MDSC，BPD早产儿来源的PMN-MDSC对CD8⁺T细胞增殖的抑制作用明显较弱，与其流式表型比例降低相一致。

上述结果提示，BPD早产儿来源的PMN-MDSC不但数量下降，而且对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞增殖的抑制作用也明显减弱了。

实施例3

与MDSC免疫抑制功能相关分子的筛选与验证。

取BPD组早产儿和非BPD组早产儿各3例，用QT-PCR检测与MDSC免疫抑制功能相关的三个经典分子的表达，包括精氨酸酶 1（Arg1）、诱导型一氧化氮合酶(Nos2或称iNos)和NADPH氧化酶 (Nox2)。

一、实验方法

首先进行MDSC细胞的流式分选，获得表型及免疫抑制功能有差异的PMN-MDSC，用预冷PBS洗2遍之后，加入1mL Trizol，将细胞悬液转移至1.5 mL无RNA酶的EP管，放-80℃冰箱保存备用。

（1）将细胞离心控干后，加入1ml Trizol；用胰岛素注射器反复抽吸10次以上，加200ul 氯仿剧烈震荡数分钟后，静置3min；

（2）4℃，12000g，离心15min；

（3）吸取上清水相（约 500ul）至新的RNase-free EP管，加入50ul 2M NaCl,2-5ulGlycogen (20mg/ml)，再加入550ul异丙醇，颠倒混匀，RT静置10min，或- 80℃放置1h或更长时间；

（4）4℃，12000g，离心 10min；

（5）弃上清，加入1ml 75%乙醇，涡旋混匀后，4℃，7500g，离心5min；

（6）彻底弃上清，开盖干燥10-15min，加入适量 RNase-free H₂O，溶解RNA，涡旋混匀；

（7）冰上放置10-30min后，确定RNA浓度、纯度和完整性。

（8）处理好的RNA放置-80℃以待下一步使用。

2、反转录

（1）去DNA：体系如表2，然后在42℃条件下反应2 min；

表2 反应体系

（2）反转录反应：随后加入反转录酶体系（表3），冰上操作：

表3 反应体系

37℃条件下反应15 min，85℃下反应5 s，然后4℃保温，合成的cDNA可在-20℃冰箱长期保存备用。

2、荧光定量PCR检测

反应体系为：cDNA 3μl，SYBR®Premix Ex TaqTM II取10μl，上下游引物各0.5μM，ddH₂O 定容至20μl，具体见表4。接下来进行三步扩增反应，条件如下：第一步：95℃变性10分钟（1个循环）；第二步：在95℃变性15秒；在60℃退火30秒；延伸72℃ 30秒（40 个周期）；第三步：融解曲线分析是否存在溶解曲线双峰或异常扩增图。根据实验需要计算基因表达量。

表4 反应体系

检测内参为β-actin，针对β-actin的特异性检测引物包括如SEQ ID NO. 1所示的正向引物和如SEQ ID NO. 2所示的反向引物；针对Arg1的特异性检测引物包括如SEQ IDNO. 3所示的正向引物和如SEQ ID NO. 4所示的反向引物；针对Nos2 的特异性检测引物包括如SEQ ID NO. 5所示的正向引物和如SEQ ID NO. 6所示的反向引物；针对Nox2的特异性检测引物包括如SEQ ID NO. 7所示的正向引物和如SEQ ID NO. 8所示的反向引物。具体序列如表5所示：

表5 引物序列信息

二、实验结果

结果如图5所示，Arg1与Nos2在BPD早产儿PMN-MDSC中的表达与非BPD（non-BPD）早产儿来源的PMN-MDSC相比无显著差异。而Nox2在BPD早产儿PMN-MDSC中的表达显著低于非BPD（non-BPD）早产儿来源的PMN-MDSC（P < 0.05），表明在BPD早产儿中 PMN-MDSC的免疫抑制功能存在一定的缺陷，这个缺陷表现在Nox2的低表达。说明在早产儿BPD的发病中，PMN-MDSC可能主要是通过ROS途径抑制T细胞的功能，从而发挥免疫抑制作用。

综上所述，BPD早产儿外周血中PMN-MDSC数量显著低于非BPD早产儿，可作为早产儿BPD的早期预警诊断标志物，检测外周血中PMN-MDSC数量的试剂可作为早产儿BPD检测试剂，用于早产儿BPD的辅助诊断。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> 一种早产儿BPD早期诊断的预警检测标志物PMN-MDSC

<130> 2022-04-19

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgcgtgac atcaaagaga ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttgccaat agtgatgacc tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctccaagcca aagtccttag ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggagctgtc attagggaca tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccttggaa gaggagcaac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaggccaaac acagcatacc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aactgggctg tgaatgaagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagtgctgac ccaaggagtt 20

Claims (7)

1.人PMN-MDSC在制备检测早产儿支气管肺发育不良的试剂中的应用。

2.检测人PMN-MDSC在生物样本中含量的试剂在制备早产儿支气管肺发育不良检测试剂盒中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述早产儿为胎龄小于34周的早产儿。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述人PMN-MDSC的流式细胞术分析标记为HLA-DR^-/lowCD11b⁺CD14^-CD15⁺。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物样本为外周血。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外周血的采集时间为胎儿出生后0~7天。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述外周血的采集时间为胎儿出生后3~7天。

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